真核基因表达系统资料
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真核生物的基因表达调控
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• 锌指结构域The zinc finger domain
锌指结构有2种形式： C2H2 zinc finger和C4 zinc finger •C2H2 zinc finger：由12个氨基酸组成的环，通过2个半胱氨 酸（C，Cys）和2个组氨酸（H，His）残基固定，这4个残基 与Zn2+在空间上形成一个四面体结构。 一般情况下需要3个 或更多的C2H2型锌指才能与DNA结合，如在TFIIA有9个重复， 转录因子SP1有3个重复。 •C4 zinc finger： Zn2+与4个半胱氨酸（C，Cys）结合，存 在于类固醇激素受体转录因子中。
限定于结构域之内。
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反式作用因子的结构与功能
（1）概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开 放（正调控）或关闭（负调控）。
（2）通用或基本转录因子—RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。如：TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE 等。 （3）特异转录因子( special transcription factors)—个别 基因转录所必需的转录因子.如：OCT-2：在淋巴细胞中特 异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。
(2) 动态模型（dynamic model）：认为转录因子与组 蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经 历结构上的改变，即染色质重塑。在染色质重塑过 程中，某些转录因子可以在结合DNA的同时使核小 体解体。
6
组蛋白的乙酰化-去乙酰化 蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种 重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质 结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因， 增强或抑制某些基因的表达。 组蛋白的8个亚基上有32个潜在的乙酰化位点。组 蛋白的乙酰化过程由组蛋白乙酰转移酶催化完成。
真核生物基因表达调控
酸性激活域 (D/E-rich) 谷氨酰胺(Q)富含域 脯氨酸(P)富含域
蛋白质-蛋白质结合域 （dimerization, co-factors）
1） TF最常见的DNA binding domain
Zinc Finger
bZIP
Homeodomain
bHLH
(1) 锌指(zinc finger)
2. The pri5’ capping 3’ formation / polyA splicing
3. Mature transcripts are transported to the cytoplasm for translation
Chromatin
epigenetic control
Protein degradation RNA silencing
一般而言的基因表达调控范畴
二、基因表达的时间性及空间性
（一）时间特异性
按功能需要，某一特定基因的表达严格按 特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间 特异性(temporal specificity)。
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His C-terminal: α-helix binding DNA
常结合GC box
(2) 碱性亮氨酸拉链 bZIP
(3) 碱性螺旋-环-螺旋bHLH
bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)
2） TF常见的trans-activation domain
– usually expressed at high level – the level of their gene expression may vary
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
12.02.2020
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
12.02.2020
6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
19
（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
12.02.2020
20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
12.02.2020
6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
19
（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
12.02.2020
20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
原核生物真核生物基因表达比较
08
40s小亚基首先与Met-tRNA(Met上角标）相结合
09
再与模板mRNA结合
10
最后与60s大亚基结合生成起始复合物
肽链合成起始:
原核生物肽链合成的延长：
进位: 氨基酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核蛋白体A位 2. 成肽:转肽酶催化，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA转移到A位，与A位上氨基酰-tRNA的α-氨基结合形成肽键 3. 转位转位酶催化，核蛋白体向3´-端移动一个密码子的距离，使mRNA上下一个密码子进入核蛋白体A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位 延长因子: EF-Tu EF-Ts EF-G
真核生物：转录起始需要启动子 、RNA聚合酶和转录因子的参与。 少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录 真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物。
转录延长：
转录终止：
依赖ρ因子的转录终止 非依赖ρ因子的转录终止 Ρ因子
真核生物的转录终止：在超出千百个核苷酸后停顿， 转录后修饰有多聚腺苷酸（poly A）尾巴结构加进去 。在读码框架下游常有一组公共序列AATAAA 及 GTGTGT序列，这些序列称为转录终止修饰点。
真核延长过程与原核基本相似 但有不同的反应体系和延长因子：eEF-1α eEF-1βγ eEF-2 真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落
核蛋白体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离。
原核生物终止阶段需要释放因子RF-1、 RF-2和 RF-3参与
