牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

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香港牡蛎钙调蛋白基因的克隆和组织

香港牡蛎钙调蛋白基因的克隆和组织表达分析李素萍，喻达辉，李应清，王培，郭颖，白丽蓉∗㊀（北部湾大学海洋学院，广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西钦州５３５０１１）摘要㊀［目的］探究ＣａＭ在香港牡蛎（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）壳钙代谢中的作用及分子机制㊂［方法］以香港牡蛎为试验材料，利用ＲＡＣＥ－ＰＣＲ技术克隆获得了香港牡蛎钙调蛋白（ＣａＭ）基因ｃＤＮＡ序列，并进行生物信息学分析和ｑＲＴ－ＰＣＲ试验㊂［结果］香港牡蛎ＣａＭ基因的ｃＤＮＡ序列全长为７７０ｂｐ，开放阅读框为４５０ｂｐ，５ᶄ端非编码区５４ｂｐ，３ᶄ非编码区２６６ｂｐ，共编码１４９个氨基酸；预测ＣａＭ蛋白分子量为１６．８２ｋＤ，理论等电点为４．１４，亲水性（ＧＲＡＶＹ）总平均值为－０．６５６，不稳定指数为３１．０８，属于稳定性亲水蛋白㊂氨基酸序列同源性分析和基因系统进化树结果显示，香港牡蛎与长牡蛎的ＣａＭ相似性最高，亲缘关系最近，其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合㊂实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，ＣａＭ基因在香港牡蛎的各个组织中均有表达，其中在鳃中的表达量最高（Ｐ＜０．０５），外套膜次之，鳃是参与牡蛎钙代谢中钙吸收的关键器官，外套膜是分泌有机质的关键器官㊂［结论］推测该基因在香港牡蛎壳形成过程中调节钙的摄取㊁运输和分泌方面发挥重要作用㊂关键词㊀香港牡蛎；钙调蛋白；基因克隆；组织表达分析中图分类号㊀Ｓ９１７．４㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２２）２４－００７５－０７ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２２．２４．０１９㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａｌｍｏｄｕｌｉｎＧｅｎｅｉｎＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓＬＩＳｕ⁃ｐｉｎｇ，ＹＵＤａ⁃ｈｕｉ，ＬＩＹｉｎｇ⁃ｑｉｎｇｅｔａｌ㊀（ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｅｉｂｕＧｕｌｆＭａｒｉｎｅＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＯｃｅａ⁃ｎｏｇｒａｐｈｙ，ＢｅｉｂｕＧｕｌｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｘｉ５３５０１１）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＣａＭｉｎｃａｌｃｉｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓｓｈｅｌｌｓ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣａＭ）ｇｅｎｅｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＡＣＥ⁃ＰＣＲａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒ⁃ｍａｔｉｃｓａｎｄｑＲＴ⁃ＰＣＲ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｏｆＣａＭｇｅｎｅｗａｓ７７０ｂｐ，ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｗａｓ４５０ｂｐ，５ᶄｅｎｄｎｏｎ⁃ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｗａｓ５４ｂｐ，３ᶄｎｏｎ⁃ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｗａｓ２６６ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ１４９ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆＣａＭｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ１６．８２ｋＤ，ａｎｄｔｈｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｗａｓ４．１４．Ｔｈｅｍｅａｎｖａｌｕｅｏｆｔｏｔａｌｒａｔｉｎｇｏｆｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ（ＧＲＡＶＹ）ｗａｓ－０．６５６，ａｎｄｔｈｅｉｎ⁃ｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｄｅｘｗａｓ３１．０８，ｗｈｉｃｈｗａｓａｓｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＣａＭｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓａｎｄＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，ａｎｄｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＣａＭｇｅｎｅｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌｌｔｉｓ⁃ｓｕｅｓｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｇｉｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅｍａｎｔｌｅ．Ｇｉｌｌｓｗｅｒｅｔｈｅｋｅｙｏｒｇａｎｓｉｎ⁃ｖｏｌｖｅｄｉｎｃａｌｃｉｕｍａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｃａｌｃｉｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｔｈｅＯｙｓｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｎｔｌｅｗａｓｔｈｅｋｅｙｏｒｇａｎｓｅｃｒｅｔｉｎｇｏｒｇａｎｉｃｍａｔｔｅｒ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｉｔｉｓｓｐｅｃｕｌａｔｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｇｅｎｅｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃａｌｃｉｕｍｕｐｔａｋｅ，ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｏｙｓｔｅｒｓｈｅｌｌｆｏｒ⁃ｍａｔｉｏｎｉｎＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ；Ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；Ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ基金项目㊀广西重点研发计划项目（２０１８ＡＢ５２００２）；广西研究生教育创新计划项目（ＹＣＳＷ２０２１３５３，ＹＣＳＷ２０２０２４５）；国家重点研发计划项目（２０１８ＹＦＤ０９０１４０６）；国家自然科学基金面上项目（３１８７３０４２）㊂作者简介㊀李素萍（１９９７），女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：水产养殖㊂∗通信作者，高级工程师，博士，从事水产养殖与遗传育种研究㊂收稿日期㊀２０２２－０１－１９；修回日期㊀２０２２－０４－１５㊀㊀双壳类动物的贝壳都是钙代谢产物，含有９０％以上的ＣａＣＯ３晶体和百分之几的生物大分子基质［１］㊂近１０年，人们为阐明壳的形成机制作出了许多努力，已从双壳贝类中鉴定出１０余种基质蛋白［２－５］㊂然而，以往对贝壳形成的分子机制研究集中于基质蛋白的纯化和表征上，而忽略了贝类钙代谢的机制㊂钙离子不仅是参与双壳类动物许多生理过程的调节剂，而且是参与壳结构形成的主要阳离子，在贝壳的形成过程中，需要大量的钙离子不断沉积在基质蛋白形成的骨架上［６］㊂Ｃａ２＋摄取㊁积累㊁转运㊁掺入的机制以及这些过程中涉及的特定调节剂仍然是一个有吸引力的领域，有待进一步研究㊂钙调蛋白（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）是一种主要的细胞内钙受体，存在于许多不同的细胞类型中，是动物中最保守的蛋白质之一㊂ＣａＭ以钙离子（Ｃａ２＋）依赖性方式结合并调节蛋白质丝氨酸／苏氨酸激酶㊂它参与一系列细胞过程，包括分泌㊁细胞分裂和分化㊁ＤＮＡ复制和修复㊁肌肉收缩和糖原代谢㊁渗透细胞体积调节和细胞内通讯［７］㊂在高等脊椎动物中，ＣａＭ由多种基因编码，如人和小鼠的ＣａＭＩ㊁ＩＩ和ＩＩＩ，鸡的ＣａＭＩ和ＩＩ［８－９］㊂在双壳类生物中，钙调蛋白可以调节Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ膜系统来捕获环境中的Ｃａ２＋，细胞外ＣａＭ或ＣａＭ样蛋白（ＣａＭＬＰ）和ＣａＭ或ＣａＭＬＰ结合蛋白被认为在生物矿化中起重要作用［１０－１１］㊂ＣａＭ基因在外套膜裙带及外套膜外表皮上高表达，外套膜主要参与贝壳形成过程中Ｃａ２＋的分泌，因此，双壳类动物体内的ＣａＭ不仅是参与许多生理过程的调控，而且是贝壳结构形成的主要调控因素［１２］㊂香港牡蛎（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ）分布于我国南部沿海，是两广地区最常见㊁最主要的牡蛎养殖种类之一，具有较高的营养价值和经济价值［１３－１５］㊂但香港牡蛎生长速度缓慢，养殖周期长，沿海地区台风频繁，牡蛎养殖深受其害，常常造成巨大经济损失，故在香港牡蛎的养殖产业中，一直存在着提高生长速度㊁缩短养殖周期的强烈需求［１６］㊂香港牡蛎的生长与贝壳形成密切相关，为提高香港牡蛎生长速度㊁缩短养殖周期，加快贝壳的形成，探究贝壳形成的分子矿化机制是重中之重［１７－１９］㊂目前，ＣａＭ作为生物体内重要的调控蛋安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２２，５０（２４）：７５－８１㊀㊀㊀白，是贝壳形成的主要调控因素，因此以香港牡蛎为研究对象，对香港牡蛎贝壳形成的分子矿化机制进行研究㊂笔者采用ＲＡＣＥ技术克隆了香港牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ全长序列，并分析其核酸和氨基酸序列，预测ＣａＭ二级结构和三级结构，并采用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测香港牡蛎ＣａＭ基因在不同组织中的表达情况，对香港牡蛎ＣａＭ基因的功能进行深入研究，旨在为研究香港牡蛎贝壳形成机制及ＣａＭ基因蛋白功能研究提供分子理论基础，为生产实践提供参考依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料㊀香港牡蛎采集于广西钦州市东风市场，取其新鲜的外套膜㊁鳃㊁闭壳肌㊁性腺㊁心脏㊁血淋巴㊁触唇和消化腺８个组织立即放入液氮速冻，置－８０ħ冰箱中保存备用㊂１．