[课件]噬菌体展示及酵母展示PPT
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细菌与酵母表面展示技术课件
细菌与酵母表面展示技术
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细菌与酵母表面展示技术
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16Βιβλιοθήκη 细菌与酵母表面展示技术17
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演示版抗体噬菌体展示技术.ppt
for display level
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
5
Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
2
▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
▪ Selective marker: for selection of infected host cells
.,
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Introduction of Phage Display Technology
▪ Nonlytic filamentous phage is the most often
▪ pIII protein is essential for infection of bacteria ▪ Helper phage: wild-type pIII helper phage and
special helper phage
▪ Antigen immobilized on magnetic beads,
than mammalian cell line.
▪ Easier to maintain and grow bacterial cultures for recombinant
antibody production.
▪ Bypass immunization in antibody selection. ▪ Bypass the use of animal cells for production of antibodies. ▪ Producing the combinatorial library (ideally with 108 toisplay
Meiling Xiong 20180629
.,
Contents
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▪ Introduction of Ab phage Display Technology ▪ Ab Formats for Phage Display ▪ Ab Libraries Construction ▪ Phage Ab Selection Methods & Strategies ▪ Phage Ab Screening Applications ▪ In vitro Affinity Maturation ▪ Expression & Purification of Phage Ab Fragments
第4章噬菌体ppt课件
噬菌体可分为两种类型：
1. 毒性噬菌体 ：能在宿主菌内复制增殖， 产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌。 2.温和噬菌体或溶原性噬菌体 ：噬菌体基 因组整合于宿主菌染色体中，不产生子代噬菌 体，也不引起细菌裂解，但噬菌体 DNA随细菌 基因组的复制而复制，并随细菌的分裂而分配 至子代细菌的基因组中。
毒性噬菌体的复制周期
第三节
温和噬菌体
温和噬菌体有溶原性周期和溶菌性周期， 而毒性噬菌体只有一个溶菌性周期。
第三节
溶原性转换：
温和噬菌体
某些前噬菌体可导致细菌基因型和性
状发生改变。例如白喉棒状杆菌产生白喉
毒素的机理
思考题
1.噬菌体的概念及其特征。 2.毒性噬菌体和温和噬菌体、前噬菌体、溶 原性细菌、溶原性转换的概念及特征。 3.溶菌性周期与溶原性周期的区别。
• 噬斑形成单位： 不同噬菌体噬斑的形态
与大小不尽相同。通过噬斑计数，可测知 一定体积内的噬菌体数量。
第三节 温和噬菌体
前噬菌体：整合在细菌染色体上的噬菌体基因 溶原性细菌：带有前噬菌体的细菌。 溶原性：温和噬菌体具有的这种产生成熟子代 噬菌体颗粒和裂解宿主菌的潜在能力。 温和噬菌体有三种存在状态：游离的具 有感染性的噬菌体颗粒；宿主菌细胞质内类 似质粒形式的噬菌体核酸；前噬菌体。
噬菌体的生物学性状
噬菌体有三种 基本形态，即蝌蚪 形、微球形和细杆 形。大多数噬菌体 呈蝌蚪形。
• 结构：由头部和尾部组成； • 化学组成：蛋白质与核酸； • 核酸Байду номын сангаас型：为DNA或RNA，大多数DNA噬菌体
的DNA为线状双链； • 噬菌体具有抗原性；
• 抵抗力：比一般细菌繁殖体强。
第二节
毒性噬菌体
《噬菌体遗传与变异》课件
成熟与释放
新合成的噬菌体粒子在宿主细胞 内成熟，并释放出宿主细胞外。
噬菌体对宿主的致病作用
破坏宿主细胞结构
噬菌体感染导致宿主细胞 破裂，释放出有毒物质， 引发感染症状。
引发免疫反应
噬菌体感染可引发宿主免 疫反应，导致炎症、发热 等症状。
传播与流行
噬菌体可通过感染一个宿 主，再传播给其他宿主， 引发流行性疾病。
调控机制
噬菌体DNA的复制与转录受到严格的调控机制，以确保遗传信息 的正确传递。
噬菌体DNA的突变与重组
突变类型
噬菌体DNA的突变类型包括点突变、插入和缺 失等。
重组机制
噬菌体DNA的重组机制涉及到同源重组和非同 源重组两种方式。
Hale Waihona Puke 生物学意义突变与重组在噬菌体的进化、变异和适应性方面具有重要意义。
03
利用噬菌体的特异性感染和裂解细菌的能力，治疗细菌感染性疾 病。
噬菌体疫苗
利用噬菌体作为载体，表达和展示病原体抗原，用于预防传染病 。
噬菌体基因检测
利用噬菌体感染和扩增特定病原体的基因，用于快速检测和诊断 疾病。
噬菌体在环境治理中的应用
污水处理
利用噬菌体的抑菌和裂解细菌的能力，处理污水中的有害细菌， 提高水质。
噬菌体变异的机制
1 2
DNA复制错误
在DNA复制过程中，由于碱基配对错误或DNA 聚合酶的缺陷，导致基因突变的发生。
重组酶介导的基因重组
在同源或异源DNA之间，重组酶能够识别并催化 DNA的交换和重排，导致基因重组。
