牛舍环境中大肠杆菌对常用消毒剂耐药性的研究

圜　卞国　ｊ！｝２０１８·２　ＤＡＩ　ＲＹ　ＨＥＡＩ　ｒＨ　牛舍潲中大肠杆菌对常用消舒　性的硼究　张国礼’，马高民’，金兰梅　，徐云迪　，朱彬　（１．南京卫岗奶业集团奶源公司，南京　２１００９５；２．金陵科技学院动物科学与技术学院，　南京２１　００３８）　

中图分类号：Ｓ８５８．２３文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４２６４（２０１８）０２—００３２—０５　ＤＯＩ：１　０．１　９３０５／ｊ．ｃｎｋｉ．１　１－３００９／ｓ．２０１　８．０２．００９　摘要：为了研究规模化奶牛养殖场痉气环境中大肠杆菌对消毒药的耐药性，本试验利用沉降法采集牛舍空　气中的细菌样本，应用常规的微生物检验法进行大肠杆菌的分离培养，采用试管稀释法稀释消毒剂对致病性　强的大肠杆菌进行敏感性试验。结果显示：从奶牛场空气环境中共分离出３０株大肠杆菌，１５株具有致病性；　血清型鉴定得出ｏ　型７株、ｏ　和ｏ　型各３株、ｏ　型２株，其中ｏ　型为优势血清型。应用菌毒双杀季铵盐络　合碘溶液、癸甲溴铵溶液和聚维酮碘溶液对其进行耐药性试验，数据显示，癸甲溴铵溶液稀释浓度为１：２０００　时，对大肠杆菌具有较好的抑制效果，１：１５００的稀释浓度下５ｒａｉｎ内可以杀灭；季铵盐络合碘溶液稀释到１：３００　时才有杀灭作用；聚维酮碘溶液的原液没有杀灭作用。结果表明，此牛场空气环境中的大肠杆菌对季铵盐络　合碘溶液和聚维酮碘溶液已经产生耐药性。　关键词：牛舍环境；大肠杆菌；消毒效果　

空气环境中的致病微生物会对人类和家畜的生理状　态和生产性能产生不利影响，还可能导致气源性传染病　的发生…。我国奶牛的规模化养殖比例已超５Ｏ％。高密　度的人工封闭环境给牛场疾病的预防及治疗带来了诸多　困难。空气中少量大肠杆菌的存在不会对奶牛的健康造　成影响，但大肠杆菌含量一旦超标，则可能导致奶牛乳　房炎的发生，给牧场造成巨大损失＿２－　。犊牛大肠杆菌　病也是由大肠杆菌引起的，主要表现为肠炎或败血症，　是新生犊牛死亡的主要原因。另外，奶牛四大疾病（乳　房炎、不孕症、腐蹄病和营养代谢病＿４　）中，除代谢病　收稿日期：２０１７—０４—１６　作者简介：张国礼（１９７６一），男，江苏南京人，执业兽医师，主要从　事奶牛疾病防治方面的工作。　通讯作者：金兰梅（１９５６一），女，江苏泗洪人，教授，主要从事动物　疾病防治方面的研究工作。　Ｉ　３２　外，其他三种疾病均由细菌引起。因此，选用有效的消　毒剂对环境中细菌进行杀灭具有重要意义。　目前，由于消毒剂的大量滥用，许多细菌对消毒剂　产生了耐药性。据班海群　艮道，当长期使用低浓度的　消毒剂作用细菌时，细菌的基因突变率会增加，引起消　毒剂靶位的改变、外排泵系统下调、膜孔蛋白流失，使　细菌对消毒剂产生耐药性。许多学者已经做了关于细菌　对消毒剂耐药性的研究，如郭莉娟【６　等研究表明，大肠　杆菌及肺炎克雷伯氏菌已经对季铵盐类消毒剂产生了　