２㊀总ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ的合成㊀取香港牡蛎的闭壳肌㊁外套膜㊁鳃㊁血液㊁性腺㊁心脏㊁触唇和消化腺８个组织用研磨仪研磨，参照ＴｒａｎｓＺｏｌＵｐＰｌｕｓＲＮＡＫｉｔ试剂盒（全式金）提取总ＲＮＡ，使用１％琼脂糖凝胶电泳检验ＲＮＡ的完整性并用ＬｉｔｔｌｅＬｕｎａｔｉｃ（ＵＳＡ）测定其浓度，用ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＩＩＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ反转录试剂盒（全式金）合成模板ｃＤＮＡ，置－２０ħ保存备用㊂１．３㊀ＲＡＣＥ获得香港牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ全长㊀根据ＧｅｎＢａｎｋ中已知的太平洋牡蛎（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓ）ＣａＭ基因ｃＤＮＡ全长序列，设计特异性引物ＣａＭ－Ｆ和ＣａＭ－Ｒ，扩增出目的片段，反应程序为９４ħ预变性３ｍｉｎ；９４ħ变性３０ｓ，５５ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸１ｍｉｎ，运行３５个循环；７２ħ终延伸１０ｍｉｎ㊂ＰＣＲ产物用ＤＮＡ胶回收试剂盒（ＴＩＡＮＧＥＮ）纯化，参照ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（全式金）说明书进行连接转化，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，测序结果与长牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ序列比对，相似性极高㊂根据测序出的目的片段设计５ᶄＲＡＣＥ和３ᶄＲＡＣＥ扩增的基因特异性引物，参照５ᶄＲＡＣＥ试剂盒（北京百奥博莱科技）说明进行上游未知片段扩增，利用引物５ᶄＲＡＣＥ－Ａ将模板ＲＮＡ进行逆转录成ｃＤＮＡ，模板ｃＤＮＡ经加帽反应使用引物５ᶄＲＡＣＥ－Ｂ进行第１轮反应，反应程序为：９４ħ变性５ｍｉｎ；５０ħ退火２ｍｉｎ，７２ħ延伸４ｍｉｎ，进行１个循环；９４ħ变性４０ｓ，５５ħ退火１ｍｉｎ，７２ħ延伸３ｍｉｎ，进行２９个循环；７２ħ终延伸１５ｍｉｎ㊂以稀释２０倍的第１轮ＰＣＲ产物为模板，用引物５ᶄＲＡＣＥ－Ｃ进行第２轮反应，反应程序为：９４ħ变性４０ｓ；５５ħ退火１ｍｉｎ，７２ħ延伸３ｍｉｎ，进行３０个循环；７２ħ终延伸１５ｍｉｎ㊂参照３ᶄＲＡＣＥ试剂盒（北京百奥博莱科技）说明进行下游未知片段扩增，使用引物３ᶄＲＡＣＥ－Ａ进行第１轮反应，反应条件为：５５ħ２ｍｉｎ，７２ħ４０ｍｉｎ，１个循环；９４ħ变性１ｍｉｎ，５５ħ退火１ｍｉｎ，７２ħ延伸３ｍｉｎ，３０个循环；７２ħ１５ｍｉｎ㊂以稀释２０倍的第１轮ＰＣＲ产物为模板，引物３ᶄＲＡＣＥ－Ｂ进行第２轮反应，反应程序为：９４ħ４０ｓ；５５ħ１ｍｉｎ，７２ħ３ｍｉｎ，３０个循环；７２ħ终延伸１５ｍｉｎ㊂将２轮反应之后的５ᶄＲＡＣＥ和３ᶄＲＡＣＥＰＣＲ产物分别进行胶回收后进行连接转化，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序㊂引物序列见表１㊂表１㊀试验所用引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ ３ᶄ）用途ＰｕｒｐｏｓｅＣａＭ－ＦＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧ目的片段克隆ＣａＭ－ＲＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＡＣ５ᶄＲＡＣＥ－ＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡ５ᶄＲＡＣＥ５ᶄＲＡＣＥ－ＢＴＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＡＧＧＡＡＴ５ᶄＲＡＣＥ－ＣＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＴＴ３ᶄＲＡＣＥ－ＡＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡ３ᶄＲＡＣＥ３ᶄＲＡＣＥ－ＢＴＴＴＡＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡｑＲＴＣａＭ－ＦＡＡＧＣＴＴＴＣＣＧＴＧＴＧＴＴＣＧＡＴ荧光定量ｑＲＴＣａＭ－ＲＴＧＡＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＴＧＡＰＤＨＦＧＧＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＧ荧光定量（内参基因）ＧＡＰＤＨＲＧＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＴＣ㊀注：Ｆ代表正向引物，Ｒ代表反向引物㊀Ｎｏｔｅ：Ｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ；Ｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ１．４㊀生物信息学分析㊀利用ＮＣＢＩ数据库中的Ｂｌａｓｔ（ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）㊁ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ／）和ＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ．２．１．３等软件对测序结果进行验证分析并拼接出全长ｃＤＮＡ序列㊂使用ＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）预测该蛋白的基本理化性质；使用ＳｏｆｔＢｅｒｒｙ－Ｐｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍｌ）预测蛋白功能位点；使用Ｓｉｇｎａ１Ｐ４．１Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇ－ｎａｌＰ）预测信号肽序列；使用ＴＭｐｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ）预测跨膜结构域；使用ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）预测该蛋白质结构域；使用ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｐｓａ－ｐｒａｂｉ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）和ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓ⁃ｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）分别预测该蛋白质的二级和三级结构；使用ＰＳＯＲＴⅡＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ软件（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｓｏｒｔ．ｈｇｃ．ｊｐ／ｆｏｒｍ２．ｈｔｍｌ）进行亚细胞定位分析；使用Ｃｌｕｓｔａｌｘ１．８１软件进行多重序列比对；使用ＭＥＧＡ７．０软件的邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎ⁃ｉｎｇ，ＮＪ）构建系统发育进化树，进化距离的计算采用Ｋｉｍｕｒａ双参数模式㊂１．５㊀荧光定量ＰＣＲ分析㊀以香港牡蛎８个组织的ｃＤＮＡ为模板，根据全长序列设计定量引物ｑＲＴＣａＭ－Ｆ和ｑＲＴＣａＭ－Ｒ，以ＧＡＰＤＨ为内参基因，每个样品进行３次重复㊂参照ＴｒａｎｓＳｔａｒｔＴｉｐＧｒｅｅｎｑＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘ荧光定量试剂盒（全式金）进行ｑＲＴ－ＰＣＲ，反应程序为：９４ħ预变性３０ｓ；９４ħ变性５ｓ，５５ħ退火１５ｓ，进行３０个循环；７２ħ延伸１０ｓ㊂数据由ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６软件生成并记录，按照２－ΔΔＣｔ计算组织表达水平，采用ＳＰＳＳ２２软件进行单因素方差分析法（ｏｎｅ⁃ｗａｙＡＮＯＶＡ），Ｔｕｋｅｙ检验，Ｐ＜０．０５表示显著性差异㊂２㊀结果与分析２．１㊀香港牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ全长序列㊀以香港牡蛎的ｃＤＮＡ为模板，使用ＲＡＣＥ试剂盒获得香港牡蛎钙调蛋白ＣｈＣａＭ基因序列全长ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为：ＭＺ１９２５１９），其全长为７７０ｂｐ，开放阅读框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）为４５０ｂｐ，５ᶄ非编码区（５ᶄ－ＵＴＲ）５４ｂｐ及３ᶄ非编６７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年码区（３ᶄ－ＵＴＲ）２６６ｂｐ，香港牡蛎ＣａＭ基因编码１４９个氨基酸㊂通过ＳＭＡＲＴ在线分析软件预测香港牡蛎ＣａＭ含有４个ＥＦ－ｈａｎｄ结构域，分别位于１２４０㊁４８７６㊁８５１１３㊁１２１１４９位氨基酸（图１）㊂针对香港牡蛎ＣａＭ蛋白质进行理化性质分析，发现氨基酸理论分子量为１６．