3
基因水平转移
通过噬菌体感染或细菌之间直接接触，可实现基 因在不同细菌或噬菌体之间的转移和重组。
《噬菌体遗传与变异》PPT课件
新合成的噬菌体粒子在宿主细胞 内成熟，并释放出宿主细胞外。
噬菌体对宿主的致病作用
破坏宿主细胞结构
噬菌体感染导致宿主细胞 破裂，释放出有毒物质， 引发感染症状。
引发免疫反应
噬菌体感染可引发宿主免 疫反应，导致炎症、发热 等症状。
传播与流行
噬菌体可通过感染一个宿 主，再传播给其他宿主， 引发流行性疾病。
调控机制
噬菌体DNA的复制与转录受到严格的调控机制，以确保遗传信息 的正确传递。
噬菌体DNA的突变与重组
突变类型
噬菌体DNA的突变类型包括点突变、插入和缺 失等。
重组机制
噬菌体DNA的重组机制涉及到同源重组和非同 源重组两种方式。
Hale Waihona Puke 生物学意义突变与重组在噬菌体的进化、变异和适应性方面具有重要意义。
03
利用噬菌体的特异性感染和裂解细菌的能力，治疗细菌感染性疾 病。
噬菌体疫苗
利用噬菌体作为载体，表达和展示病原体抗原，用于预防传染病 。
噬菌体基因检测
利用噬菌体感染和扩增特定病原体的基因，用于快速检测和诊断 疾病。
噬菌体在环境治理中的应用
污水处理
利用噬菌体的抑菌和裂解细菌的能力，处理污水中的有害细菌， 提高水质。
噬菌体变异的机制
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DNA复制错误
在DNA复制过程中，由于碱基配对错误或DNA 聚合酶的缺陷，导致基因突变的发生。
重组酶介导的基因重组
在同源或异源DNA之间，重组酶能够识别并催化 DNA的交换和重排，导致基因重组。
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基因水平转移
通过噬菌体感染或细菌之间直接接触，可实现基 因在不同细菌或噬菌体之间的转移和重组。
《噬菌体遗传与变异》PPT课件
Phage display 噬菌体展示技术ppt课件
Phage display 噬菌体展示 技术
Introduction
• Invented by George P. Smith in 1985. • A method for the study of – protein–protein, protein–peptide, and protein-DNA interactions
Applications
• Determination of interaction partners of a protein. • Determine tumour antigens (for use in diagnosis and therapeutic targeting). • Searching for protein–DNA interactions using specially-constructed DNA libraries with randomised segments. • In vitro protein evolution (also called protein engineering). • Drug discovery. • Finding new ligands (enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists) to target proteins.
Life Cycle of M13
M13 pIII & pVIII Coat-Protein System
• pIII minor Coat-Protein – Consist of 406 aa, 5 copies per phage. – Located at the tail of the phage. – Can display 300aa protein. • pVIII major Coat-Protein – 2700 copies per phage, 10% can used for display. – ~200 copies of fusion proteins per phage. – Proteins are usually small. – High affinity abilities because of high copy numbers.
Introduction
• Invented by George P. Smith in 1985. • A method for the study of – protein–protein, protein–peptide, and protein-DNA interactions
Applications
• Determination of interaction partners of a protein. • Determine tumour antigens (for use in diagnosis and therapeutic targeting). • Searching for protein–DNA interactions using specially-constructed DNA libraries with randomised segments. • In vitro protein evolution (also called protein engineering). • Drug discovery. • Finding new ligands (enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists) to target proteins.
Life Cycle of M13
M13 pIII & pVIII Coat-Protein System
• pIII minor Coat-Protein – Consist of 406 aa, 5 copies per phage. – Located at the tail of the phage. – Can display 300aa protein. • pVIII major Coat-Protein – 2700 copies per phage, 10% can used for display. – ~200 copies of fusion proteins per phage. – Proteins are usually small. – High affinity abilities because of high copy numbers.
