医学微生物菌种长期保存方法探讨
菌种安全保藏方法
菌种安全保藏方法菌种安全保藏方法点击：23食用菌由于生产投入少，经济效益高，近年来在农村兴起了食用菌生产热潮。
生产中食用菌菌丝繁殖快，容易老化，菌种保藏更难。
下面介绍七种简单易行的菌种保藏方法供广大农户参考：蒸馏水法适用于平菇、金针菇、香菇的苗种。
1、保藏平菇、金针菇菌种先将八成熟待保藏试管菌种移入接种箱内灭菌后，用注射器从试管栓内注入蒸馏水，将培养基面全部淹没至管口2厘米为止。
管口用矿蜡封闭，常温下置于阴凉处立放可以保藏1～1.5年。
2、保藏香菇、木耳菌种，用150×15毫米的指型管将培养至7成熟的固体或半固体试管种在接种箱内无菌操作下，放人25×200毫米的大试管内，向大试管内注入蒸馏水至管口1厘米处，封口用橡皮栓包好，并用矿蜡加固密封，置于阴凉处。
木耳可保藏7～8个月，香菇可保藏9～12个月。
此法在自然温度下也可以保藏其他菌种。
尿素暂存法在避光、干燥通风良好的地方放置袋装尿素，将试管菌种主体埋在尿素颗粒中，试管口露在外面，可保藏菌种活力30天之多。
此法在恒定低温环境下即可进行。
液体石蜡保藏法选用化学液体石蜡，高压灭菌后放入40℃恒温箱中数小时或干燥器中数日，用无菌吸管或注射器吸取液体石蜡注入菌种试管。
注入量应高出斜面尖端1厘米左右，管口塞上棉塞并用石蜡封好。
直立保藏在清洁、干燥、凉爽的低温处可以保藏5年。
麸皮保藏法取一定麸皮加水或营养液后拌匀即可备用。
将水麸皮装入试管经高压灭菌后拌入菌种，放在适温下培养，待菌丝体发育好后将试管放入室温下进行干燥。
然后在20℃以下干燥处保藏，可保藏3～5年。
生理盐水保藏法将菌种接入马铃薯培养液中，每250毫升三角瓶装60毫升养液，振动培养液或每天摇动5～10次，培养5～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5毫升无菌生理盐水的试管中，每管约移入4～5个菌丝球，塞上棉塞，用蜡封好管口。
低温可保藏1年。
麦粒保藏法取优质小麦淘洗后浸入20℃水中泡5小时，稍晾干后装管。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
菌种冷冻保藏
封管合格的冷冻管置冰箱-20℃避光处作长期保存。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于菌种的长期稳定更好。
7.注意事项
7.1泪滴型安瓿瓶不易进水，清洗时拿少量安瓿瓶慢慢倾斜，使其管内浸入盐酸；用蒸馏水洗时亦如此；塞棉花时注意松紧适宜，利于防止污染及抽真空。
7.2脱脂乳最好在使用头一天配制好灭菌；灭菌需注意温度不能过高，在115℃25min分钟即可；当压力降为0后，应尽快将其拿出，防止高温破坏其成分（灭菌后颜色发生变化的不可用）。
6.4制菌悬液
形成孢子的链霉菌要尽可能保存孢子，避免基质菌丝体。每支长好的斜面加5～10ml脱脂牛乳，用接种环将孢子轻轻刮下(注意勿刮起培养基)，或震荡洗下孢子层，制成菌悬液。一般要求制成的孢子浓度达108~1010个，高浓度的菌悬液有利菌种保藏。多年后存活率仍高。
6.5分装
菌悬液制备完成后要尽快分装。分装冷冻管时用灭菌的长颈毛细吸管吸取菌悬液，插入预先的冷冻管球形底部，每支冷冻管分装量约0.2～0.5毫升，分装后向管颈部塞入无菌脱脂棉，以不紧为宜。并贴上标签，同时配制1支1%氯化钴牛奶溶液干燥指示管。分装时间要短，要尽快进入冻结。
1.真空干燥:取出预冻好的冷冻管，置于如沙土管制备能抽真空的玻璃干燥器内（干燥器四周置冰块或无水乙醇、冰盐水放低温冰箱或普通冰箱冷冻室事先冷至-21℃±），迅速抽真空。其间不断更换冰块或冷冻液。能将该玻璃干燥器置于冰柜抽真空更好。连续抽气6～8h即可。(干燥器盖底接触处需事先均匀涂抹凡士林石腊,以防微小漏气。）
2.封管：自制一个带多头的岐管，主管连接真空泵，每个岐管连接都采用可抽真空的耐压硅胶管，能装上多支冷冻管即可。、冷冻保藏改进方法（二）
冷冻管由传统的玻璃管改为0.5ml带盖塑料管（维奥即采用此法可保藏大量的锥形塑料管，其材质不详，能耐高温灭菌，盖为按压式）。方法：
菌种的保藏方法
低温冰箱中保藏。
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• 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％ 甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰 箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活 力不受影响。
• 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
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• 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
• 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
• 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
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超低温保藏技术(-60∼-80℃)
• 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃ 以下进行保藏。方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、 丝状真菌等的短期保藏。
• 操作方法：斜面培养生长良好后，放入4℃冰箱（视菌种而 异），一般可保存3-6个月。
• 缺点：保藏时间短，需经常传代，易变异、污染、培养基干 枯、菌体自溶。
• 解决方法：减少培养基营养、密封、减少接菌量。
• 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常 用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。
• 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
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悬液保藏法
• 基本原理是寡营养保藏，将微生物悬浮在不含 养分的溶液中，如蒸馏水、磷酸缓冲液或生理 盐水中。注意密封性。
菌种保藏的原理