８２ｋＤ，带正电荷的氨基酸残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）有１５个，带负电荷的氨基酸残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）有３８个，理论等电点为４．１４㊂该蛋白脂溶指数（Ａｌｉｐｈａｔｉｃｉｎｄｅｘ）为６４．８３，亲水性（ＧＲＡＶＹ）总平均值为－０．６５６，半衰期约为３０ｈ，不稳定指数为３１．０８，因此该蛋白是一类稳定的亲水性蛋白质㊂ＳｏｆｔＢｅｒｒｙ－Ｐｓｉｔｅ预测该蛋白功能位点，发现香港牡蛎ＣａＭ具有２个Ｎ－肉豆蔻酰化位点，７个酪蛋白激酶ＩＩ磷酸化位点，２个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点和１个Ｎ－糖基化位点（图２）㊂使用ＳｉｇｎａｌＰ４．１Ｓｅｒｖｅｒ程序未能预测到信号肽信号；使用ＴＭｐｒｅｄ软件未发现跨膜结构，不属于跨膜蛋白；利用ＰＳＯＲＴⅡＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ软件对香港牡蛎ＣａＭ蛋白进行亚细胞定位分析发现该蛋白在细胞质中分布最多，占５２．２％，在分泌系统小泡中分布最少，为４．３％，细胞核和线粒体中分别为３０．４％和１３．０％㊂注：方框表示起始密码子和终止密码子，绿色阴影部分为钙调蛋白结构域，黄色阴影部分为ＡＡＴＡＡＡ加尾信号Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｂｏｘｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｔａｒｔａｎｄｓｔｏｐｃｏｄｏｎｓ，ｔｈｅｇｒｅｅｎａｒｅａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｏｍａｉｎ，ａｎｄｔｈｅｙｅｌｌｏｗａｒｅａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅＡＡＴＡＡＡｔａｉｌａｄ⁃ｄｉｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ图１㊀香港牡蛎ＣａＭ基因的核酸序列和氨基酸序列Ｆｉｇ．１㊀ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍＣｈＣａＭｇｅｎｅ图２㊀香港牡蛎ＣａＭ的功能位点预测Ｆｉｇ．２㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｔｅｏｆＣｈＣａＭ７７５０卷２４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李素萍等㊀香港牡蛎钙调蛋白基因的克隆和组织表达分析２．２㊀香港牡蛎ＣａＭ结构预测㊀使用ＳＯＰＭＡ工具对香港牡蛎ＣａＭ蛋白的二级结构进行预测，结果显示，ＣａＭ预测蛋白包含５９．７３％α螺旋（ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ）㊁６．０４％延伸链（ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ）㊁９．４０％β转角（ｂｅｔａｔｕｒｎ）和２４．８３％不规则卷曲（ｒａｎ⁃ｄｏｍｃｏｉｌ）（图３）㊂通过ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ对香港牡蛎和人的ＣａＭ基因编码的蛋白进行三级结构模拟，模拟发现二者蛋白三级结构相似性极高（图４）㊂注：蓝色．α螺旋；红色．延伸链；绿色．β转角；粉红．不规则卷曲Ｎｏｔｅ：Ｂｌｕｅ．Ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ；Ｒｅｄ．Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ；Ｇｒｅｅｎ．Ｂｅｔａｔｕｒｎ；Ｐｉｎｋ．Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ图３㊀香港牡蛎ＣａＭ蛋白质二级结构预测Ｆｉｇ．３㊀Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｗｏ⁃ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＣｈＣａＭ注：ａ．香港牡蛎；ｂ．人；ｃ．叠加Ｎｏｔｅ：ａ．Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ；ｂ．Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ；ｃ．Ｏｖｅｒｌａｙ图４㊀ＣａＭ蛋白质三级结构预测Ｆｉｇ．４㊀Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｈｒｅｅ⁃ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＣａＭ２．３㊀香港牡蛎ＣａＭ氨基酸序列同源性㊀从ＮＣＢＩ下载１１个其他物种ＣａＭ氨基酸序列（表２），经ＤＮＡｓｔａｒ软件对香港牡蛎与其他物种的ＣａＭ进行氨基酸序列同源性分析（图５），结果发现香港牡蛎和长牡蛎的ＣａＭ同源性最高，相似度高达１００％，美洲牡蛎次之，达到９８．７％，其他物种的相似度为９３％９７％㊂运用ＤＮＡＭＡＮ软件将香港牡蛎ＣａＭ的氨基酸序列与其他已公布的８种生物进行多重序列比对分析（图６），结果显示，香港牡蛎ＣａＭ氨基酸序列与长牡蛎和美洲牡蛎有较高的相似性，而与鱼类㊁甲壳类和哺乳动物序列相似性相对较低；ＣａＭ氨基酸排序呈现很高的相似性和高度保守性㊂结果表明，ＣａＭ的氨基酸序列具有典型的钙调蛋白特征（ＥＦ－ｈａｎｄ结构域），发现以上９个物种均有４个ＥＦ－ｈａｎｄ结构域（Ｉ㊁ＩＩ㊁ＩＩＩ和ＩＶ），且它们表现出彼此的序列同源性㊂每个结构域由１２个氨基酸残基组成，其中６个作为金属－蛋白质复合物中Ｃａ２＋的配体［如天冬氨酸（Ｄ）和谷氨酸（Ｅ）］㊂ＣａＭ基因所编码的氨基酸序列高度保守，尤其表现在ＥＦ－ｈａｎｄ结构域Ｃａ２＋结合位点上，暗示ＣａＭ基因在机体中有极其重要的功能和作用㊂２．４㊀ＣｈＣａＭ基因系统进化树㊀为比较不同物种ＣａＭ基因序列的亲缘关系，从ＮＣＢＩ数据库中查找其他物种ＣａＭ基因ｃＤＮＡ序列，用ＭＥＧＡ７．０软件构建ＣｈＣａＭ与其他物种的系统进化树（图７），结果显示，香港牡蛎ＣａＭ与长牡蛎的遗传距离最近，并与美洲牡蛎㊁虾夷扇贝和池蝶蚌等双壳类动物聚为一大支，具有较高的同源性，而与文昌鱼和虹鳟等鱼类㊁人和小鼠等哺乳动物以及中华绒螯蟹和克氏原螯虾等甲壳类动物分支较长，距离较远，同源性较低㊂２．５㊀香港牡蛎ＣａＭ基因的组织特性表达㊀使用ＳＰＳＳ２２．０软件进行单因素分析，通过实时定量ＰＣＲ的方法检测香港８７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年牡蛎ＣａＭｍＲＮＡ在各个组织中的表达量，结果表明，ＣａＭ基因在香港牡蛎各个组织中均有表达，其中鳃组织的表达量最高，其次为外套膜㊁消化腺㊁触唇㊁血淋巴㊁性腺㊁闭壳肌，在心脏的表达量最低（图８）㊂图５㊀香港牡蛎ＣａＭ氨基酸与其他１１个物种的同源百分比Ｆｉｇ．５㊀ＰｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｙｏｆＣａＭａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓａｎｄｏｔｈｅｒ１１ｓｐｅｃｉｅｓ表２㊀同源百分比与序列比对所用物种Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｐｅｃｉｅｓｕｓｅｄｉｎａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄｐｅｒｃｅｎｔｉｄｅｎｔｉｔｙ物种名称Ｓｐｅｃｉｅｓｎａｍｅ氨基酸序列名称Ａｍｉｎｏａｃｉｄｎａｍｅ登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ长牡蛎ＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＸＰ＿０１１４３６５８８．１美洲牡蛎Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｖｉｒｇｉｎｉｃａｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ⁃ｌｉｋｅＸＰ＿０２２３３１５４３．１虾夷扇贝ＭｉｚｕｈｏｐｅｃｔｅｎｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＸＰ＿０２１３４９５６４．１池蝶蚌ＳｉｎｏｈｙｒｉｏｐｓｉｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＣＩ２２６２２．１人ＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＡＡ３５６３５．１小鼠ＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＡＡ６６１８２．１文昌鱼Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａｆｌｏｒｉｄａｅｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ２ＣＡＢ４０１３２．２中华绒螯蟹ＥｒｉｏｃｈｅｉｒｓｉｎｅｎｓｉｓｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＩＥ５６１５８．１凡纳滨对虾ＰｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＡＥＫ２１５３９．１克氏原螯虾ＰｒｏｃａｍｂａｒｕｓｃｌａｒｋｉｉｃａｌｍｏｄｕｌｉｎＡＣＩ１５８３５．１３㊀讨论３．１㊀香港牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ序列特征和系统进化㊀钙调蛋白是贝类中重要的调控蛋白，是钙离子结合蛋白家族成员，能够结合微量钙离子，对真核细胞内的酶起到激活作用，调节细胞的生命活动，进而调控Ｃａ２＋的吸收㊁转运和分泌［２０－２１］㊂该研究利用ＲＡＣＥ技术克隆获得香港牡蛎ＣａＭ基因的ｃＤＮＡ序列，全长为７７０ｂｐ，编码１４９个氨基酸㊂生物信息学分析香港牡蛎ＣａＭ蛋白具有４个典型的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域，能够与钙离子结合，属于典型的钙离子结合蛋白家族成员，这与已有研究报道的合浦珠母贝体内的钙调蛋白的结构域相似［１０］㊂钙调蛋白是一种由１４８个氨基酸残基组成的蛋白质，可形成２个球状区域，由１个灵活的中心连接器连接［２２］㊂注：颜色表示氨基酸序列相似度（黑色．