一定的耐药性。本试验对牛舍空气中细菌进行分离鉴　定，并且针对牛舍中大肠杆菌对３种常用消毒剂的耐药　性进行了研究，以便寻求出牛舍中最有效的消毒剂及　其最佳消毒浓度，为预防和控制奶牛场疾病提供科学　依据。　１材料与方法　１　１　主ｊ娶试刹　试剂：营养琼脂（ＮＡ），麦康凯琼脂（ＭＡＣ），　伊红美兰琼脂（ＥＭＢ），增菌肉汤（ＬＢ增菌液），ＰＢＳ　中和剂（３％吐温８０）。生化鉴定所用肠杆菌科属细菌　微量发酵管（杭州滨和微生物试剂有限公司，批号为　１　５０４０９）；空白敏试纸片（杭州滨和微生物试剂有限　公司赠送）。　消毒剂：菌毒双杀季铵盐络合碘（武汉和田生　物科技有限公司生产，批号为１　５０８Ｏ２）；聚维酮　碘溶液（四川天定生物科技有限公司生产，批号为　１５０８０１】：癸甲溴铵溶液（上海派斯德生化有限公司　生产。批号为１５０７０１）。　ｌ　２　试　５佥仪：　ＳＷ—ＣＪ一２ＦＤ型净化工作台（苏州净化设备公　司）；ＬＲＨ一５０型一恒温恒湿培养箱（广州医疗器械　厂）；灭菌锅（上海博迅实业公司）；ＤＨＧ一９２４０Ａ型　电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备公司）；可调　移液器【德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；水浴锅等。　１．．　试验动物　普通实验小鼠，体重为１６～２４ｇ。　ｌ　４试验设计　１．４．１　样本采集　选择南京卫岗乳业有限公司某奶牛场，分别在产　房、犊牛舍、２个成年母牛舍、青年牛舍内和运动场采　集样本，环境空气取样参照中华人民共和国国家标准　“公共场所空气微生物检验方法”的细菌总数测定中的　自然沉降法　。在每个牛舍由东向西依次取５个点，每　个位点放置２个培养基（麦康凯及琼脂培养基）。将两　种平皿置于离地面高度１－２ｍ处，将平皿盖打开暴露于空　气中１　５ｍｉｎ，盖好平皿盖，记录位置。然后将平皿尽快　送达实验室，在３７℃恒温箱中培养４８ｈ。　１．４．２病原茵分离　取营养琼脂上边缘整齐、形状为圆形、表面带有光　泽、光滑、颜色为灰白色的菌落，加入到营养肉汤中，　置于３７℃培养箱中培养２４ｈ，然后将营养肉汤培养得到　的细菌接种于营养琼脂培养基中，继续在３７￣Ｃ培养箱中　培养１８～２２ｈ。之后挑取单个圆形凸起、光滑、湿润、　卞圈　才２０１８·２　Ｉ）ＡＩＲＹ　ＨＥＡ【　Ｈ　ｌ　奶牛　保健一　半透明、灰白色菌落接种于麦康凯培养基中，再放入　３７。ｃ培养箱中培养２４ｈ。选择典型红色菌落进行革兰氏　染色，初步判定为大肠杆菌。用接种环挑取红色菌落接　种于伊红美兰培养基中，置３７℃培养箱中培养２４ｈ。然　后选取带金属光泽的黑色菌落接种到营养肉汤中，放入　３７℃摇床中１５０ｒ／ｍｉｎ进行纯化培养６～１２ｈ，其问不断做　菌液镜检计数，当含菌量达到１　Ｘ　１０　ＣＦＵ／ｍＬ时。放人　４０（３冰箱保存备用。　１．４．３病原菌生化鉴定　将上述普通琼脂基中培养的细菌茵落分别接种于含　葡萄糖、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、赖氨酸、鸟　氨酸、硫化氢、蛋白胨水、西蒙氏枸橼酸盐生化试剂管　内，置于３７℃培养箱中培养２４ｈ后再取出观察其生化反　应，记录结果。　１．４．４血清型鉴定　将病原茵放在斜面的试管琼脂培养基中培养，用石　碳酸（５％苯酚）冲洗，高压２ｈ，做成抗原。取大肠杆　菌抗体与抗原混合，观察抗原抗体有无凝集或者浑浊现　象，以确定其血清型　ｊ。　１．４．５动物致病性试验　取大肠杆菌肉汤培养物（含菌量为１　Ｘ　１　０７ＣＦＵ／ｍＬ），　腹腔注射小鼠，每只注射０．３ｍＬ，３个重复，对照组分　别注射相同剂量的生理盐水，定时观察小鼠的发病和死　亡情况。对死亡的小鼠进行剖检，观察其病变状态，并　取其病料进行涂片、染色、镜检，接种到对应的培养基　中进行２４ｈ分离培养，得到与注射菌液相同的大肠杆菌　菌株。未发病的持续观察１周。　１．４．６细菌对消毒剂敏感性的测定　采用滤纸片法测定细菌对消毒剂的敏感性＿ｇＪ，选择　聚维酮碘溶液、季铵盐络合碘消毒液、癸甲溴铵溶液　３种常用的消毒药，按照厂家生产说明书稀释成不同的　浓度（表１）。再分别取１　ｍＬ消毒液分别装入对应标记　的青霉素小瓶中，放入５０片无菌的空白纸片２ｈ。再用纸　密封瓶口，置于３７℃培养箱中进行烘干备用。　将致病性强的菌株在肉汤中３７ｏＣ恒温培养２４ｈ，再　分别涂于普通营养琼脂上，用干净镊子夹取纸片贴在琼　脂培养基的上面，在３７℃恒温箱中培养２４ｈ后取出，测　量每个培养皿中抑菌圈的大小，按抑茵圈直径作为判定　敏感性的标准，每个菌株均做３个重复试验，最后取其　

