高效液相色谱法测定饲料中那西肽A

高效液相色谱法测定饲料中那西肽A林仙军;陆春波;包爱情;王彬【摘要】为建立高效液相色谱测定饲料中那西肽A的方法,根据饲料样品多样性的特点,采用乙二胺四乙酸二钠溶液和N,N-二甲基甲酰胺超声提取饲料中的那西肽A.采用C18色谱柱,0.02％磷酸溶液+乙腈(60:40,V/V)为流动相,流速为1.0 mL/min,荧光检测器激发波长为327 nm,发射波长为521 nm.那西肽A在浓度0.02～10μg/mL时线性良好,线性相关系数为0.9999.当添加浓度为0.5～500 mg/kg时,平均回收率为81.6％～95.6％,相对标准偏差(RSD)为1.6％～9.2％.方法的检测限为0.2 mg/kg,定量限为0.5 mg/kg.该方法操作简便、结果准确、稳定性好,应用于实际样品检测,结果满意,表明该方法适用于饲料中那西肽A的测定.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)013【总页数】6页(P54-59)【关键词】那西肽A;荧光检测器;饲料;前处理;高效液相色谱法【作者】林仙军;陆春波;包爱情;王彬【作者单位】浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州 311100;浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州 311100;浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州 311100;浙江省兽药饲料监察所,浙江杭州 311100【正文语种】中文【中图分类】S816.17那西肽（Nosiheptide）为浅黄绿褐色或黄绿褐色粉末，是一种带有5个噻唑环的含硫多肽类抗生素（孙小青，2007）其分子式为C51H43N13O12S6，相对分子质量1222.36。

那西肽能促进猪（沈顺新，2008）、鸡生长（Cromwell，1984），提高饲料效率（Benazet，1980a、b）。

按那西肽 A计算，混饲每1000 kg饲料，猪2.5～20 g，鸡2.5 g（Yu，2009），广泛应用于畜牧业生产中（Jiang，2015）。

饲料中添加浓度较低的那西肽即能促进畜禽生长（Niu，2011），提高饲料效率（Wojtas，2016；Wang，2014；Pascal，1979）。

农牧函〔1998〕7号批准那西肽及那西肽预混剂为国家三类新兽药。

农业部第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》将那西肽列为可在饲料中长时间添加使用的饲料药物添加剂。

农业部公告第942号、第1204号、第1923号、第1960号和第2382号都涉及那西肽和那西肽预混剂的使用范围、规格和检测方法等内容。

目前，那西肽的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法（DB 34/T 1371-2011）、高效液相色谱紫外检测法（张秀英，2013；段红，2012；翟卫红，2011）、高效液相色谱荧光检测法（林仙军，2017；Horii，2000）和微生物检定法等。

微生物检定法检测成本低，操作较为简便，一直是经典的那西肽含量的检测方法，目前《兽药国家标准》（化学药品、中药卷）第一册（农业部公告1960号）仍然使用此法检测。

但由于微生物检定法灵敏度较差，检测周期长，不适宜批量检测，满足不了饲料中那西肽检测需要。

高效液相色谱法因其选择性好、灵敏度高、速度快等优点，是现阶段比较理想的选择。

农业部公告第2382号，发布的那西肽发酵液干燥品配制的那西肽预混剂质量标准中规定，采用高效液相色谱紫外检测法测定那西肽组分，其中就明确指出那西肽的出峰顺序为那西肽组分B、那西肽组分A，按峰面积归一化法计算，那西肽组分A的峰面积不得少于那西肽组分A和那西肽组分B峰面积之和的88.0%。

因此，那西肽A是主峰，本检测方法只研究那西肽A。

由于那西肽在饲料中的添加量较低，因此，为了准确测定饲料中那西肽的含量，我们前期研究的高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的那西肽，方法操作简便，灵敏度高。

但是，由于饲料基质复杂，针对个别饲料存在加标回收率不理想的情况，主要针对饲料中那西肽A测定的前处理方法和干扰因素等进行了深入研究。

通过实验得到了适用性更广的前处理方法。

配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料检测限为0.2 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。

1 材料与方法1.1 试剂与仪器那西肽对照品购自中国兽医药品监察所，批号为 K0431212，按C51H43N13O12S6计，含量88.6%，每1mg相当于928那西肽单位；乙腈、甲醇和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等为色谱纯；乙二胺四乙酸二钠、乙醇、丙酮、三氯甲烷和磷酸氢二钠等为分析纯；实验用水为milli-Q超纯水。

Waters 2695-2475高效液相色谱仪（配Empower 2软件）；梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）XS-205 电子天平（精度为 0.01 mg）；上海民桥精密科学仪器有限公司SL502 N电子天平（精度 0.01 g）；德国 Sigma公司 Sigma3k30型冷冻离心机；昆山市超声仪器有限公司KQ-500E型超声波清洗器。

1.2 样品处理称取配合饲料、浓缩饲料或添加剂预混合饲料2 g，精确至0.01 g，于50 mL离心管中，加入乙二胺四乙酸二钠溶液1.0 mL，再加入N，N-二甲基甲酰胺19.0 mL，振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；取出，于10000 r/min离心5 min，过0.45μm有机滤膜，上机测定。

