项目五对流免疫电泳试验
对流免疫电泳
波片上，制成厚薄均匀的琼脂板
• 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器打孔
• 加样：加样量以孔满为宜，但不可溢出孔外
• 电泳：琼脂板放入电泳槽类，抗原端接负极电泳，抗
体端接正极。按电泳强度4~6V/cm（两端电压约100V）
电泳50 min左右
结 果
_ 1 5 3 7
100 V
+
_
+ 1 5 3 7
2
6
4
8
向正极泳动。
如抗原与相应抗体相遇，在比例适当时即形成白色
沉淀线
原 理
电渗力 电泳力
材 料
• 抗原：人血清 • 抗体：抗人血清 • 巴比妥缓冲液（0.05 mol/L, PH 8.6）、1.5%巴比妥 缓冲离子琼脂 • 其他：电泳仪、琼脂板打孔器、载玻片、毛细吸管
等
方 法
• 制板：取4 ml 煮沸的1. 5％ 巴比妥琼脂，立即浇注在
实验室规则
1. 一般规则
2. 实验室安全：
有毒有害的化学药品，同位素Байду номын сангаас病原微生物， 实验动物；
水电安全，防火防盗。
对流免疫电泳
(Counter immunoelectrophoresis,CIEP)
原 理
在PH8.6缓冲液琼脂中电泳，抗原、抗体带负电， 由于电泳力的作用，向正极泳动。同时电场中存在电渗 力，使抗原、抗体向负极泳动。 抗体等电点较高，分子量大，电泳力小于电渗力， 向负极泳动。 抗原等电点较低，分子量小，电泳力大于电渗力，
50 min
2
6
4
8
注意事项
1．抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均 不能出现明显可见的沉淀线。 2．特异性对照鉴定 为了排除假阳性反应，则在待检抗 原孔的邻近并列一阳性抗原孔，若待检样品中的抗原与 抗体所形成的沉淀线和阳性抗原抗体沉淀线完全融合时， 则待检样品中所含的抗原为特异性抗原。 3．当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时， 则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电 泳来检查。
对流免疫电泳
对流免疫电泳概述对流免疫电泳（convection-enhanced immunoelectrophoresis，CEIE）是一种以免疫电泳技术为基础的新型免疫分析技术，也称作免疫对流电泳。
该技术利用特定的对流流动作用，使电泳操作更加稳定和方便，并能够大幅提高样品的灵敏度和准确性。
同时，对流免疫电泳也逐渐被应用于多项临床和实验室检测任务中。
原理对流免疫电泳是一种以聚丙烯凝胶为基质，将试验物聚焦于水平位移平衡的技术。
在试验过程中，聚丙烯凝胶中的样品水平运动会被一个垂直方向的空气流覆盖，形成对流效应，从而使凝胶样品的水平位移保持平衡。
该对流效应可以削减因重力差异而导致的样品层析效应，使得电泳分离更为稳定和准确。
此外，对流免疫电泳还采用一些辅助技术以增强其灵敏度。
例如，将电泳板倾斜，或者增加凝胶浓度都可以提高对流免疫电泳的敏感度。
这些辅助技术都能帮助样品快速进入凝胶中，并且更快速地与抗体结合。
应用对流免疫电泳在临床检测中已经得到了广泛的应用。
例如，对于一些癌细胞检测任务中，样品比较粘稠，传统的免疫电泳无法满足敏感度和特异性要求。
然而，通过使用对流免疫电泳技术，可以更加容易地进一步提高检测的精度和准确性。
此外，对流免疫电泳还可以应用于其他生物样品的检测中，如血清、尿液、脑脊液等。
因此，它在计量、生物药物、食品等许多其他领域也得到了广泛的应用。
优点和局限性对流免疫电泳技术有许多明显的优点。
首先，该技术能够提高样品的敏感度和特异性，从而确保测试结果更加准确和可靠。
其次，对流免疫电泳具有快速的操作速度，并且可靠性较高。
此外，这种技术对富含粘稠物的样品也非常适用。
因此，这种技术受到了广泛的青睐。
尽管对流免疫电泳技术存在很多优点，但仍然存在一些局限性。
例如，在一些情况下，可能会出现样品重叠和遮挡的现象，使得检测时出现误差。
此外，这种技术的设备和实验室条件要求较高，操作工作复杂，具有很高的技术门槛。
因此，在操作过程中必须掌握相关的技术。
TAE缓冲液应用于对流免疫电泳的实验