• 根据微生物的生理生化特性，人为地创 造条件，使微生物处于代谢不活跃、生 长繁殖受抑制的休眠状态，以减少菌种 的变异。菌种保藏的基本措施是寡营养、 低温、干燥、真空。
常见微生物的菌种保藏及原理
常见微生物的菌种保藏及原理微生物指的是在显微镜下可见的微小生物（如细菌、真菌等）。
由于微生物在各种环境中具有重要的应用价值，如食品加工、制药、环境修复等，因此对微生物菌种的保藏具有重要意义。
目前常见的微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、干燥保存、冷冻干燥保存和液氮保存等。
下面将介绍这些保存方法的原理及其在微生物保藏中的应用。
一、冷冻保存冷冻保存是最常见且简单的微生物保藏方法之一、其原理是通过降低菌种的生长和代谢速度来延缓细胞死亡，从而使菌种长时间保存。
常见的冷冻保存方式有两种：低温保存和液氮保存。
1.低温保存低温保存常用的温度为-80℃。
将微生物菌种培养物加入附加剂（如甘油、蔗糖）后，迅速冷冻至-80℃，然后保存在低温冰箱中。
这种方法简单易行，并且不需要特殊仪器设备，适用于大多数微生物菌种的保存。
2.液氮保存液氮保存是一种极低温的保存方法，常用温度为-196℃。
液氮保存可以在较长时间内保持微生物菌种的细胞完整性和代谢活性。
液氮保存通常需要配备专门的液氮保存设备，如液氮罐和液氮冷冻器。
虽然保存设备和条件较为复杂，但是液氮保存方法适用于保存需求较严格的微生物菌种。
二、干燥保存干燥保存是通过去除菌种的水分来实现菌种长时间保存的一种方法。
常见的干燥保存方法主要有两种：常温干燥保存和真空冷冻干燥保存。
1.常温干燥保存常温干燥保存是将微生物菌种培养物均匀涂布于无菌玻璃片或滤纸上，然后在室温下进行干燥。
干燥后的微生物菌种可以直接保存，也可以以泡脱水的方式进行保存。
常温干燥保存适用于耐受干旱的微生物菌种。
2.真空冷冻干燥保存真空冷冻干燥保存是将微生物菌种培养物在真空条件下进行冷冻干燥。
首先，将菌种培养物在低温下冷冻，然后在低压下去除水分。
真空冷冻干燥保存可以保持菌种的细胞完整性和代谢活性。
这种方法适用于保存需求较严格的微生物菌种。
三、液氮保存液氮保存是将微生物菌种培养物冷冻在液氮温度下进行保存的方法。
如前所述，液氮保存要求采用极低温的液氮温度（-196℃）进行保存。
医学微生物学实验室四种菌种保存方法的比较
医学微生物学实验室四种菌种保存方法的比较目的：探索一种经济、方便、长期的保存常用微生物菌种的方法。
方法：将21种细菌分别用半固体、甘油、脱脂牛奶、微孔珠进行保存及复苏鉴定，比较4种菌种保存方法的保存效果。
结果：通过2年的实验证明用甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法保存时间长，且未发生形态结构、生物学特性的变异。
结论：甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法操作简便易行，长期保存的存活率高，菌种的变异率低，适用于一般微生物学实验室菌种的保存工作。
标签：半固体；甘油；脱脂牛奶；微孔珠；菌种保存微生物学实验教学中，典型的菌种是实验教学能否成功开展和达到满意的教学效果的关键因素。
菌种因受到外界环境及自身代谢的影响，长期在培养基上移种和传代后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，而成为不典型的菌株甚至死亡[1]。
因而菌种保存工作在微生物学实验教学工作中变得尤为重要。
我们通过反复实验试图寻求既操作简便又可保持菌种的存活率，降低菌种的变异率，适用于医学微生物学实验室的菌种保存方法。
1.材料与方法1.1材料1.1.1实验菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，25922）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis，26104）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus，27101）、甲型溶血性链球菌（α-hemolytic streptococcus，32212）、乙型溶血性链球菌（β-hemolytic strepto-coccus，32210-4a）、肺炎链球菌（S.pneumoniae，31002-16）、脑膜炎奈瑟菌（N. meningitides，29019）、大肠埃希菌（Escherichia coli，44101）、肺炎克雷伯菌（K.peumoniae）产气肠杆菌（E. aerogenes，45103）、变形杆菌（P. mirabilis，49006）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi，50402）、甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi A，50001）、乙型副伤寒沙门氏菌（S. paratyphi B，50602）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae 51252-8）、福氏志贺菌（S. flexneri，51573）、宋内志贺菌（S. sonnei，51334-21）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa，10102）、蜡样芽胞杆菌（B.cereus，63301）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis，63501）、白色念珠菌（C. albicans）。
微生物菌种的保藏
低温定期移植法： • 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存， 定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。 • 穿刺培养是将含 0.6 ％～ 0.8 ％的琼脂培养 基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖 挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心， 放在适当温度下培养，待菌长好后即可放 低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆 菌可保藏2年以上不发生明显变异。
菌种传代与保藏
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的 基本材料.