１００％；粉色．７０％；绿色．５０％及以上；白色．５０％以下），上方绿色箭头表示４个ＥＦ－ｈａｎｄ结构域，红色方框为ＥＦ－ｈａｎｄ钙结合域Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｃｏｌｏｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｂｌａｃｋ．１００％；Ｐｉｎｋ．７０％；Ｇｒｅｅｎ．ȡ５０％ａｎｄ＜７０％；Ｗｈｉｔｅ．＜５０％）．Ｇｒｅｅｎａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓ４ＥＦ⁃ｈａｎｄｄｏｍａｉｎｓａｂｏｖｅ，ｔｈｅｒｅｄｂｏｘｉｓＥＦ⁃ｈａｎｄｃａｌｃｉｕｍ⁃ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ图６㊀香港牡蛎ＣａＭ氨基酸序列与其他物种ＣａＭ的序列比对Ｆｉｇ．６㊀ＡｌｉｇｎｍｅｎｔＣａＭａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓａｎｄｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ９７５０卷２４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李素萍等㊀香港牡蛎钙调蛋白基因的克隆和组织表达分析注：括号中为ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｎｏｔｅ：ＴｈｅＧｅｎＢａｎｋｅｎｔｒｙｎｕｍｂｅｒｉｓｇｉｖｅｎｉｎｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ图７㊀ＣａＭ核酸序列构建的系统进化树Ｆｉｇ．７㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＣａＭｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｓｐｅｃｉｅｓ注：不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）图８㊀ＣａＭ基因在香港牡蛎不同组织的表达情况Ｆｉｇ．８㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆＣａＭｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓ每个区域结合ＥＦ－ｈａｎｄ基序中的２个钙离子，这是钙结合蛋白中普遍存在的一个基序，因此钙调蛋白可以结合４个钙离子，与哺乳动物人和软体动物香港牡蛎的三级结构预测结果一致㊂钙结合位点为１２个氨基酸，包含许多负电荷或极性氨基酸残基，如天冬氨酸㊁谷氨酸和天冬酰胺，这些氨基酸的侧链与Ｃａ２＋形成离子键㊂ＣａＭ含有丰富氧原子侧链的氨基酸残基，即使在Ｃａ２＋浓度很低的环境中也能吸引钙离子促进Ｃａ２＋与氨基酸结合㊂氨基酸的功能位点预测发现，其４个ＥＦ－ｈａｎｄ结构域上有１个Ｎ－糖基化位点，２个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点，３个酪氨酸激酶磷酸化位点等，表明其在细胞与细胞间结合和信号传导过程中起着重要作用㊂钙调蛋白是一种必需的蛋白质，也是一种稳定的蛋白质，任何一种钙调蛋白编码基因的突变或者钙调蛋白结合位点的损伤通常都是致命的［７］㊂来自不同脊椎动物物种的ＣａＭ基因编码具有相同氨基酸序列的相同ＣａＭ分子，表明其在脊椎动物进化过程中高度保守［２３］㊂此外，２个不同的无脊椎动物海葵（Ｍｅｔｒｉｄｉｕｍｓｅｎｉｌｅ）和池蝶蚌（Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉ）也编码相同的ＣａＭ蛋白，表明ＣａＭ蛋白在无脊椎动物进化过程中也高度保守［２３－２４］㊂通过多序列比对，发现香港牡蛎ＣａＭ基因与长牡蛎ＣａＭ基因的同源性最高，核酸序列同源０８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年性为９７．１１％，氨基酸序列同源性高达１００％，说明ＣａＭ蛋白在双壳类动物进化过程中高度保守，进一步反映了这种蛋白质在细胞正常功能中的重要性㊂比较香港牡蛎ＣａＭ基因核酸序列ＥＦ－ｈａｎｄ结构域之间的同源性，发现ＥＦｈ１和ＥＦｈ３与ＥＦｈ２和ＥＦｈ４核酸序列具有高度同源性，均为５７．５％，表明参与钙离子结合的部分分子比其他部位更保守［１０］㊂构建系统发育树发现，香港牡蛎ＣａＭ基因和长牡蛎ＣａＭ基因位于同一分支，说明香港牡蛎和长牡蛎的亲缘关系较近，与其他物种的亲缘关系较远，这与他们的生物学分类相符㊂由此推测，ＣａＭ保守结构域在进化过程中具有较高的保守性，并且不同物种有不同的差异性㊂３．２㊀香港牡蛎ＣａＭ基因的组织表达分析㊀贝壳形成是一个复杂㊁精密调控的生物矿化过程，自然条件下构成贝壳的碳酸钙晶体并不是在单一组织作用下形成的，而是多个组织共同作用的结果［２５－２６］㊂荧光定量检测发现，ＣａＭ基因在香港牡蛎鳃组织中表达量最高，是心脏组织表达量的（１９８．５７ʃ４．００）倍，与合浦珠母贝和池蝶蚌ＣａＭ基因组织表达趋势相同［２４］㊂在双壳类动物中，鳃是从水中吸收钙的主要器官，在膜Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶系统中发挥调节作用［２７－２８］㊂香港牡蛎ＣａＭ在鳃组织中高表达，说明ＣａＭ在香港牡蛎鳃吸收和积累钙的过程中具有重要的调控作用㊂在软体动物中，外套膜与贝壳直接接触的区域能够分泌角质层和钙化层［２９］，是壳的形成过程中的关键调控因子㊂笔者发现ＣａＭ基因在香港牡蛎外套膜组织中表达量是心脏组织的表达量的（１８３．６４ʃ７．１８）倍，这与其他动物的报道相似㊂这暗示了香港牡蛎ＣａＭ基因通过鳃和外套膜组织共同参与调控Ｃａ２＋的吸收㊁转运和分泌等钙代谢途径㊂由此推测香港牡蛎贝壳的形成是由鳃从外界环境中吸收Ｃａ２＋并转运到外套膜中，并通过钙泵将离子从外套膜运输到外套腔分泌中形成贝壳㊂因此，在贝类贝壳形成的生物矿化过程中，钙调蛋白被认为有极其重要的作用㊂４㊀结论该研究克隆了香港牡蛎ＣａＭ基因ｃＤＮＡ序列，全长为７７０ｂｐ，编码１４９个氨基酸，具有４个ＥＦ－ｈａｎｄ结构域㊂通过多序列比对及构建系统发育树发现，香港牡蛎ＣａＭ基因与长牡蛎ＣａＭ基因的同源性最高（９７．１１％），并且位于同一分支㊂荧光定量检测发现，ＣａＭ基因在香港牡蛎各组织中都有表达，其中鳃组织的表达量最高，其次为外套膜㊁消化腺㊁触唇㊁血淋巴㊁性腺㊁闭壳肌，心脏的表达量最低㊂该研究结果将有望为香港牡蛎贝壳形成的生物矿化机制及ＣａＭ基因功能研究提供基础资料㊂参考文献［１］ＡＲＮＯＮＡ，ＣＯＯＫＢ，ＭＯＮＴＥＬＬＣ，ｅｔａｌ．ＣａｌｍｏｄｕｌｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍｓｔｏｒｅｓｉｎｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７５（５３０３）：１１１９－１１２１．［２］ＺＨＡＮＧＹ，ＸＩＥＬＰ，ＭＥＮＧＱＸ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｔｈｅｎａｃｒｅｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｅａｒｌｏｙｓｔｅｒ，Ｐｉｎｃｔａｄａｆｕｃａｔａ［Ｊ］．Ｃｏｍ⁃ｐａｒａｔｉｖｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｐａｒｔＢ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，１３５（３）：５６５－５７３．［３］ＭＡＲＩＮＦ，ＬＵＱＵＥＴＧ．Ｍｏｌｌｕｓｃａｎｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｓｈ⁃ｅｌｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＰｉｎｎａｎｏｂｉｌｉｓＬ．［Ｊ］．Ｍａｔｅｒｉａｌｓｓｃｉｅｎｃｅ＆ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣ，２００５，２５（２）：１０５－１１１．［４］ＴＡＫＥＵＣＨＩＴ，ＥＮＤＯＫ．ＢｉｐｈａｓｉｃａｎｄｄｕａｌｌｙｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｍａｊｏｒｓｈｅｌｌｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｐｅａｒｌｏｙｓｔｅｒＰｉｎｃｔａｄａｆｕ⁃ｃａｔａ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，８（１）：５２－６１．［５］ＺＨＡＮＧＣ，ＺＨＡＮＧＲＱ．Ｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｏｕｔｅｒｓｈｅｌｌｓｏｆｍｏｌｌｕｓｃｓ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，８（６）：５７２－５８６．［６］ＳＩＭＫＩＳＳＫ，ＷＩＬＢＵＲＫＭ．Ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｍｉｎｅｒａｌｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｍ］．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８９．［７］ＦＥＬＩＣＩＡＮＯＤＭ，ＥＤＥＬＭＡＮＡＭ．ＲｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ⁃ｄｅ⁃ｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＩＶｓｉｇｎａｌｉｎｇａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ⁃ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆ⁃ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈｅｍｉｓ⁃ｔｒｙ，２００９，２８４（３９）：２６４６６－２６４８１．［８］ＦＩＳＣＨＥＲＲ，ＫＯＬＬＥＲＭ，ＦＬＵＲＡＭ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｄｉｖｅｒｇｅｎｔｍＲＮＡｓｃｏｄｅｆｏｒａｓｉｎｇｌｅｈｕｍａｎｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２６３（３２）：１７０５５－１７０６２．