!"#!$%&$'(')*+&,-./&$01$21(3$&)%)(%(%3' E*)缓冲液应用于对流免疫电泳的实验效果分析张淑莉$4方佳妮)4康宝丽)4王丹炀)4刘欣雨)4高瑞鹏)%&西安医学院医学技术学院检验中心!陕西西安!.%))&%&&西安医学院医学技术学院医学检验技术%/'$班!陕西西安!.%))&%44摘4要 为了研究可用于对流免疫电泳的新型缓冲液来替代传统巴比妥2巴比妥钠缓冲液 本实验分别以巴比妥2巴比妥钠缓冲液 L8[缓冲液为电泳介质 电泳后观察抗原抗体复合物白色沉淀线情况 比较这两种缓冲液的电泳结果基本相当 但L8[缓冲溶液电泳沉淀线更为明显 试剂的安全性较高 实验成本较低 因此开展对流免疫电泳实验 L8[缓冲液完全可以替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液关键词 对流免疫电泳 L8[缓冲液 巴比妥2巴比妥钠缓冲液 实验教学中图分类号 ]2(($44文献标识码 844对流免疫电泳*,S D-G B A/::D-S B_B,G A e;S A B F/F"W#[6+是可溶性抗原和抗体在双向免疫扩散的基础上与电泳相结合的定向加速免疫扩散技术#由于电泳技术的采用"使在缓冲液体系中带电的抗原抗体呈定向运动"加快了两者的结合"并且限制了抗原抗体在介质中向四周扩散的倾向"提高了反应时间"显著增加了实验灵敏度$$%"常用于抗原或抗体的定性分析&效价测定及纯度鉴定$)%#对流免疫电泳实验在临床检验和医学院校的临床免疫学检验教学中有很重要意义#对流免疫电泳的原理是在e>值为=&0的琼脂凝胶中"大部分蛋白质抗原等电点低"带较强负电荷"且分子量小"电泳力大于电渗力"在电场中向正极移动,而抗体绝大多数为#H Z"因其等电点偏高"在e>值为=&0时带微弱的负电荷"且分子量较大"移动速度慢#因此在电场中电泳力小于电渗力"在电场中移向负极"电泳时"将抗原孔放负极端"抗体孔放正极端"则抗原抗体相向运动"在两孔之间相遇"并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线#目前"对流免疫电泳实验广泛应用的缓冲液是巴比妥2巴比妥钠缓冲液$(%#但由于巴比妥2巴比妥钠是一类抑制中枢神经系统的药品"它具有镇定&催眠&麻醉等作用"近年来为国家管制类药品"存在一定安全隐患且价格较高"购买困难"影响了对流免疫电泳实验教学的开展#因此需要找到一种试剂安全性高&实验效果好&试剂成本低又环保的实验材料"来替代巴比妥2巴比妥钠缓冲溶液"在测试多种常见e>值为=&)R=&0的缓冲液后"笔者采用L8[缓冲液应用于对流免疫电泳实验并取得较好效果"并且可以作为医学院校对流免疫电泳实验教学中的新型缓冲液# %材料与方法$&$实验材料抗原!正常人新鲜血清,抗体!购买商品*使用前用生理盐水分别做抗体原倍&$l)&$l3&$l=稀释度+"载玻片"打孔器"移液器及移液器吸头"打孔样纸"9:_刻度吸管"洗耳球"牙签"记号笔"湿盒#$&)主要器材电子分析天平"北京六一仪器厂直流稳压电泳仪*!h h20W+及配套水平电泳槽"湘仪离心机#$&(试剂巴比妥2巴比妥钠电泳缓冲液*e>值为=&0"离子强度%&%9+!先称取巴比妥$&=3克置于三角烧瓶中"加入)%%:_蒸馏水"加热溶解后加入巴比妥钠$%&(克"最后加蒸馏水至$%%%毫升*调e>值至=&0+,L8[缓冲液!称取L A/F3<=3H"^b)[!L8-)>)"%&133H"冰乙酸$&$3):f"加蒸馏水至$%%%:_,琼脂粉凝胶!称取琼脂粉分别加入L8[缓冲液和e>值为=&0的巴比妥2巴比妥钠缓冲液"使琼脂浓度为$%H*f"沸水浴中溶解至透亮澄清"放0%R1%v 水浴箱中保温备用#&方法*$+制板与打孔!取干净载玻片"将$i融化琼脂凝胶3&9:_浇于载玻片上"厚度约$&9R)&%::#待琼脂凝固后"按打样模板去打孔"标记抗原抗体方向#*)+加样!在加样孔中加入抗原$%/f和抗体$%/f#*(+电泳!将已经加好样的琼脂板平放于电泳槽中"琼脂板两端用纱布搭桥与电泳槽中缓冲液相连接"抗原孔接电源负极"抗体孔接正极"开启电源"调整电压和电流强度"通电9%R0%:/-#'实验结果电泳结束后关闭电源"在光线充足的情况下"将玻片对着光"观察载玻片上抗原抗体孔之间是否有白色清晰沉淀线出现"如果有沉淀线形成判定为阳性"无沉淀线出现%"%!科技风"#"$年%月理论研究Copyright©博看网. All Rights Reserved.为阴性#如果沉淀线不够清楚"将湿盒放置(1r W 保温箱中数小时"可增强沉淀线的清晰度#*$+以巴比妥2巴比妥钠缓冲液为介质对流免疫电泳电泳图谱见图$*自左上顺时针旋转分别为抗体原倍&$l )&$l 3&$l =稀释度+#*)+以L 8[缓冲溶液为介质对流免疫电泳电泳图谱见图)#图$以巴比妥2巴比妥钠缓冲液为介质电泳图谱图)以L 8[缓冲溶液为介质对流免疫电泳图谱44图$&图)分别是以巴比妥2巴比妥钠缓冲液&L 8[缓冲液为介质"人血清作为抗原进行的对流免疫电泳"电泳图谱如图$&图)所示!