酶工程
酶工程
名词解释1. 酶工程:又叫酶技术,是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
2.自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物??3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力,这种影响被称为别构效应,具有别构效应的酶叫别构酶4.诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成,当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5.Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6. 离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1．酶的转换数：酶的转换数Kp。
又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
2．酶的催化周期：酶进行一次催化所用的时间。
3．固定化酶的比活力：指每克干固定化酶所具有的6活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。
4．抗体酶：又称催化行抗体。
是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白，要使机体具有生物催化功能，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，以及酶的高效催化能力。
是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是自然界原本不存在的。
5．端粒酶：是一种核酸核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。
其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列，在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上，使端粒延长。
6．核酶：核酸类酶。
为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。
它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应。
7．KS分段盐析：指在一定温度和PH值条件下，通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法。
8．B分段盐析：指在盐和离子强度条件下，通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法。
酶工程
酶工程：又称酶工艺，是围绕酶所特有的催化性能使其在工业、农业医疗保健事业及其其它各方面发挥作用的应用技术，主要为酶制剂的生产和应用。
酶工程的主要内容：1酶的发酵和产2酶的分离纯化3酶和细胞的固定化4酶的分子修饰5酶的发应动力学和反应器6酶电板/酶传感器7酶的应用8有机介质中的酶反应9抗体酶，人工酶和模拟酶使用微生物进行酶生产时，利用微生物的优点：1微生物的种类多，酶种丰富，菌株易诱变2微生物生长繁殖快，易提取酶3培养基价格便宜，微生物培养不受季节，地理限制4发酵生产易自动控制5易获得工程菌，提高酶产率，开发新酶培养基营养成分：碳源，氮源，无机盐，微量元素，生长因子，产酶促进剂发酵条件对产酶的影响因素：温度，PH，通气量，搅拌，泡沫，湿度提高酶产量的方法：1选育优良的产酶细胞株系2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂提高植物细胞产物产量的途径：1选择高产出的细胞株2代谢途径的调节3控制细胞生长和分化程度4诱导物或加入前体5两相培养及次生产物的释放6毛状根（发根）培养技术酶发酵动力学：研究在发酵过程中细胞生长速度，产物生成以及环境因子对这些速度的影响。
酶的分离纯化:包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中来制成酶溶液；二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。
三个基本原则：1、注意防止酶的变性失活：（1）除少数情况外，所有操作必须在低温下进行，特别是有机溶剂存在时更要特别小心；（2）大多数酶在PH<4或PH>10的条件下不稳定,故不能过酸过碱（3）酶溶液常易形成泡沫而使酶变性,故应防止泡沫的形成（4）重金属能引起酶失活,有机溶剂能使酶变性,微生物污染,蛋白质使酶变性,都必须予以防止2、酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”手段。