1.3 液相色谱参考条件色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；荧光检测条件为激发波长327 nm，发射波长521 nm；流动相为0.02%磷酸溶液+乙腈（60∶40，V/V）；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量为20μL。

1.4 线性相关实验准确称取那西肽对照品适量，置于棕色容量瓶中，用适量DMF 溶解，定容，摇匀，为标准储备液。

准确吸取适量体积的标准储备液，用DMF稀释成含那西肽为0.02、0.05、0.1、0.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的标准系列工作液。

每个浓度进样2次，标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析2.1 样品前处理的优化2.1.1 提取溶剂的选择那西肽在水、乙醇、丙酮和三氯甲烷中不溶或微溶，在乙腈和DMF中溶解。

取空白鸡配合饲料2.0 g，添加那西肽，使其添加浓度分别为0.5、2.0、5.0、10.0 mg/kg 和 50.0 mg/kg，分别加乙腈和DMF提取。

结果两种溶剂对于添加浓度不大于10 mg/kg的提取效果基本一致，回收率均在90%以上；对于添加浓度大于10 mg/kg的提取，DMF提取效果远好于乙腈；当浓度为50 mg/kg时，乙腈提取的回收率只有60%左右。

可能的原因是DMF对那西肽的溶解性较乙腈相对较大。

因此，选用DMF为提取剂，可达到充分提取的目的。

2.1.2 提取溶剂体积的选择以DMF作为提取溶剂，实验了以下几种提取方法，10 mL+10 mL、20 mL+20 mL和20 mL。

结果回收率均在90%以上。

由于饲料本身占一定的体积，DMF不能浓缩，2次提取会导致定量不准确的问题。

因此，为了准确定量，便于操作，最后选择20 mL一次提取的方案。

提取方法简单、快速。

2.1.3 初步确定的前处理方法及结果称取配合饲料、浓缩饲料或添加剂预混合饲料2 g，精确至0.01 g，于 50 mL 离心管中，加入 DMF 20.0 mL，振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；离心，过膜，测定。

初步确定的前处理方法，对于少量随机抽取的样品，回收率结果较好。

但加大样本数量，发现配合饲料回收率符合要求，浓缩饲料和添加剂预混合饲料有个别样本回收率低。

推测可能是饲料中金属离子浓度太高，导致那西肽降解。

后面进行了模拟实验，添加高浓度的铜、钙和镁等离子，最后，排除了这种推测。

2.1.4 前处理方法的改进称取回收率较低的浓缩饲料C、添加剂预混合饲料D和E 进行实验，取2.0 g，精确至0.01 g，于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，再加入DMF。

具体操作方法见表1。

振摇使样品完全分散、浸湿，置超声波清洗器中超声提取5 min，中间摇匀3次；取出，于10000r/min离心 5 min，过0.45μm有机滤膜，上机测定。

加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF提取体积对回收率的影响结果见图1。

表1 乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF提取体m积L代号乙二胺四乙酸二钠溶液体积 DMF体积1 0.0 20.0 2 1.0 19.0 3 2.0 18.0 4 3.0 17.0 5 4.0 16.0 6 5.0 15.0图1 乙二胺四乙酸二钠溶液和DMF对回收率的影响2.2 荧光检测条件的确定目前，国内外文献报道液相色谱法测定那西肽的方法中，检测器包括紫外检测器和荧光检测器两种。

紫外检测器的波长包括330 nm（翟卫红，2011）和241 nm（段红，2012），实验中发现检测灵敏度低，杂质干扰比较严重，不能满足检测。

本文参考文献中的方法（林仙军，2017；Horii，2000），采用荧光检测器进行检测。

将仪器的激发波长设定为200nm，发射波长扫描范围暂设定为210～800nm，发现发射波长在521 nm处有最大吸收；将521 nm的波长作为发射波长固定下来，再做激发波长的扫描，激发波长的范围要小于发射波长，发现激发波长在327 nm处有最大吸收。

因此确定荧光检测条件为激发波长327 nm、发射波长521 nm。

2.3 色谱柱的选择研究了不同色谱柱作为分离柱的效果，分别对Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱、Waters Atlantis C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）柱、Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）柱等 3 种规格的色谱柱进行了比较，结果表明分离结果均较为满意。

2.4 流动相的选择在流动相选择上，比较了磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈体系的色谱保留性能和灵敏度，结果发现磷酸溶液/乙腈流动相体系的那西肽峰型最好、灵敏度最高。

通过进一步优化磷酸溶液浓度和流动相配比，使那西肽获得最佳峰型和保留时间，最终确定流动相为 0.02%磷酸溶液/乙腈为（60∶40，V/V），流速为1.0 mL/min。

2.5 线性考察、检测限和定量限取配制的标准系列工作溶液进样检测，以峰面积Y 对浓度X（μg/mL）作标准曲线，以那西肽A峰得出回归方程为 Y＝6.6176×105X-2.9747×104，相关系数 R2为0.9999，那西肽A在0.02～10.0μg/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系。