在抗体原倍&$l )&$l 3&$l =稀释度条件下均可见清晰白色沉淀线即为抗原抗体复合物#重复多次实验后"比较这两种缓冲液的电泳结果基本相当"但L 8[缓冲溶液电泳结果在$l =稀释度下比巴比妥2巴比妥钠缓冲液$l =稀释度下的沉淀线更为明显"反应结果更好# 结论'临床免疫学检验技术(主要通过研究免疫学理论和免疫学技术并将其应用于临床样本的定性&定量检测"辅助临床对相关疾病进行诊断的一门重要医学学科"该课程不仅理论性强&技术应用广&实用性强"还与临床微生物学检验&临床血液学检验&临床生物化学检验&临床寄生虫学检验等多学科既广泛联系"又相互交叉"是医学检验专业本科生必修的一门重要的主干课程"临床免疫学检验不仅是临床医生对免疫相关性疾病进行分析和诊断的依据"还对免疫相关疾病的治疗效果和病情判断上有很重要的价值"对临床检测工作起重要指导作用$3%#医学检验专业毕业生大多数从事医学检验相关的工作岗位"实验操作技能是毕业生立足社会的基本能力#所以实验教学是临床免疫学检验教学的重要组成部分"其在培养学生扎实的理论基础和专业技能"建立系统的临床检验思维方面具有重要作用$9%#通过开展临床免疫学检验的实验教学"使学生掌握了各项免疫学技术的检测原理&操作方法&注意事项&临床应用等"了解临床免疫学检验的各种新技术新方法"拓宽学生临床免疫学检验方面的知识视野"不但培养学生熟练的动手操作能力&综合分析问题&解决问题的能力以及科研创新能力"还有助于调动学生学习的主动性和积极性"激发学生学习的兴趣$021%"提升学生认识并解决在以后学习和工作中遇到的各种实际问题"以培养适应)$世纪医疗卫生发展需要的高质量&应用型医学检验专业技术人才#目前关于对流免疫电泳缓冲溶液优化的研究并不多见"现就近年来的研究进展进行综述#早期杨瑞景$=%根据电解质的导电性能"尝试使用%&$9i 的氯化钠溶液替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液对乙型肝炎抗原和胎甲蛋白进行检测"该替代缓冲液的优点为经济&快速&简便#其中"氯化钠溶液比巴比妥2巴比妥钠缓冲液价格便宜(19倍"并且在临床试验中取得了较好的结果#但在电泳过程中"^b W _缓冲液会被电解产生氯气"对实验者存在一定危害性"因此氯化钠溶液替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液的方法并未得到广泛普及#张立红$'%在技术上进行了改进后"选用电泳槽理论研究科技风 年 月Copyright ©博看网. All Rights Reserved.缓冲液e>值为=&0"离子强度由%&$巴比妥盐酸缓冲液或e>值为=&0"离子强度%&%0巴比妥缓冲液"该方法不需要昂贵的仪器设备和专供试剂盒"一般实验室就能开展抗原或抗体检测"此方法简便快速&经济"节省了试剂"缩短了实验时间#近年来周瑞雪$$%%等人从常用缓冲液中筛选出0种e>值在=&0的缓冲液进行电泳后研究表明"L A/F2>W_&巴比妥2巴比妥钠&L8[&Z_E2^b">和^b W_2^b">缓冲液均可作为对流免疫电泳的缓冲液#但从电泳后抗原抗体形成白色沉淀线的结果来看"L A/F2>W_缓冲液在对流免疫中效果最好"它作为缓冲液不仅能产生白色沉淀线"而且有很好的抗体浓度依赖趋势#巴比妥2巴比妥钠&L8[&Z_E2^b">&^b W_2^b">电泳效果依次次之"L Z J缓冲液电泳效果最差"没有白色沉淀线出现"最终认为在对流免疫电泳中"L A/F2>W_缓冲液替代传统巴比妥2巴比妥钠缓冲液效果最好#因此认为免疫学实验课中可以将L A/F2>W_作为对流免疫电泳的缓冲液#L A/F2>W_缓冲溶液&^b W_2^b">缓冲溶液替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液"虽然实验原料易获取"且经济实用"实验效果良好"但对流免疫电泳目前主要应用于教学实验中"这两种缓冲液在实验过程中可能会电解生成有毒气体氯气"以及有强酸&强碱的使用"实验安全性不高"实验过程中可能会危害到实验人员的健康#而L8[缓冲液*L8[T D@@B A+是由三羟甲基氨基甲烷*L A/Fdb F B+&乙酸*b,B G/,b,/a+和乙二胺四乙酸*[!L8+按一定比例配制组成的缓冲液"经过多次重复实验证明"L8[缓冲液的电泳效果较好"在保证对流免疫电泳实验教学质量的前提下"安全性较高"没有强酸"强碱的使用"也没有有毒气体生成"并且实验成本较低"在对流免疫电泳实验中有清晰免疫沉淀线"完全能够替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液在对流免疫电泳实验中的使用#本次成功使用L8[缓冲液替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液"同时在操作中我们还注意了以下几个方面!*$+加样时孔内不要有气泡"孔内加入抗原或抗体时以加满为宜"尽量不要外溢,血清标本要尽量新鲜不能用溶血或陈旧标本#*)+电泳时电压不要太大"免得蛋白质变性"出现假阳性或者假阴性"干扰实验结果#*(+抗原抗体的含量和比例要合适"否则不会出现明显可见沉淀线#*3+电泳所需要的时间与孔间距有关"孔间距越大"电泳时间越长#*9+电场强度&电泳缓冲溶液的e>值&溶液离子强度等对检测结果均有影响"电泳速度与电场强度成正比"电场强度越高"带点颗粒移动速度越快,溶液的e>值高于颗粒的等电点时颗粒带负电荷"溶液e>值离某物质的等电点越远"该物质所带电荷量越多"分子量越小"泳动越快,缓冲溶液的离子强度越高"电泳速度越慢#在对流免疫电泳实验中电泳介质本实验室一直首选用琼脂粉"在这次实验中也尝试着将电泳介质琼脂粉换成琼脂糖"实验结果显示"琼脂粉的电泳效果均好于琼脂糖"与周瑞雪等研究发现琼脂糖实验效果好于琼脂粉的研究结果不符"这还有待于进一步的探索论证#综上所述"本文选用L8[缓冲液同传统巴比妥2巴比妥钠缓冲液的电泳结果都有明显沉淀线"但L8[缓冲溶液电泳效果要好于巴比妥2巴比妥钠缓冲液"L8[缓冲液的试剂原料经济安全且容易获取"并且使用琼脂粉作为电泳介质的结果优于琼脂糖"在对流免疫电泳实验教学中作为新型缓冲液完全能替代巴比妥2巴比妥钠缓冲液"目前已经应用于临床免疫学检验实验教学中"取得了良好的实验教学效果"值得推广使用#参考文献%$&吕世静!