此外，由于酶和它的底物，抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用3、酶具有催化活性，检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当的方法和条件提供了直接依据。
酶工程名词解释
酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。
锁钥学说（酶的专一性）：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补关系诱导契合学说：酶分子的构象与底物原来并非恰当吻合，只有当底物分子与酶分子相互碰撞时，可诱导底物的构象发生变化，使其与底物配合，然后才结合形成中间络合物，进而引起底物分子发生相应的化学变化。
酶：由生物体细胞合成的具有选择性催化功能的生物大分子( 包括蛋白质和核酸）单纯酶(simple enzyme)：仅由氨基酸残基构成的酶。
结合酶(全酶)(conjugated enzyme)：由蛋白部分(酶蛋白apoenzyme)和非蛋白部分(辅助因子cofactor)组成辅酶（coenzyme）：与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。
辅基（prosthetic group）：与酶结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。
酶的活性中心：酶蛋白上只有少数氨基酸残基参与酶对底物的结合和催化，这些相关氨基酸残基在空间上比较靠近，形成一个与酶显示活性直接有关的区域，称为酶的活性中心。
必需基团：酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必须，这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失，称为必需基团。
接触残基(contact residues)：和底物直接接触，参与底物的化学转变，是活性中心的重要组成部分。
辅助残基(auxiliary residues)：使酶与底物相互结合，辅助接触残基。
结构残基（structural residues）：维持蛋白酶形成一种有规则的空间构象非贡献残基（non-contributing residues）：不参与酶的催化功能，对酶活性的显示不起作用结合基团：与底物结合的部位，决定酶的专一性；催化基团：促使底物发生化学变化的部位，决定反应的性质。
结构域：蛋白质肽链中一段较独立的具有完整、致密立体结构的区域。
酶工程重点
一、名词解释1、酶生物合成中的转录与翻译酶合成中的转录是指以核苷三磷酸为底物，以DNA链为模板，在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。
酶合成中的翻译是指以氨基酸为底物，以mRNA为模板，在酶和辅助因子的共同作用下合成蛋白质的多肽链。
2、诱导与阻遏酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程；酶合成的阻遏作用则是指加入某种物质使酶的合成中止或减缓进行的过程。
这些物质分别称为诱导物及阻遏物。
3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比）酶的回收率是指某纯化步骤后酶的总活力与该步骤前的总活力之比。
酶的纯化比是之某纯化步骤后的酶的比活力与该步骤前的比活力之比。
4、酶的变性与酶的失活酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏，酶的空间结构也受到破坏，原来有序、完整的结构变成了无序，松散的结构，失去了原有的生理功能。
酶的失活则是指酶的自身活性受损（包括辅酶、金属离子受损），失去了与底物结合的能力。
5固定化酶：是将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
6酶分子修饰，通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
7酶的共价修饰，指的是酶蛋白肽链上的一些基团与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性。
在共价修饰过程中，酶发生无活性（或低活性）与有活性（或高活性）两种形式的互变；包括磷酸化与脱磷酸化、乙酰化与脱乙酰化、甲基化与脱甲基化、腺苷化与脱腺苷化及-SH与-s-s-的互变等8酶的化学修饰，酶蛋白肽链上的某些基团，在另一种酶的催化下发生可逆的共价修饰，从而引起酶活性改变，这种调节称为酶的化学修饰。
9酶比活力，指在特定条件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数，是酶制剂纯度的指标。