３３　Ｉ　奶牛】ｌ保健１　ｌ——————　平均值。　消蝴　聚维酮碘　

中国　斗２０１８·２　ＤＡ１　ＲＹ　ＨＥＡ１　Ｈ　

表１不同消毒剂的稀释倍数　１：５０　１：１００　１：２００　１：３００　１：４００　１：５００　１：６００　１：８００　１：１０００　霪　１－ｚｏｏ　…５ｏ０　０ｏ　ｍ００¨ｚＯ０　１：１５００　：２０。。　

癸甲溴铵１：５００　１：８００　１：１０００　１：１２００　１：１５００　１：２０００　１：２５００　１：３０００　１：３５００　１．４．７最ｓＪ＼；ｔｌ：ｐ菌浓度试验　根据药敏试验结果，将３种不同的消毒剂按６种　不同浓度进行稀释，聚维酮碘为１：１、１：２０、１：４０、　１：６０、１：８０、１：１Ｏ０，季铵盐碘络合物为１：５０、１：１Ｏ０、　１：１　５０、１：２００、１：２５０、１：３００，癸甲溴铵为１：５００、　１：８００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：２５００。按以上浓　度取消毒剂稀释后的溶液２ｍＬ和等量的两倍浓度的营养　肉汤进行混合。再取０．１　ｍＬ菌悬液与ＬＢ溶液接种到各　试管中，每株细菌都进行３次重复，在３７ｏＣ　１９温箱中培　养。４８ｈ后观察其抑菌的效果，如果发现肉汤出现浑浊　（有的甚至可见菌膜或菌环），记为＋，说明有细菌生　长。当看见肉汤澄清透明、没有浑浊，记为一，说明没　有细菌生长。能够抑制细菌生长的最高稀释倍数就是此　消毒剂对本次试验菌最低的抑菌浓度。　１．４．８消毒剂最小杀菌浓度的测定¨。。　分别取不同浓度的３种消毒剂各２ｍＬ与Ｏ　１　ｍＬ菌液　混合，在５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ和６０ｍｉｎ时分别取出　Ｏ．１　ｍ　Ｌ的样本接种到有中和剂的营养肉汤当中，重　复３次试验，在３７ｏＣ培养箱中培养４８ｈ，观察其中的结　果，将没有细菌生长繁殖的最高稀释倍数作为该消毒剂　在这个时间段对试验菌的最小杀菌浓度。　

２结果与分析　２．１　细菌分离鉴定结果　本次试验共采集了９０个样本，分离出４５个菌株，　革兰氏染色后镜下观察其形态，初步判定为大肠杆菌的　有３５株，在伊红美蓝培养基上生长出带金属光泽的菌株　有２５株；经生化鉴定。确认１５株为大肠杆菌，其中３株　来源于产房舍，６株来源于犊牛舍，３株来源于成年母牛　舍，２株来源于青年牛合。１株来源于舍外点。对１　５株大　肠杆菌进行血清型鉴定，其中０　。型７株、０　和Ｏ　型各　有３株、Ｏ。　型有２株，Ｏ　。型为优势血清型。　

Ｉ３．　

表２　的敏感性　单位：ｍｍ　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１：１００　８　８　８　７　７　７　８　７　７　８　１：２００　８　８　７　６　８　７　６　８　７　７　１：３００　８　７　７　７　７　７　７　７　７　７　季铵１：５００　７　７　６　７　７　７　６　６　６　７　盐络１：８００　６　６　７　６　６　６　６　６　６　６　合碘１：１０００　６　６　６　６　６　６　６　６　６　６　

１：１２００　６　６　６　６　６　６　６　６　６　６　１：１５００　６　６　６　６　６　６　６　６　６　６　１：２０００　６　６　６　６　１｜５Ｏ　８　８　８　７　１：１ｏｏ　８　８　７　６　１：２ｏｏ　８　７　７　７　１：３ＯＯ　７　７　６　７　１：４００　６　６　６　７　１：５ｏ０　６　６　６　６　１：６ｏｏ　６　６　６　６　１－黜６　６　６　６　１：１０ｏ０　６　６　６　６　１：５００　２２　２３　２３　２２　１：８０Ｕ　Ｚｌ　２２　Ｚ２　ｌ　ＺＩ　ＺＩ　Ｚ　ｌ　１：１０００　２０　２１　２０　２１　２０　２１　２１　２２　２３　２２　１：１２００　２１　２０　２１　１９　２１　２Ｏ　２０　２０　２２　２１　１：１５００　２１　２２　２１　１９　２０　２１　２０　２１　２０　２１　１：２０００　２０　２１　２０　２０　２１　２０　１９　２０　２１　２２　１：２５００　１８　１９　１８　１７　１６　１６　１８　１８　２０　１７　１：３０００　１２　１３　１５　１３　１４　１２　１３　１４　１２　１１　１：３５００　１０　１１　１２　１３　１１　１３　１２　１１　１１　１０