李会强&临床免疫学检验%V&&第三版&北京)中国医药科技出版社!)%%3)9$29)&%)&刘辉&临床免疫学检验技术实验指导%V&&北京)人民卫生出版社!)%$9)320&%(&庞森!米会芳!张孟霞!等&对,对流免疫电泳-实验影响因素的探究%g&&信息化建设!)%$9'$()3(233&%3&高戈!李闻文!侯珏&初探综合性大学中医学临床免疫学教学改革与实践%g&&中国免疫学杂志!)%$)!)='=()191219'&%9&顾江!罗萍!郭刚!等&临床免疫学及检验第二课堂对培养学生和教师综合素质的作用%g&&国际检验医学杂志!)%$)!(('$%()$)192$)10&%0&马华!汪洪涛!夏晓影!等&0临床免疫学检验1实验教学方法的优化与改进%g&&齐齐哈尔医学院学报!)%$0!(1'($()('9(2('93&%1&徐军发!吕世静!杨维青!等&0临床免疫学检验1实验课教学改革尝试%g&&西北医学教!)%%=!$0'9()'$(2'$9&%=&杨瑞景&氯化钠溶液代替巴比妥缓冲液%g&&新医学!$'=)'3()))3&%'&张立红&对流免疫电泳技术改进%g&&山西医药杂志!$''$!)%'3())9%&%$%&周瑞雪!李冬菊!隋鲜鲜&对流免疫电泳缓冲液及电泳介质的筛选%g&&实验科学与技术!)%)$!$''$()$$92$$=&基金项目 西安医学院)%)$年校级大学生创新创业训练计划科研项目'项目编号$)$9)$$$3(作者简介 张淑莉'$'1$*4(!女!汉族!陕西西安人!本科!高级实验师!研究方向)医学检验教育教学"科技风 年 月理论研究Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
免疫电泳与对流免疫电泳实验设计缺陷
免疫电泳与对流免疫电泳实验设计缺陷免疫电泳和对流免疫电泳是常用的生物学实验方法，用于分离和鉴定蛋白质。
然而，这些实验存在一些设计缺陷，可能影响实验结果和结论的准确性。
免疫电泳是一种基于电泳原理的蛋白质分离方法，通过在凝胶中施加电场，将混合蛋白质分离成不同的带状条纹。
然后，通过与特定抗体结合，识别和鉴定目标蛋白质。
然而，免疫电泳存在一些设计缺陷，可能影响实验结果。
例如：1. 样品预处理不当样品的预处理是影响免疫电泳结果的一个重要因素。
如果样品预处理不充分或者处理过程中出现了问题，会导致蛋白质损失或者降解，从而影响实验结果的准确性。
2. 抗体选择不当抗体选择是影响免疫电泳结果的另一个重要因素。
如果使用的抗体不具有足够的特异性，可能会导致非特异性的反应，从而干扰实验结果的解释和鉴定。
3. 实验操作不规范中，如果电场强度过大或者施加时间不恰当，可能会导致蛋白质移动速度不一致，从而影响结果的解释。
对流免疫电泳是一种基于对流原理的蛋白质分离方法，它利用凝胶中的特定通道，通过对流的方式将蛋白质分离成不同的带状条纹。
然后，通过与特定抗体结合，识别和鉴定目标蛋白质。
然而，对流免疫电泳也存在一些设计缺陷，可能影响实验结果。
例如：1. 通道设计不当通道设计是影响对流免疫电泳结果的一个重要因素。
如果通道设计不合理，可能会导致蛋白质分离不完全或者分离效率不高，从而影响实验结果的准确性。
2. 抗体选择不当与免疫电泳类似，抗体选择也是影响对流免疫电泳结果的另一个重要因素。
如果使用的抗体不具有足够的特异性，可能会导致非特异性的反应，从而干扰实验结果的解释和鉴定。
3. 实验操作不规范过程中，如果通道长度不恰当或者液流速度过快，可能会导致蛋白质移动速度不一致，从而影响结果的解释。
综上所述，免疫电泳和对流免疫电泳存在一些设计缺陷，可能影响实验结果和结论的准确性。
因此，在进行这些实验时，需要严格控制实验条件和操作规范，以确保实验结果的可靠性。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理对流免疫电泳的原理1. 引言对流免疫电泳（Capillary Electrophoresis-Immunosorbent Assay，CE-ISA）是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
其原理基于离子迁移和免疫反应的相互作用，可以快速、准确地检测和定量分析目标分子。
2. 原理介绍对流免疫电泳主要由免疫反应和电泳分离两个步骤组成。
在电泳毛细管内涂覆一个特定抗原或抗体（通常是抗体）的固相材料，以形成免疫反应界面。