［９］ＮＯＪＩＭＡＨ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｒａｔｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，２０８（２）：２６９－２８２．［１０］ＬＩＳ，ＸＩＥＬＰ，ＺＨＡＮＧＣ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｉｖｏｔａｌｃａｌｃｉ⁃ｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｒｅｇｕｌａｔｏｒ：Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｓｈｅｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｅａｒｌｏｙｓｔｅｒ（Ｐｉｎｃｔａｄａｆｕｃａｔａ）［Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｐａｒｔＢ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，１３８（３）：２３５－２４３．［１１］ＹＡＮＺＧ，ＦＡＮＧＺ，ＭＡＺＪ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｃａｌｍｏｄ⁃ｕｌｉｎｄｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｓｈｅｌｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｅａｒｌｏｙｓｔｅｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔｂｉｏｐｈｙｓｉｃａａｃｔａ，２００７，１７７０（９）：１３３８－１３４４．［１２］ＭＯＵＮＴＡＳ，ＷＨＥＥＬＥＲＡＰ，ＰＡＲＡＤＫＡＲＲＰ，ｅｔａｌ．Ｈｅｍｏｃｙｔｅ⁃ｍｅｄｉａ⁃ｔｅｄｓｈｅｌｌｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｅａｓｔｅｒｎｏｙｓｔｅｒ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４（５６６８）：２９７－３００．［１３］ＲＥＮＪＦ，ＨＯＵＺＨ，ＷＡＮＧＨＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｍｉｔｏｇｅ⁃ｎｏｍｅｓｏｆｆｉｖｅＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａｓｐｅｃｉｅｓｐｒｏｖｉｄｅｓｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｏｙｓｔｅｒｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａ⁃ｔｉｏｎａｎｄｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍａｒｉｎｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，１８（２）：２４２－２５４．［１４］ＦＡＮＣ，ＫＯＥＮＩＧＥＲＰ，ＷＡＮＧＨ，ｅｔａｌ．ＳｃｌｅｒｏｃｈｒｏｎｏｌｏｇｙｏｆＨｏｌｏｃｅｎｅｏｙｓ⁃ｔｅｒｓｈｅｌｌｓ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓ）ｆｒｏｍｔｈｅＷｅｓｔＣｏａｓｔｏｆＢｏｈａｉＳｅａ，Ｃｈｉｎａ［Ｒ］．２００９．［１５］ＰＥＮＧＪＸ，ＬＩＱＺ，ＸＵＬ，ｅｔａｌ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ⁃ｌｅｖｅｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＣｒａｓ⁃ｓｏｓｔｒｅａｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｓｉｓｇｅｎｏｍｅｒｅｖｅａｌｓｅｘｔｅｎｓｉｖｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｅ⁃ｒｅ⁃ｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｂｉｖａｌｖｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｃｏｌｏｇｙｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２０２０，２０（４）：９８０－９９４．［１６］农业部渔业渔政管理局．中国渔业统计年鉴２０１６［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２０１６．［１７］ＨＥＸ，ＬＩＣＹ，ＱＩＨＧ，ｅｔａｌ．Ａｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｇｅｎｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｈｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｈａｐｅ⁃ｒｅｌａｔｅｄｔｒａｉｔｓｉｎＣｒａｓ⁃ｓｏｓｔｒｅａｇｉｇａｓ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０２１，５４３（２２）：１－９．［１８］ＬＡＭＫ，ＭＯＲＴＯＮＢ．ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｒａｓｓｏｓｔｒｅａ（Ｂｉｖａｌｖｉａ：Ｏｓｔｒｅｉｄａｅ）ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒｃｅｎｔｕｒｉｅｓｉｎｔｈｅＰｅａｒｌＲｉｖｅｒＤｅｌｔａ，ＨｏｎｇＫｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００３，２２８（１／２／３／４）：１－１３．［１９］范昌福，王宏，裴艳东，等．牡蛎壳体的同位素贝壳年轮研究［Ｊ］．地球科学进展，２０１０，２５（２）：１６３－１７３．［２０］ＤＥＬＡＮＥＹＫＪ，ＸＵＲＱ，ＺＨＡＮＧＪＸ，ｅｔａｌ．ＣａｌｍｏｄｕｌｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅＲＮＡ⁃ｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｆａｃ⁃ｔｏｒｓｕｂｕｎｉｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００６，１４０（４）：１５０７－１５２１．［２１］任睿．太平洋牡蛎群体遗传多样性的ＳＲＡＰ分析及巨蛎属牡蛎系统学初步研究［Ｄ］．广州：中国科学院南海海洋研究所，２００８：１２－２５．［２２］ＦＩＮＫＬＥＲＡ，ＡＳＨＥＲＹ⁃ＰＡＤＡＮＲ，ＦＲＯＭＭＨ．ＣＡＭＴＡｓ：Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ⁃ｂｉｎｄｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｓｆｒｏｍｐｌａｎｔｓｔｏｈｕｍａｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ，２００７，５８１（２１）：３８９３－３８９８．［２３］ＹＵＡＳＡＨＪ，ＳＵＺＵＫＩＴ，ＹＡＺＡＷＡＭ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｏｗｅｒｍａ⁃ｒｉｎｅｎｏｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００１，２７９（２）：２０５－２１２．［２４］ＺＥＮＧＬＧ，ＷＡＮＧＪＨ，ＬＩＹＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｃＤＮＡｆｒｏｍｔｈｅｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｐｅａｒｌｍｕｓｓｅｌ，Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，１１（１）：４２－５２．［２５］黄荣莲．珍珠贝贝壳蛋白组学及胁迫环境下的应激调控网络［Ｄ］．青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），２０１６：２８－４０．［２６］谢军．间液蛋白在合浦珠母贝贝壳形成中的作用机制研究［Ｄ］．北京：清华大学，２０１６：１０－１６．［２７］ＳＴＯＭＭＥＬＥＷ．Ｃａｌｃｉｕｍａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｕｓｓｅｌｇｉｌｌａｂｆｒｏｎｔａｌｃｉｌｉａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ⁃ｎａｌｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙＡ，１９８４，１５５（４）：４５７－４６９．［２８］ＲＯＵＳＳＥＡＵＭ，ＰＬＯＵＧＵＥＲＮÉＥ，ＷＡＮＧ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｓａｔｉｏｎｍａｒｋ⁃ｅｒｓｄｕｒｉｎｇａｐｈａｓｅｏｆａｃｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｉｎＰｉｎｃｔａｄａｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒａ［Ｊ］．Ｃｏｍｐａｒ⁃ａｔｉｖｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｐａｒｔＡ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅｐｈｙｓｉｏｌ⁃ｏｇｙ，２００３，１３５（２）：２７１－２７８．［２９］张英霞，邹瑗徽，满初日嘎，等．马氏珠母贝鳃组织抗菌活性的研究［Ｊ］．水产科学，２０１０，２９（８）：４６５－４６８．１８５０卷２４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李素萍等㊀香港牡蛎钙调蛋白基因的克隆和组织表达分析。