核蛋白体包括 rRNA(核糖体RNA) 和蛋白质，直径为 20-25nm,真核细胞的核蛋白体比原核细胞的大。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
2020年8月10日星期一
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（3）选择标记
18
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
2020年8月10日星期一
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
真核生物基因表达
真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控（一）染色质结构与功能：常染色质（euchromatin）：，对DNase I敏感，DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断；基因表达处于活性状态。
异染色质（heterochromatin）：结构高度致密处于凝聚状态的染色质，对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质：所有细胞，整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因，因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质（facultative heterochromatin）：在特定细胞，生长发育的特定阶段，由常染色质凝聚转变成的异染色质。
（二）染色质重塑：染色质重塑（chromatin remodeling）：与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有：核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑：（nucleosome remodeling）核小体重塑：ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程：基因活化蛋白结合；ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区；ATP依赖性酶水解A TP，提供能量；移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化：常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列，即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶：组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase HDAC）修饰位点：核心组蛋白外周结构域，氨基末端Lys残基的NH3。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
讲第八章真核基因的表达调控(讲稿)
（2）由两条同源染色体组成， 在交叉处结合，每条同源染色 体含2条染色单体。
（3）轴上有一些染色粒，代 表染色质紧密螺旋化的部位。 同时两条染色单体向两边伸出 许多侧环，侧环是RNA活跃转 录的区域。
29
2、基因扩增
定义：是某基因的拷贝数专一性大量增加的现 象，可短时间内产生大量基因产物满足生长需 要。基因活性调控的一种方式。
同的剪接方式形成不同mRNA。
23
PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
1663nt 1773nt
图 18-57 小鼠淀粉酶(amy) 基因利用不同启动子产生两个不同的 mRNA
24
三、真核生物DNA水平上的基因表达调控
1、染色质结构对转录的影响 2、基因扩增 3、基因重排与变换—免疫球蛋白 4、DNA甲基化与基因活性的调控
25
1、染色质结构对转录的影响
在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形 态不均匀。根据其形态及染色特点可分为 常染色质和异染色质两种类型。
常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于 伸展状态，碱性染料染色时着色浅。
47
PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
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（3）轴上有一些染色粒，代 表染色质紧密螺旋化的部位。 同时两条染色单体向两边伸出 许多侧环，侧环是RNA活跃转 录的区域。
29
2、基因扩增
定义：是某基因的拷贝数专一性大量增加的现 象，可短时间内产生大量基因产物满足生长需 要。基因活性调控的一种方式。
同的剪接方式形成不同mRNA。
23
PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
1663nt 1773nt
图 18-57 小鼠淀粉酶(amy) 基因利用不同启动子产生两个不同的 mRNA
24
三、真核生物DNA水平上的基因表达调控
1、染色质结构对转录的影响 2、基因扩增 3、基因重排与变换—免疫球蛋白 4、DNA甲基化与基因活性的调控
25
1、染色质结构对转录的影响
在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形 态不均匀。根据其形态及染色特点可分为 常染色质和异染色质两种类型。
常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于 伸展状态，碱性染料染色时着色浅。
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PS
DNA
初始转录本： 在唾腺中转录
外显子 S
PL 外显子 L
外显子 2 外显子 3
50b 2800bp
161bp 4500bp 205bp 327bp
初始转录本： 在肝中转录
成熟 mRNA： 成熟 mRNA：
1663nt 1773nt
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四）外源基因在酵母菌中的表达
1、胞内表达：直接表达外源基因，
如：HBsAg的酵母重组疫苗
2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，
pGAPZ,利用因子分泌表达
五）高表达的策略
（ 1 ）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能 力强的GAP启动子
（ 2 ）提高整合拷贝数： 可利用载体中提供的抗生素遗传标记， 以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （ 3 ）控制蛋白酶降解活性 ： 采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变 发酵培养基的 PH 值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均 可避免产物被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。
Octamer
GGCCAATCT
ATTTGCAT
CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Oct-1 Oct-2 76,000 53,000 ~ 20bp ~ 23bp ~ 10bp 20bp
kB ATF
GGGACTTTCC GTGACGT
NFkB 44,000 AFT ?