当样品中的目标分子与固相材料上的特异抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
通过施加电场，驱动这些复合物在电泳毛细管内进行迁移分离。
3. 免疫反应对于对流免疫电泳，关键的一步是选择和固定特异性抗体或抗原在固相材料上，以确保特异性的免疫反应。
这样可以确保目标分子与固相材料上的抗体结合，从而形成抗原-抗体复合物。
4. 电泳分离电泳分离是对流免疫电泳的核心步骤。
通过施加电场，使复合物在电泳毛细管内迁移。
复合物的迁移速度受到多种因素的影响，如电场强度、毛细管尺寸、载流液和样品pH等。
这些因素的调节可以实现目标分子的高效分离和定量测量。
5. 优势与应用对流免疫电泳具有许多优势。
该方法具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的分子。
对流免疫电泳快速、自动化，适用于大规模样品分析。
该方法可以分析多种复杂样品，如血清、尿液和细胞提取物等，并广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。
6. 个人观点和理解对流免疫电泳是一种非常有潜力的生物分析方法。
其结合了电泳技术和免疫分析原理的优势，可以在较短的时间内准确地检测和定量分析目标分子。
这种方法在生物医学、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
然而，对流免疫电泳方法仍需进一步的改进和优化，以提高其灵敏度和稳定性，并解决样品预处理和复杂样品矩阵的干扰等问题。
总结对流免疫电泳是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
对流免疫电泳
实验方法
制板（3－4ml琼脂）
打孔
加样
电泳（30min左右）
抗 抗 体 原
观察
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者
则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如
沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察(为什么？)。
实验结果
① Ag为阳性 ② Ag为弱阳性 ③ Ag为强阳性 ④ Ag为强阳性
环状沉淀反应
絮状沉淀反应
实验原理
琼脂扩散实验:
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例下形成沉淀
线或沉淀环。
分类: 单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散
实验原理
单向琼脂扩散实验:
即将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验材料
1. 抗原&抗体 2. 微量可调加样器、加样头、玻片、记号笔 3. 打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内） 4. 电泳液、电泳槽、电泳仪
5. 1.2℅琼脂糖(加热溶化）、5ml刻度吸管、吸耳球
电泳液 0.05M（pH8.6 ）巴比妥缓冲液：巴比妥1.84克，巴比妥钠 10.3克，加蒸馏水1000毫升。 1.2℅琼脂糖：以0.025M的巴比妥缓冲液配制，12g琼脂糖加入1L缓 冲液中，加热融化。
实验结果
注意事项：
1. 琼脂板一定平整、光滑 (无气泡) 。 2. 打孔的时候，保证加Ag和Ab的孔在同一水平线上。 3. 孔中液体(Ag,Ab)不宜过多。 4. 使用加样枪时，最好在其量程内使用；使用完毕后调
对流免疫试验实验报告
对流免疫试验实验报告实验目的：本实验旨在通过流式细胞术（Flow Cytometry）对免疫细胞进行定量分析，以评估特定抗体的特异性结合能力，从而对细胞表面抗原的表达水平进行评估。
实验原理：流式细胞术是一种利用激光和荧光检测技术对细胞进行快速、精确的定量分析的方法。
在对流免疫试验中，首先将待测细胞与荧光标记的抗体混合，抗体特异性结合到细胞表面的抗原上。
随后，细胞通过流式细胞仪的激光束，荧光信号被检测器捕捉并转化为数据，从而分析细胞表面抗原的表达情况。
实验材料：1. 待测细胞悬液2. 荧光标记的特异性抗体3. 流式细胞仪4. 适当的缓冲液5. 细胞计数器6. 离心机7. 实验室常规耗材实验步骤：1. 准备待测细胞悬液，调整细胞浓度至适宜的分析水平。
2. 将细胞悬液与荧光标记的特异性抗体混合，按照制造商推荐的稀释比例进行操作。
3. 将混合后的细胞悬液在室温下孵育一定时间，以确保抗体充分结合。
4. 孵育结束后，使用离心机将细胞沉淀，并用缓冲液洗涤去除未结合的抗体。
5. 将洗涤后的细胞重悬于适当的缓冲液中，调整至适合流式细胞仪分析的浓度。
6. 将细胞悬液加载到流式细胞仪进行分析，记录荧光信号。
7. 使用流式细胞仪的软件对数据进行分析，绘制细胞的荧光强度分布图。