某理工大学《生物化学》考试试卷(107)

某理工大学《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（145分，每题5分）1. 凡是与茚三酮反应不产生特有的蓝紫色的氨基酸，即可认为不是蛋白质氨基酸。

（）答案：错误解析：有的氨基酸与茚三酮反应不产生特有的蓝紫色，如脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成的是黄色产物。

2. 脂肪的皂化价高表示含低相对分子质量的脂肪酸少。

（）[山东大学2017研]答案：错误解析：皂化值（价）是指皂化1g脂肪所需的KOH的毫克数。

通常从皂化值的数值即可略知混合脂酸或混合脂肪的平均相对分子质量。

皂化值与脂肪（或脂酸）的相对分子质量成反比，脂肪的皂化值高表示含低相对分子质量的脂酸较多，因为相同质量的低级脂酸皂化时所需的KOH数量比高级脂酸为多。

3. 处于等电点时氨基酸的溶解度最小。

（）答案：正确解析：4. 有n个不对称C原子单糖的旋光异构体为2n－1。

（）[四川大学2017研]答案：错误解析：糖分子的旋光异构体数目取决于其所含不对称碳原子数目，用n表示不对称碳原子数目，C表示不对称碳原子。

含n个C的单糖有2n个旋光异构体，组成2n－1对不同的对映体。

5. 复性后DNA分子中的两条链并不一定是变性前该分子原先的两条链。

（）答案：正确解析：6. 所谓肽单位就是指组成蛋白质的氨基酸残基。

（）答案：错误解析：肽单位又称肽基，是肽链主链上的重复结构，是由参与肽键形成的氮原子、碳原子和它们的4个取代成分羰基氧原子、酰胺氢原子和两个相邻的α碳原子组成的一个平面单位。

7. 蛋白质构象是蛋白质分子中的原子绕单键旋转而产生的蛋白质分子中的各原子的空间排布。

因此，构象并不是一种可以分离的单一立体结构形式。

答案：正确解析：8. Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。

（）。

猫主要过敏原Feld1的T细胞抗原表位分析及三维结构模拟_许晨霞 (1)

患者发生轻度到中度结膜炎中具有重要作用［2］。猫过敏原可引发症状严重程度不一的过敏反应，包括轻度鼻炎和结膜炎，甚至危及生命的重症哮喘［3］。Fel d 1 是猫的主要过敏原，其空间结构尚未研究清楚。Fel d 1 蛋白的分子量大小约为 35 kD，由两个异质二聚体非共价连接而成的四聚体糖蛋白组成，每个异质二聚体又由两个独立基因编码的多肽链组成［4］。研究表明，65% ～ 95% 猫过敏患者的过敏反应是由 Fel d 1 引发的［5］。在很多公共场合，比如学校内所检测到的 Fel d 1 浓度足以引发过敏性疾病或者使症状加重［6］。由于外源性抗原不仅可以通过 MHCⅡ类分子途径被提呈，也可与 MHC Ⅰ类分子形成复合物，也就是它们之间存在交叉提
［Abstract］ Objective： To obtain the T cell dominant epitopes of cat major allergen Fel d 1 by predicting its binding affinity with MHC class Ⅰ and Ⅱ，and to model the three-dimensional structure of Fel d 1，so as to provide a novel clue for modifying the antigenicity and clinical research of Fel d 1． Methods： The protein sequence of Fel d 1 was extracted from the UniProtKB． We predicted MHC Ⅱ epitopes of Fel d 1 by online software NetMHCⅡ 2． 2 Server and predicted its MHCⅠ epitopes by SYFPEITHI． The three-dimensional structure modeling of Fel d 1 was done using SWISSMODEL． The stability of its spatial conformation was evaluated by Ramachandran plot． Results： The predicted results showed that the dominant regions of MHCⅡ epitopes on Fel d 1 were 22-43 and 80-95， and the dominant regions of MHCⅠ epitopes were 17-30，56-84 and 91-103． The Ramachandran plot showed the spatial conformation of Fel d 1 was stable． Conclusion： The study helps to determine the T cell dominant epitopes and the three dimensional structure of Fel d 1，which provide a theoretical basis for antigenic modification and lay the foundation for future clinical study．

《生物化学》课后习题答案

生物化学（第三版）课后习题详细解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。

蛋白质中的氨基酸都是L型的。

但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。

参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。

此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。

除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。

氨基酸是两性电解质。

当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。

在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。

某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI 表示。

所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。

α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（ Edman反应）。

胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。

半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。

这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。

除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。

比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。

参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。

核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。

氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。

常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。

习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究

・研究报告・牡蛎酶解产物中多肽的分离纯化及其结构研究△冯晓梅1,韩玉谦23,赵志强1,管华诗1(1中国海洋大学国家海洋药物工程技术研究中心,山东青岛,266101;2中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛,266003;)摘　要:目的从牡蛎蛋白质的酶解产物中分离制备具有活性的多肽并对其结构进行研究。

方法采用胰蛋白酶对牡蛎蛋白质进行酶解,使其释放出具备特殊活性的肽,将含有活性肽的粗提物分别用Sephadex G25凝胶柱层析,DEA E2Sepharose FF离子交换柱层析和C18反相柱进行分离和纯化。

结果牡蛎酶解产物经过分离纯化制备得到纯度较高的多肽F32,红外光谱的测定表明该肽的肽链是以α2螺旋的构型存在。

电喷雾串联质谱法分析多肽F32完整的氨基酸序列为:Arg2G ln2Ile或Leu2G ly2Ala2Thr2Asn2Ala。

结论本研究将为牡蛎酶解多肽F32构效关系的研究提供基础。

关键词:太平洋牡蛎;多肽;电喷雾串联质谱法;结构研究中图分类号:Q959.21,R931.6　文献标识码:A　文章编号:100223461(2009)022*******Study of isolation,preparation and structure identif ication of peptides from hydrolyzates of oysterFEN G Xiao2mei1,HAN Yu2qian23,ZHAO Zhi2qiang1,GEAN Hua2shi1(1N ational Engi neeri ng Research Center f or M ari ne D ru gs,Ocean U ni versit y of Chi na, Qi ng d ao266101,Chi na;2College of Food S cience an d En gi neeri ng,Ocean U ni versit y of Chi na,Qi ng dao266101,Chi na)Abstrect:Objective To st udy t he p reparation and t he st ruct ure identification of peptides from hydrolyzates of oyster.Methods The oyster protein was hydrolyzed wit h tryp sin.The hy2 drolysates were p urified using Sep hadex G25gel chromatograp hy,D EA E2Sep harose FF ion exchange chromatograp hy,reversed2p hase H PL C o n C18column.R esults The peptide F32 was finally isolated f rom t he oyster hydrolysates.The oyster p rotein was hydrolyzed wit h t ryp sin.IR spect rum showed t he conformation of peptide chain wasα2helix.t he amino acid sequence of F32was determined by ESI2MS/MS.The sequence of F32was as follows:Arg2 Gln2Ile or Leu2Gly2Ala2Thr2Asn2Ala.Conclusion The research result would p rovide founda2 tion for t he struct ure2activity research of t he peptide F32.K ey w ords:Crassost rea gi g as Thunberg;peptides;ESI2MS/MS;st ruct ure research 海洋活性肽是海洋活性物质研究的重要组成部分。