• 微生物具有生命活力，在传代过程中易 发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一 项重要的基础工作，是微生物学基础工 作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
• 工业微生物菌种保藏，是要使菌 种生产能力和与生产工艺相适应 的优良性状保持稳定，当然做不 到绝对不变，只是力求把这种衰 退现象推迟减缓到最低限度。
• 甘油管保藏法 ：是利用微生物在甘油中 生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目 的。其方法是，将40%的甘油高压蒸汽灭 菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种 用 无 菌 水 制 成 高 浓 度 的 菌 悬 液 (108 ～ 1010/ml) 。取 1ml 灭菌甘油放入与甘油充 分混匀，使甘油浓度约为 20% ，于 -20℃ 下冻存。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、 超低温保藏法等，都是利用低温条件下。 • 一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以 及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢 子，可以放在 4℃冰箱内保藏，这种温度 条件下不能使菌体进入休眠，而仅是抑制 微生物的生命活动。 • 因此，保藏时间不宜过长，一般不超过 1～2个月为宜。 • 本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的 水平活性下，这对保藏株的生产性状是不 利的，因此，生产菌种一般不采用此法保 藏。
菌种保藏的几种方法
菌种保藏的几种方法基本原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
5菌种保藏的原理和方法
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方法。
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（六）液氮保藏法
原理：低温 悬浮介质： 10%甘油或5%的二甲亚砜 机理：甘油或二甲亚砜可进入细胞，并通过降低强烈的
脱水作用而保护细胞。 甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 适用菌种：适用于所有微生物、动植物细胞保藏。 保藏期：置液氮内（-196 ℃ ），保存5-10年。 特点：保藏期最长，但保藏费用高，仅用于保存经济价
4 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏原理及条件 菌种保藏的方法 菌种保藏的注意事项 菌种保藏机构
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一、菌种保藏原理
原理：
根据菌种的生理生化特性，人为创造条件使菌 体的代谢活动处于休眠的状态。
条件：
挑取优良纯种，最好是休眠体（孢子、芽孢等）
创造一个最有利于休眠的环境条件，如：降低培 养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌种保藏的方法
斜面保藏法 穿刺保藏法 固体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定期
移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
过筛、灭菌并干燥的沙土为保藏介质，
可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠，但适于这些载 体的微生物不多，保存期短，不及沙土实用。
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（五）真空冷冻干燥保藏法
原理：在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构完整， 然后在真空下使水分升华（最有效方法之一）。
微生物菌种保藏原理与方法
3干燥保藏法
砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及形成孢子的 霉菌和放线菌。 方法：处理砂土 装沙土管 制备菌液 加孢子液 干燥 收藏 恢复培养 明胶片保藏法—细菌 制备菌悬液 制备菌液 制备蜡纸 加菌液 干燥 收藏 恢复培养
3干燥保藏法
硅胶保藏法—丝状真菌。 方法：制备硅胶 制备菌液 加菌液 干 燥 收藏 恢复培养 麸皮保藏法—产孢子的丝状真菌。 制备麸皮培养基 培养菌种 干燥 收藏 恢复培养
1 常用的简易保藏法： 斜面传代保藏法、半固体穿刺保藏法（适用 于细菌和酵母菌）、石蜡油封法 2 甘油保藏法 3 干燥保藏法 4 真空冷冻干燥保藏法 5 液氮超低温保藏法
1 简易保藏法
基本原理：利用低温来抑制微生物生命活 动。 通常将在斜面或半固体培养基上生长良好 时培养物直接放到2~10 ℃冰箱中保藏，当 培养基营养物质消耗殆尽后再重新移植到 新的 培养基上，故又称定期移植保藏法或 传代培养保藏法。
4冷冻真空干燥保藏法
该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添 加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于 相对静止状态。 该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、 酵母菌及病毒的保藏。 该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可 达10~20年），存活率高，是目前最有效的菌 种保藏方法之一。
Байду номын сангаас 甘油保藏法
方法步骤： 无菌甘油的制备：80%的甘油在121℃灭菌 20min 保藏培养物的制备：活化 纯化 性能检测 制备 菌种培养物 保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 ℃保 藏 快速冷冻；乙醇-干冰 液氮 超低温保藏：-70 ℃ 一般细菌、酵母保存期为 3~5年。
3 干燥保藏法
基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉， 使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较 长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数 年至十几年之久。 砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、 麸皮保藏法