实验结果：通过流式细胞仪分析，我们获得了细胞表面抗原的表达水平的定量数据。
荧光强度的分布图显示了细胞表面抗原的表达情况，通过比较实验组与对照组的数据，可以评估抗体的特异性结合能力。
实验讨论：实验结果表明，荧光标记的抗体与待测细胞表面的抗原具有高度的特异性结合能力。
通过分析荧光强度的分布，我们可以对细胞表面抗原的表达水平进行定量评估。
然而，实验中可能存在一些非特异性结合，需要通过设置适当的对照组来排除这种干扰。
实验结论：本实验成功地利用流式细胞术对免疫细胞表面抗原的表达水平进行了定量分析。
实验结果表明，所采用的荧光标记抗体具有较好的特异性，能够准确反映细胞表面抗原的表达情况。
实验2 对流免疫电泳
琼脂扩散技术 ●双向琼脂扩散:
将抗原和抗体分别加入琼脂对应的孔中，二者会向 四周扩散，在二者比例合适处形成白色沉淀线。
●单向琼脂扩散:
将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验步骤
制板
3－4ml 琼脂
打孔
加样 (5-6ul)
抗体 原倍
抗体 1:2
抗原 抗原
抗体 1:4
抗体 1:8
抗原 抗原
电泳（100V, 30min)
制板与打孔 取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml均匀 浇注于玻片上(注意不要让琼脂凝掉），厚度约1.5~2.0mm。 待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔，。
思考题
1.将抗原稀释不同比例后，实验结果有何差异？出现 差异的原因是什么？ 2.实验过程中应该注意什么问题？
请在下周上课前交齐本次实验报告
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
电泳
带电颗粒在电场作用下，向 着与其电性相反的电极移动。
影响电泳迁移速度的因素： 1、带电颗粒的性质：电荷多、分子小泳动快 2、溶液中pH值： pH值离pI越远，解离多，电荷多泳动快 3、电渗作用 4、溶液的离子强度：低离子强度时，迁移速度快 5、电场强度：单位厘米的电位差 越大泳动快 6、吸附作用：介质对样品的滞留作用拖尾
一般抗原蛋白质带负电 荷，虽然也受电渗作用的 影响，但它的电泳迁移率 远远大于电渗作用。
电场力
电渗力
负
极
抗原
正
抗体
极
将抗原置于负极，将抗体置于正极，电泳后则在 两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可 见的沉淀线。
对流免疫电泳(精品资料)PPT
为pH4~5，在pH8.2~8.6的缓冲溶液中，抗体所带负电荷 若加沉样淀 完线毕不后清，楚将，琼于脂板37放℃入环盛境有中0存. 放数小时可增强沉淀线清晰度。 较少，正电荷较多，而且分子在直流电场中易受溶液中负 电制泳备时 离电子压琼不脂宜板过，高按或右过图低在，琼过脂高板可中能打会孔将挑琼出脂孔拉中断琼；脂，孔径3mm，每组孔距3mm。
脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。
对流免疫电泳
实验目的
• 掌握对流免疫电泳技 术的原理和方法
• 稳固电泳槽、电泳仪 的使用方法
• 提高对抗原、抗体免 疫反响的理解
实验原理
掌握对• 流免本疫电实泳技验术的是原理基和方于法 抗原抗体的等电点彼此不同，在通电的琼脂 凝胶中抗体向负极，抗原向正极相对电泳而设计的。一般 在 抗同原样与条 抗件 体下 间， 出抗 现原 一所 条带白正 色电 沉荷 淀少 线， 为负 阳电 性荷 。多，分子也较少，电泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动，假设抗原抗体相对应， 抗体〔IgG〕的等电点为pH5~9，血清蛋白抗原的等电点 那5、么打在孔两器者，相图遇样于板最，适毛比细例吸处管形成沉淀，此即为对流免疫电泳的阳性结果。
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对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳是一种基于免疫反应原理的电泳技术。
它将免疫反应与电泳结合，能够通过观察样品中的抗原与抗体的反应情况来检测抗原的存在与性质。
流免疫电泳的原理如下：
1. 准备样品：将待测样品中的抗原分离、提取或纯化出来，并将其溶解、稀释至一定浓度。
2. 准备电泳凝胶：在电泳槽中铺设一层聚丙烯酰胺凝胶，形成凝胶槽。
3. 加载样品：将待测样品注入凝胶槽内，通常通过浸渍或孔穴装载法。
4. 进行电泳：施加电场，使样品开始在凝胶中运动。
由于凝胶中具有不同电荷的颗粒（如抗原和抗体），它们会在电场作用下产生迁移。
5. 免疫反应：待测抗原与已知特异性抗体在凝胶中发生免疫反应。