免疫学案例[整理版]

医学免疫学概论患者李xx，男，11岁，因高热、头痛，右侧腹股沟疼痛，行走不便而入院。

患儿于6天前参加夏令营活动时，不慎右足底被刺伤，因伤口小，不以为然，未作任何处理。

3天后伤口有轻度肿痛，第5天半夜开始发高烧、无抽搐，右侧腹股沟疼痛，行走明显不便，未进行任何治疗，第6天就诊入院。

体格检查发现右足底伤口及右侧腹股沟皮肤红肿、触之微热，腹股沟淋巴结肿大，生理反射存在，病理反射未引出。

血象：WBC12³109/L，血细胞分类：中性杆状核粒细胞12%，中性分叶核粒细胞76%、淋巴细胞10%、单核细胞2%。

临床诊断：右足底外伤性感染并发右侧腹股沟淋巴结炎及菌血症。

问题：从免疫学的角度考虑，患儿右足底被刺伤后，局部感染，为什么右侧腹股沟淋巴结会出现肿大、疼痛及高热？患儿右足底被刺伤，导致外来病原微生物入侵，机体免疫系统可识别这种“非己”抗原物质，发生免疫应答。

免疫系统是免疫应答的物质结构基础。

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。

淋巴结是外周免疫器官，是免疫应答发生的场所，故淋巴结会肿大。

在免疫应答的过程中，免疫分子起着非常重要的作用，某些免疫分子如细胞因子具有致热及致痛的作用，故患儿表现疼痛和高热。

免疫器官男，4个月。

因低热半月而入院。

患儿系第二胎第二产，足月顺产，出生体重2.3kg，无窒息史，出生时即接种卡介苗。

母乳喂养，无抽搐史。

自出生后反复患呼吸道感染及鹅口疮，治疗效果欠佳。

有一兄亦是生后反复感染，4个月时在家中死亡，具体病因不详。

体检：体温37.8℃，意识清楚，营养发育欠佳，慢性病容，贫血貌，内眦间距3cm，无特殊面容。

口腔黏膜有大片白色膜状物附着，不易拭去，咽部充血。

左上臂有一黄豆大小创面，有脓血分泌物。

全身浅表淋巴结未触及，心肺未见异常。

腹胀，有脐疝，肝肋下1cm，质中，脾未触及。

实验室检查：血红蛋白87～95g/L，白细胞(8.5～12.5)³109/L，中性粒细胞0.55～0.70，淋巴细胞0.35～0.46，血小板55³109/L；血IgG 2.1g/L，IgA0.57g/L，IgM 0.71g/L。

某理工大学《生物化学》考试试卷(2790)

某理工大学《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（145分，每题5分）1. 测定酶活力时，一般测定产物生成量比测定底物消耗量更为准确。

（）答案：正确解析：2. 蛋白质变性后，会使大量氨基酸游离出来。

（）[山东大学2016研]答案：错误解析：蛋白质变性是指蛋白质的空间结构被破坏，而一级结构仍保持完整，所以不会有氨基酸游离出来，大量氨基酸游离出来的现象称为氨基酸的降解。

3. 催产素和加压素都是由脑垂体后叶细胞合成和分泌的。

（）答案：错误解析：催产素和加压素的合成是在下丘脑细胞中进行的。

4. 表皮生长因子的作用不需要G蛋白。

（）答案：错误解析：表皮生长因子的作用需要Ras蛋白，而Ras蛋白实际上就是一种G蛋白。

5. 酶的最适温度与酶的作用时间有关，作用时间愈长，则最适温度愈高。

（）。

答案：错误解析：6. 人类不能合成VC的原因是由于体内缺乏VC氧化酶。

（）[四川大学2017研]答案：错误解析：人类不能合成VC的原因是人的肝中缺少L古洛糖酸γ内酯氧化酶。

7. 一个理想的纯化程序，随着分离纯化的进行，比活力应逐渐增加。

（）答案：正确解析：8. 天然氨基酸都具有一个不对称α碳原子。

（）答案：错误解析：甘氨酸无不对称α碳原子9. 血红蛋白的α链、β链和肌红蛋白的肽链在三级结构上很相似，所以它们都有结合氧的能力。

血红蛋白与氧的亲和力较肌红蛋白更强。

（）答案：错误解析：对一定的氧压而言，肌红蛋白与氧的亲和力较血红蛋白强。

10. 肾上腺素既可以使用cAMP作为“第二信使”，也可以使用DG和IP3作为“第二信使”。

（）答案：正确解析：肾上腺素具有不同的受体，通过β受体作用时的第二信使为cAMP，而通过α受体作用时的第二信使则为DG、IP3和Ca2＋。

利用牡蛎制备DPP-Ⅳ抑制肽及其活性分析

利用牡蛎制备DPP-IV抑制肽及其活性分析陈宏1，章骞1,2，陈玉磊1,2，翁凌1,2，张凌晶1,2，谢少浩1，刘光明1,2，曹敏杰1,2,*（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021；2.大连工业大学海洋食品深加工协同创新中心，辽宁大连116034）摘要：以牡蛎肉为原料制备二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV，EC 3.4.14.5）抑制肽。

通过对比5 种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶）制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性，发现胰酶制备的酶解液对DPP-IV抑制效果最好。

通过优化胰酶酶解条件，确定最优酶解条件为加酶量0.8%、pH 8.0、温度37 ℃，酶解时间90 min。

酶解液经超滤、Sephadex G-15和高效液相色谱分离纯化，获得肽片段。

通过质谱鉴定筛选得到2 种肽段的序列为Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys（EITALAPSTMK）和Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg（ILAPPER）。

利用BIOPEP在线模拟分析了这2 个肽的胃肠液消化特性。

采用固相合成法合成肽段APSTM和ILAPPER，并应用于DPP-IV抑制活性研究。

结果显示，2 个肽段的IC50值分别为354.81 μmol/L和16.98 μmol/L。

分子对接结果表明，抑制肽与DPP-IV的活性部位主要以氢键、范德华力和π键相互作用为主。

本研究通过酶解牡蛎肉制备高抑制活性的DPP-IV抑制肽，为以牡蛎为原料的功能性食品开发利用提供了理论基础。

关键词：牡蛎；二肽基肽酶-IV抑制肽；分离纯化；抑制活性；分子对接Preparation and Activity Analysis of DPP-IV Inhibitory Peptides from Paciﬁc Oyster (Crassostrea gigas) CHEN Hong1, ZHANG Qian1,2, CHEN Yulei1,2, WENG Ling1,2, ZHANG Lingjing1,2, XIE Shaohao1, LIU Guangming1,2, CAO Minjie1,2,*(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. Collaborative Innovation Center of Marine Food Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: To prepare dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) inhibitory peptides, Pacific oyster flesh (Crassostrea gigas) was hydrolyzed with five different proteases, including papain, alcalase, pancreatin, neutrase and protromex. The pancreatin hydrolysate was found to have higher DPP-IV inhibitory activity as compared with the other four hydrolysates. The optimal hydrolysis conditions with pancreatin were determined to be 0.8%, 8.0, 37 ℃ and 90 min for enzyme dosage, pH, temperature, and hydrolysis duration, respectively. The hydrolysate obtained using the optimized conditions was purified and fractionated sequentially by ultrafiltration, Sephadex G-15 column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) into different peptide fractions. Two DPP-IV inhibitory peptides were obtained and identified as Glu-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Pro-Ser-Thr-Met-Lys (EITALAPSTMK) and Ile-Leu-Ala-Pro-Pro-Glu-Arg (ILAPPER) by mass spectrometry (MS). Their digestibility characteristics in gastrointestinal fluid were analyzed using online simulation with BIOPEP. Two peptides APSTM and ILAPPER were synthesized by solid-phase synthesis for DPP-IV inhibitory activity evaluation. The results showed that the half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of the two peptides were 354.81 and 16.98 m mol/L, respectively. Molecular docking results indicated that inhibitory peptides interacted with the active site of DPP-IV through hydrogen bonds, van der Waals forces and p bonds. The results of this study provide a theoretical basis for the development of functional foods from oyster in the future.Keywords: oyster; dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptide; isolation and purification; inhibitory activity; molecular dockingDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200226-294中图分类号：TS254.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）10-0120-07收稿日期：2020-02-26基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFD0901004）；财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助项目（CARS-49）第一作者简介：陈宏（1993—）（ORCID: 0000-0002-1711-1124），男，硕士研究生，研究方向为水产加工。