增强子(enhancer) • 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件
（2）反式作用因子(trans-acting factor)
由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控
元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转
录活性。
P
Trans-acting factor
DNA
转录信号1
Trans-acting factor (DNA结合蛋白）
受体细胞
据受体细胞及表达载体的不同分为3种：
• 酵母表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统 • 昆虫细胞表达系统
一、酵母表达系统
• 发酵简单、快速、便宜
• 真核生物，有翻译后修饰功能
• 可分泌表达，简化了纯化工艺
• 受体细胞安全
（一）酵母载体:
1、概念：
携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增
和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。
1、转录前水平(基因组水平) ： gene level 2、转录水平调控: transcription level
3、转录后调控: posttranscription level
4、翻译水平的调控: translation level 5、翻译后修饰: post-translation modification
• 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) 克隆大片段DNA， 2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，
可以独立复制并转录。
（1）酵母克隆载体的构建
• 酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染 色体，转化子稳定，但转化率极低。
1、转录前水平(基因组水平)： gene level
基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋 白修饰，DNA甲基化等
2. 转录水平调控
顺式调控元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
（1 ）顺式调控元件(cis-acting element)
酵母 复制 序列
（2）酵母表达载体
• 特点：含酵母启动子
穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外 源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细 胞中表达的载体。 • 种类：啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体：
分泌型表达载体
非分泌型表达
啤酒酵母表达载体
毕赤酵母表达载体------整合型
• 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性 • 无方向性（序列、位置） • 远距离作用（1-4kB）
构建载体
• 无基因特异性
• 具组织特异性
沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式
与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加 尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成
(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA
由下列元件组成 酵母染色体 2umDNA的复制起始区 着丝粒序列（CEN) 四膜虫端粒DNA(TEL)
• YAC: 利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列 （ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体 • 结构： 左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN 右臂：TEL、选择标记 • 特点：容量大（50-100replicable plasmid, YRp) 细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS), 可自主复制，但稳定性差 • 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因 (YIp)+酵母2μ M质粒，游离于核外存在并自主复制
酵母2μM质粒
真核启动子结构模式图
上游启动子元件
核心启动子元件
哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件
元件名称 TATA box GC box 共同序列 TATAAAA GGGCGG 名称 TBP SP-1 结合的蛋白因子 分子量 结合DNA长度 ~ 10bp ~ 20bp
30,000 105,000
CAAT box
Features of Eukaryotic gene structure and expression
（一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面
（二）真核基因表达的调控模式
真核基因表达的调控模式
( The regulatiБайду номын сангаасg model of eukaryotic gene expression)
酵母表达系统(yeast expression system)
哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)
昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性
二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
一、真核基因组的复杂性
1. 真核基因组巨大
大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量 级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
2、组成元件：遗传标记
调控序列
1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定 营养标记基因：亮氨酸（Leu）
抗生素选择标记基因：Zeocin
2）调控序列
• ARS：酵母复制起始区(点)
• 酵母启动子：常用的有:
PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶)
二）受体细胞 1.啤酒酵母：
较早使用，了解清楚
安全性高，被FDA确认为安全生物
表达量较低
过量糖基化
转化子不稳定，易发生质粒丢失
2. 毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞
• 高表达（12g/L）
• 高稳定-----载体为整合型
• 高分泌（10g/L）
三）转化
1. 原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切 线性化 3. LiCl法：做成感受态细胞
Cis-acting factor
B gene
A gene
mRNA of A Protein A
mRNA of B Protein B
3、转录后的修饰
• 内含子的剪接
• 外显子的拼接 • mRNA的加尾和加帽
• mRNA的稳定性
4、翻译水平的调控
主要是microRNA对mRNA、tRNA 和 rRNA的调控
二、 原核表达系统的局限性
1、没有转录后的剪接和加工系统
2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基 化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白 的活性。
3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定
易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易 出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低
5、翻译后的调控
• • • • • •
切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解
第三节 真核表达系统
组成： 真核表达载体 受体细胞
真核表达载体
适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体根据受体不同，又可分为几种：
• 酵母表达载体
• 哺乳动物细胞表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
酵母双杂交系统
Yeast Two-Hybrid System
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母 双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实 验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相 互作用对真核基因转录调控影响的实验。
结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： • 起正性调节作用：启动子、增强子 • 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号
启动子
位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离 作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括