如果待测抗原存在于样品中，则它们会与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
6. 染色与可视化：在免疫反应发生后，可以通过染色（如共沉淀染色、辐射追踪染色等）来可视化抗原-抗体复合物在凝胶中的位置。
7. 解读结果：根据样品中抗原的位置、带电性以及抗体的特异性等信息，可以判断待测抗原是否存在，以及抗原的分子量、浓度等性质。
总之，流免疫电泳利用电泳技术将待测样品中的抗原与特异性抗体相互作用，并通过电泳和染色等方法进行可视化，从而实现对抗原的检测与分析。
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项目五 对流免疫电泳试验
(Counter immunoelectrophoresis test)
【实验原理】
在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下能
相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。
据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。
【试剂和器材】
1．AFP阳性血清、待检血清、抗AFP诊断血清。
2． mol/L巴比妥缓冲液。
巴比妥钠 10.3 g
巴比妥 1.84 g
先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入200ml蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠， 最后
加蒸馏水至1000ml。
3．琼脂凝胶 按需要量称取琼脂粉，加入 L巴比妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L，沸
水浴中溶解至澄清。
4．电泳仪、电泳槽、万用电表。
5．载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。
【步骤和方法】
1．制备琼脂凝胶板 取溶化的琼脂3~4ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。
2．打孔 用绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm，孔距4~5mm，挑去孔中凝胶。
3．加样 用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP阳性血清、待检血清，以加满孔为宜，
注意不要溢出。
4．电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极
端，两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控制
在4~6V/cm长，或电流3~4mA/cm宽，电泳30~60min。
【结果判定】
电泳完毕后关闭电源，待15~30min后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保存。
2
阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔
之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。
Ag
AgAbAb
+
_
1
234
1 阳性对照孔
2~4 待检血清孔
图1-6 对流免疫电泳
【注意事项】
1．当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性，它靠近阳极呈弧
状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别，即阳性对照孔与待检孔间距为0.2cm，在两孔中
间相距0.4cm处打抗血清孔，加样后电泳，两沉淀线吻合为阳性，相交为阴性，其它试验条
件与以上试验相同。
2．电泳缓冲液的pH值、离子强度、电压和电泳时间对检测结果均有影响，应注意控制。
3．电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为1cm时，电泳时间为～2h；孔
间距为0.6cm时，电泳时间为1h。
4．抗原与抗体浓度比例应适当，可通过稀释抗原适当调整，以免出现假阴性。
【方法评价】
1．简便、快速，敏感度比双相免疫扩散法高8~16倍。
2．必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体，否则结果难以解释。
3．必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质。
【临床意义】
对流免疫电泳在临床常用于定性检测某些抗原，以对某些疾病或传染病作快速诊断。也
可用于抗原的半定量测定，或根据沉淀线位置、形状作抗原和抗体相对浓度的分析。由于该