接种过两种白斑综合病毒结构蛋白疫苗的凡纳滨对虾的病毒抵

1.接种过两种白斑综合病毒结构蛋白疫苗的凡纳滨对虾的病毒抵抗力和免疫应答=Viral resistance and immune responses of the shrimp Litopenaeus vannamei vaccinated by two WSSV structural proteins【关键词】白斑综合病毒；凡纳滨对虾；病毒抵抗力；免疫应答研究表明rVP28组的整个存活率与100%死亡率的rVP36B组和PBS组形成对比。

但是这种有效防护仅仅是由较高剂量的rVP28和较低病毒挑战压力组合诱导的。

先天免疫参数分析显示用rVP28处理的对虾，在接种后七天的整个阶段表现出最高的酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性水平（p<0.05）。

但是在所有实验组中，细胞粘附分子（Dscam）的mRNA丰度没有显著性差异（p>0.05）。

此外，用重组病毒蛋白质处理的对虾的总血细胞数相比于PBS实验组的显著减少。

这个结果表明具有结构和剂量依赖性的保护性反应和用基于蛋白质接种疫苗提高对虾先天免疫可能是对WSSV抗性的原因。

（/50/13C801F7D62347D2348/7?accountid=28625，2013）2.中国养殖斑点叉尾鮰出现呼肠孤病毒感染=Reovirus infection emerged incultured channel catfish, Ictalurus punctatus, in China【关键词】呼肠孤病毒；斑点叉尾鮰斑点叉尾鮰的患病症状包括腹胀、眼睛肿胀与鳃盖、下颌、皮肤和鳍基出血。

病毒感染细胞的电镜观察表明，在细胞内排列着大量的晶体状的直径为60-70nm 的类似呼肠孤病毒的微粒。

提取病毒基因组RNA并用SDS-PAGE分析，克隆和测序完整的基因组RNA的S7-S11片段。

CCRV-730的S系列片段序列与其他水产呼肠孤病毒的相应序列在NCBI的基因库中的比对分析表明，这种病毒与草鱼的呼肠孤病毒具有高度相似性，特别是与草鱼呼肠孤病毒873菌株（GCRV-873）共享99%-100%的核苷酸序列同一性。

巨蛎属_Crassostrea_四种牡蛎精_省略_sebindinglectin

2期
吴
琪等 : 巨蛎属 (Crassostrea)四种牡蛎精子 Bindin 蛋白海藻糖凝集素结构域(Fucose binding lectin)多样性研究
253
图1
来自四种牡蛎的 11 个 F-lectin 单倍型的氨基酸序列的比对结果
Fig.1 Alignment of amino acid sequences of eleven F-lectin repeat haplotypes of four species 注 : 相同的序列用点表示 , 黑框的位置是三个保守的氨基酸位点 , 星号下面的是四个保守的氨基酸位点 ; s、g、ni、an 分别表示熊本牡蛎、长牡蛎、日本巨牡蛎、葡萄牙牡蛎
的结构域 , 在原核生物和真核生物中都有发现。在一些鱼类的血清中发现很多含有 F-lectin 结构域的蛋白质都与免疫识别有关(Odom et al, 2006), 在 Tachypleus tridentatu (Salto et al, 1997)和 Anguilla japonica (Honda et al, 2000)中被认为是免疫识别分子。对于巨蛎属的牡蛎来说 , F-lectin 是受精时主要的精子和卵子识别
的功能域。通过扩增得到 F-lectin 序列可以考察其在种间的变化。虽然得到的数据有限 , 但从已有的数据来看 , F-lectin 在葡萄牙牡蛎种内、熊本牡蛎种内、长牡蛎种内无论是核苷酸序列还是氨基酸序列都表现出多样性 , 并在种间也表现出多样性。四种巨牡蛎属的牡蛎 F-lectin 序列建立的 NJ 树显示长牡蛎与葡萄牙牡蛎的 F-lectin 比长牡蛎与熊本牡蛎的关系更近 , 这与 mtCOI 基因建立的三种牡蛎之间的亲缘关系是一致的 (Reece et al, 2008)。更加令人深思的是这个树中 an2 和 an3 的位置。葡萄牙牡蛎三种单倍型定位在不同的支上 , an1 与长牡蛎 F-lectin 的关系更近 , an2 与 an3 与熊本牡蛎之间的关系更近。长牡蛎和葡萄牙牡蛎亲缘关系很近 , 尽管二者之间能够进行双向无障碍的杂交 , 但它们在生理水平上 (Haure et al, 2003)、遗传水平上 (Huvet et al, 2000;

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ＷＵＨｕｉｙａｎ
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ＨＥＹｉｎ。ＸＵＣｈｅｎｘｉａ
ＬＩＵＸｕｅｔｉｎｇ１。ＺＨＡＮＧＪｕｎｙａｎ
ＷＡＮＧＳｈａｈ
ＺＯＵＺｅｈｏｎｇａ。
１．ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＧｕａｎｇｚｈｏｕＡｌｌｅｒｇｉｃＲｅａｃｔｉｏｎｓａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２６０，Ｃｈｉｎａ；２．ＡｌｌｅｒｇｙＬａｂｏｒａｔｏｙ，ＳｒｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｙｒＤｉｓｅａｓｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２６０，Ｃｈｉｎａ
『关键词１牡蛎过敏原；Ｃｒａｇ１；二级结构；Ｂ细胞表位；Ｔ细胞表位
『中图分类号】Ｒ３９２．８
【文献标识码】Ａ
【文章编号】１６７３ — ７２１０（２０１３）０７（ａ）一００１２ — ０５
Ｒｏｂｓｏｎ方法和Ｃｈｏｕ — Ｆａｓｍａｎ方法分析其二级结构；采用Ｋｙｔｅ — Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法、Ｋａｒｐｌｕｓ — Ｓｃｈｕｌｚ法、Ｅｍｉｎｉ法、Ｊａｍｅｓｏｎ —
Ｗｏｌｆ法综合分析Ｃｒａｇ１主要的Ｂ细胞抗原表位。使用ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ和ＮｅｔＭＨＣ —ＩＩ在线网站分析Ｔ细胞抗原表位。结果牡蛎过敏原Ｃｒａｇ１的二级结构主要为仅一螺旋，其Ｂ细胞表位接近覆盖Ｃｒａｇ１氨基酸全序列；而Ｔ细胞优势表位位于第８９～１０３、１０８～１２２、１２９～１４３位肽段。结论本研究分析牡蛎过敏原Ｃｒａｇ１的Ｂ、Ｔ细胞优势表位，为日后Ｃｒａｇ１的基础免疫学研究，如疫苗的研制、诊断试剂的制备和其抗原性改造等提供了理论依据。
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＢ，ＴｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｔｈｅｏｙｓｔｅｒｍａｊｏｒａｌｌｅｒｇｅｎＣｒａｇ１，
・
论 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
著・
２０１３年７月第１０卷第１９期
牡蛎过敏原Ｃｒａｇ１的二级结构及其Ｂ细胞和Ｔ细胞表位分析
伍慧妍何颖，ｚ许晨霞，ｚ刘雪婷，ｚ张俊艳１，２王珊１，２邹泽红１，２陶爱林，
１．广州医学院第二附属医院广州市过敏反应与临床免疫重点实验室，广东广州５１０２６０；
２．呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室，广东广州５１０２６０
【摘要】目的分析牡蛎过敏原Ｃｒａｇ１的二级结构及其Ｂ、Ｔ细胞表位，为探索基于抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法从Ｕｎｉｐｒｏｔ数据库中获得牡蛎过敏原Ｃｒａｇ１的氨基酸序列，通过ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ软件，采用Ｇａｍｉｅｒ－
ｍａｊｏｒａｌｌｅｒｇｅｎＣｒａｇ１ｗａｓａｃｑｕｉｒｅｄｆｒｏｍＵｎｉｐｒｏｔｄａｔａｂａｓｅ．ＴｈｅｓｅｃｏｎｄａｙｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＣｒａｇ１ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙ
ｄｅｖｅｌｏｐｔｈｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｏｙｓｔｅｒａｌｌｅｒｇｙｂａｓｅｄｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃｅｐｉｔｏｐｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｏｙｓｔｅｒ
Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＢｃｅｌｌａｎｄＴｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆｏｙｓｔｅｒａｌｌｅｒｇｅｎＣｒａｇ１