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丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒
• 主要外壳蛋白PVIII和4种次要外壳蛋白PIII、PVI、 PIX、PⅦ。PIII与PVIII蛋白一般主要用作展示外 源蛋白的锚定蛋白。 • PIII蛋白位于病毒颗粒的尾端，有3．5个拷贝，其 在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，其 功能是在噬菌体感染大肠杆菌时与F菌毛结合，使 噬菌体能吸附到细菌上。 • PIII蛋白展示系统最突出的特点是对外源多肽或蛋 白质的大小无严格限制，可用于生物大分子的表 达和功能分析等方面研究。PIII的拷贝数只有3．5 个，故可用于选择高亲和力的配体，但在免疫学 和生物疫苗研制中受到了限制。
酵母表面展示系统
• 酵母表面展示系统中研究较多的宿主主要 是酿酒酵母。
• ①酵母是一种理想的真核生物表达载体宿主，其 基因的表达调控及蛋白质的翻译后加工、分泌机 制比较接近高等真核生物。可以表达多种不同大的展示 有独特的优越性； • ②酵母颗粒大，可利用流式细胞仪进行方便的筛 选和分离； • ③酵母展示的外源蛋白可紧密锚定在细胞壁上， 能耐受SDS的抽提； • ④酵母遗传学操作简单，具有发酵性，生长快， 并且安全无毒，可用于基因治疗及开发口服疫苗 等。
噬菌体展示技术的局限
性使噬菌体扩增中会不可避免地 造成20种氨基酸合成具有明显倾倾向性； • ④大肠杆菌的生物合成系统本身的局限性，不能 进行蛋白质的翻译后修饰； • ⑤展示的多肽或蛋白分子量不能太大，否则会影 响噬菌体的装配与感染。
• PVIII是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于 噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬 菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PVIII 拷贝。 • 由于PVIll分子较小，只能融合较小的外源 肽段。但优点在于它的拷贝数多，因此该 系统一般用于筛选亲和力较低的配体，在 疫苗开发上具有潜在的应用价值。
• 此系统将目的蛋白作为N端，与A凝集素c端 部分融合，目的蛋白经A凝集素展示于酵母 细胞表面. • A凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上其锚 定能力由蛋白质C端320个氨基酸组成，富 含Ser/Thr残基.Ser/Thr富集区因广泛存在的 O-糖基化而拥有一个杆状构象，可作为空 间支撑物发挥作用.
新型疫苗的研究
• 使用噬菌体展示能方便地大量生产疫苗用 抗原表位，可以在同一噬菌体上展示多十 具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价 疫苗。使用病原特异性血清从随机肽库中 筛选出特异性的抗原决定簇，只要它们是 疫病特异性的和带有中和抗原决定簇(B细 胞抗原决定簇或T细胞抗原决定簇)，都可以 用于发展特异性疫苗。
应用
• 1 噬菌体抗体库 • 噬菌体展示技术被用于产生人、鼠或者其他来源通过使用抗原蛋白，表达技术，可以从患传染病、自身免疫性疾病，以及 癌症患者的骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或者外周血细胞中获 得重组抗体片段。可以用于病毒的检测和疾病的诊断。 • 构建人源性抗体库
同时用c-myc（原癌基因）单抗和荧光 素偶联的dextran(葡聚糖）(FITCdextran)标记的细胞可用激光扫描共聚 焦显微镜检测。
• 絮凝素FlolP富含N-和O糖苷连接而形成杆 状构象,在细胞表面的絮凝反应中起着主要 作用。 • Flolp絮凝功能结构域靠近N端，识别细胞壁 中的A甘露聚糖组分并与之非共价结合，引 起细胞聚集成可逆性絮状物。
噬菌体展示 及酵母展示
肽库的构建
• 噬菌体随机肽库是由上亿种与噬菌体外壳 蛋白以融合的形式呈现在噬菌体表面的多 肽所组成，库中上亿种多肽分别呈现在上 亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组 成了噬菌体随机肽库。 • 构建肽库的关键是获得足够的独立噬菌体 克隆。以6肽为例，至少应获得lo 7～109以 上的独立克隆。
酵母细胞壁结构
• 酿酒酵母的细胞壁非常坚硬，主要由位于 细胞膜外的甘露糖蛋白和β-葡聚糖组成。 • 细胞壁具有双层结构，内层是由β- 1，3-葡 聚糖和β- 1，6-葡聚糖连接形成的骨架，外 层是主要由甘露糖蛋白组成的纤维状或毛 刷状的结构。
锚定方式
• 作为锚定蛋白的细胞壁甘露糖蛋白主要存 在两种类型： • 一种与细胞壁非共价松弛连接，可被SDS 抽提； • 另一种与细胞壁共价相连，可用β- 1，3一 或β- 1，6葡聚糖酶消化细胞壁释放出来， 但不能被S壁的锚定蛋白根据其连接方 式，可分为GPI型和Pir型。 • 前者的C端都有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定 序列，并通过β- 1，6-葡聚糖连接至β- 1， 3-葡聚糖，可被β- 1，3或β- 1，6-葡聚糖酶 作用。 • 而后者直接与β- 1，3-葡聚糖相连，只可被 β- 1，3-葡聚糖酶作用，其具体连接方式目 前仍没有很明确的结论。
• 根据噬菌体载体的不同，噬菌体展示系统 主要分为：丝状噬菌体系统、入噬菌体系 统、T4噬菌体系统以及．T7噬菌体系统。
丝状噬菌体
• 常以一组随机多肽编码序列或基 示一种序列的外源肽链，不同的噬菌体粒 子展示不同序列的外源肽链。
GPI型共价连接细胞壁的锚定蛋白
• a凝集素和A凝集素是酵母细胞壁上的两种 甘露糖蛋白，它们在酿酒酵母的a交配型 （.MATa）和A交配型（MATA）单倍体细 胞之间介导细胞与细胞的性粘附，使细胞 融合形成双倍体。 • 目前已报道的酵母表面展示系统有两种， 目的蛋白分别与a或A凝集素融合，展示于 酵母细胞表面。