方法分辨率差，当有多种抗原抗体反应系统存在时，形成的沉淀线常重叠，而难以分辨，所
以不用该方法作某种抗原或抗体组分的免疫化学分析。
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【思考题】
1．对流免疫电泳试验原理如何为何选用高电渗作用琼脂作为凝胶介质
2．为何对流免疫电泳比双相免疫扩散试验敏感性高
项目六 火箭免疫电泳试验
(Rocket immunoelectrophoresis test)
【实验原理】
抗原在含一定浓度抗体的琼脂板一端，在电场作用下，向另一端泳动时抗原抗体复合物
形成的沉淀呈圆锥形，状似火箭而得名。它实质上是在电场作用下的凝胶内单相免疫沉淀试
验。当抗体含量不变时，沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。因此用已知不同浓度标准抗原制
成标准曲线，即可求出标本中抗原含量，所以又称单相定量免疫电泳。
【试剂和器材】
1． L巴比妥缓冲液。
2．30g/L缓冲琼脂 称取3.0g琼脂粉置250ml三角烧瓶中，加蒸馏水50ml，沸水浴中
溶解，然后加入上述巴比妥缓冲液50ml混匀后，置4℃冰箱保存备用。
3．AFP诊断血清。
4．待检样品(脐带血清或肝癌病人AFP阳性血清)。
5．参考血清(已知AFP标准抗原)。
6．电泳仪、电泳槽、37~65℃水浴箱、万用电表。
7．载玻片、打孔器、微量加样器等。
【步骤和方法】
1．取30g/L缓冲琼脂，置水浴煮沸溶化，放52℃水浴平衡。
2．释释血清 根据抗体的效价，用L巴比妥缓冲液将抗体作适当稀释(一般作1:20~1:50
稀释)，置52℃水浴保温。
3．浇板 将稀释抗血清与30g/L缓冲琼脂等量混合，注意保温，防止产生气泡(在水浴
中操作，动作要轻缓)，用吸管吸取混匀琼脂迅速滴加于载玻片上，每片琼脂量。 载玻片要
v1.0 可编辑可修改
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放在水平台上，使浇注的琼脂板厚度均匀。
4．打孔 取冷凝后的琼脂板，在距一端1.5cm处用打孔器等距离打3个孔，挑去孔内
琼脂(图1-7)。操作中防止孔四周出现裂纹或破损，否则将影响沉淀峰形状，结果不准确。
图1-7 火箭免疫电泳图
5．加样 用微量注射器分别于孔内准确地加入待检样品以及不同浓度的标准抗原各
10l。
6．电泳 电泳槽内盛L巴比妥缓冲液。将加好样品的琼脂板置于其上，抗原孔侧放阴
极端，用缓冲液浸湿的双层滤纸两端搭桥进行电泳。开始电压为2~5V/cm，维持15~20min，
然后增加到25~30V/cm(需冷却装置)，电泳1~3h至完全成峰；或5~10V/cm过夜。
7．电泳结束后取下琼脂板，如沉淀峰清晰即可直接判读测量结果，否则可将琼脂板浸
泡于10g/L鞣酸生理盐水中会使沉淀峰更明显。如欲永久保留标本，可将琼脂板进行干燥、
染色处理(见双相免疫扩散试验)。
【结果判定】
1．沉淀峰呈尖角火箭形则表示无游离抗原，泳动已到终点；如呈钝圆形或没有峰顶，
前端云雾状则表示还未到终点。
2．从抗原孔中心至火箭顶为沉淀峰高度。以已知标准抗原含量作横坐标，沉淀峰的高
度作纵坐标，绘制成标准曲线。根据待检样品沉淀峰的高度查标准曲线即可计算出待检样品
中AFP的含量。
【注意事项】
1．应选用低电渗作用的琼脂糖作凝胶介质，可避免电渗作用所引起的某些标本的火箭
峰倒退。
2．抗原过浓会使沉淀峰无峰顶，看不到终点；抗体过浓则沉淀峰太低，降低试验敏感
度，甚至沉淀峰无法测量；抗体和抗原浓度应适宜。
_
+
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3．为防样品向四周扩散，加入样品后应尽快电泳，或在电压为2~3V/cm通过凝胶介质
的情况下加入样品，使结果判定更为准确。标本与标准抗原必须在相同的电泳条件下进行电
泳。
4．高压电泳所需时间短，但需冷却装置。低压电泳方便，峰形清晰，但需时较长。
5．其它注意事项请参考单相免疫扩散试验。
【方法评价】
火箭免疫电泳是在单相免疫扩散基础上发展起来的技术，操作简单，能定量，重复性
较好。灵敏度同单相扩散，可测得g/ml以上的抗原含量，需时短是其优点。
为提高灵敏度，可用少量125I标记的标准抗原和被检抗原共同电泳，在含抗体的琼脂中
形成不可见的火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片显影，可出现同位素显影的火箭峰，这就
是目前采用较多的放射自显影技术。根据放射自显影示踪的峰高即可计算出待检抗原的含
量，可测出ng/ml抗原浓度，提高敏感度20~50倍，扩大了应用范围。可用于多种抗原的定
量测定，如AFP、HBsAg等。
【临床意义】
常用于血浆蛋白质、AFP、HBsAg及尿和脑脊液中Ig和补体成分的定量测定。
【思考题】
1．火箭免疫电泳试验原理与单相免疫扩散试验有何不同
2．为使结果准确，加样时应特别注意什么问题