10、非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学11、产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程的应用及其发展趋势
酶工程是利用生物技术方法对酶进行改造和优化，以满足工业生产的需求。
它在各个领域都有广泛的应用，包括医药、食品、化学等。
以下是几个酶工程的应用及其发展趋势：
1. 医药领域：酶被广泛应用于药物合成和制药过程中。
例如，通过酶工程可以改进药物合成的效率和产量，减少副产物的生成，提高纯度和质量。
此外，酶还可以用于制造生物药物，包括蛋白质药物、抗体药物等。
未来的发展趋势是开发更多的酶药物，并提高制药过程的效率和环保性。
2. 食品工业：酶在食品工业中有广泛的应用，包括面包、啤酒、酸奶等食品的制作过程中。
通过酶工程可以改善食品的质地、口感和保鲜性。
此外，酶还可以用于食品添加剂的开发，用于改善食品的营养价值和功能性。
未来的发展趋势是开发更多的专用酶用于食品加工，提高食品的品质和安全性。
3. 环境保护：酶工程在环境保护领域有重要的应用。
例如，酶可以用于处理工业废水和污染物，降解有机废弃物和重金属污染物。
此外，酶还可以用于制备生物柴油和生物降解塑料等可再生能源和环保材料。
未来的发展趋势是开发更多具有高效降解性和低成本的酶用于环境治理和再生资源的利用。
4. 新型酶的发现和优化：酶工程的发展趋势是发现和利用新型酶及其应用。
随着生物技术的不断发展，越来越多的新酶被发现和鉴定，可以应用于各种工业过
程。
此外，通过基因工程和代谢工程的方法，可以对酶进行定向进化和改造，提高其催化活性、稳定性和特异性。
未来的发展趋势是开发更多的新型酶和创新技术，提高工业生产的效率和可持续性。
酶学和酶工程研究今后的方向、进展、热点问题
目录
• 酶学和酶工程研究概述 • 酶学和酶工程研究的方向 • 酶学和酶工程研究的进展 • 酶学和酶工程研究的热点问题 • 未来展望与挑战
01 酶学和酶工程研究概述
酶学和酶工程定义
酶学
研究酶的特性、功能、作用机制 以及酶促反应动力学的一门科学 。
酶工程
利用酶或细胞代谢途径进行工业 化生产，以满足人类对化学品、 药物、食品和其他产品的需求。
酶的稳定性与活性调控
总结词
酶的稳定性与活性调控是酶工程中的关 键技术，对于酶的应用具有重要意义。
VS
详细描述
通过蛋白质工程和基因工程技术，可以实 现对酶的稳定性与活性调控。例如，通过 定点突变技术对酶的活性中心进行改造， 以提高其热稳定性或改变其催化特性；通 过调节基因表达水平或添加小分子调节剂 ，实现对酶活性的调控，以满足不同应用 场景的需求。
酶学和酶工程的重要性
生物催化
酶是生物催化反应的核心，能够 高效地催化各种有机化学反应， 具有高选择性、低能耗和环保的
特点。
工业生产
酶工程技术的应用能够实现工业化 生产，提高产品质量、降低成本、 减少环境污染。
生物医药
酶在生物医药领域具有广泛的应用， 如药物合成、生物诊断和治疗等。
产与应用
要点一
总结词
酶的工业化生产与应用是酶工程研究的重点领域，具有广 阔的市场前景。
要点二
详细描述
随着生物技术的不断发展，越来越多的酶被发现和分离， 并在工业生产中得到广泛应用。例如，在生物医药领域， 酶可用于药物的合成和改造；在环保领域，酶可用于污染 物的降解和治理；在食品工业领域，酶可用于食品加工和 品质改良。未来，随着酶工程技术的不断进步，酶在工业 生产中的应用将更加广泛和高效。
酶工程技术在食品生产中的应用
酶工程技术在食品生产中的应用一、酶工程介绍酶工程为一门基于生物技术的学科，是指利用生物催化剂—酶或微生物、真菌等代谢过程扩大应用范围的一种新型技术。
随着酶的广泛应用，酶工程也逐渐从理论研究转化为应用研究并逐步发展成为实用技术，目前，酶工程技术已经广泛应用于许多生物科技领域，包括食品生产领域。
二、酶在食品生产中的应用酶是一种催化剂，其作用是加速化学反应，从而促进化学反应的进行。
在食品生产领域中，酶被广泛应用于各种食品及其制品的加工和处理中，从而提高食品的品质和口感。
1. 乳制品领域乳制品是一类含有丰富营养的食品，其中最常见的就是牛奶和奶酪。
在乳制品制造过程中，酶常被用来酶解牛奶蛋白和乳糖，这样可以大大提高乳制品的品质和口感。
同时，酶还可以在制作奶酪时用来对牛奶进行发酵和凝固，从而促进奶酪的形成。
2. 面食领域面食是我国传统的主食之一，其主要成分为面粉、水和食盐。
在面食的制作过程中，酶被广泛应用于酶解面粉中的淀粉和蛋白质。
这样可以使面团更软、更有弹性，面食口感更佳。
此外，酶还可以用于改良黏性韧性面团，可塑性好，耐压力强，更耐拓展性，从而增强面团的稳定性和机械性能。
3. 果蔬领域果蔬制品是我国饮食中不可或缺的食品，其主要成分为水和膳食纤维。
在果蔬制品加工过程中，酶被广泛应用于果汁的提取和澄清、果泥的制作以及蔬菜的加工等环节。
通过使用适当的酶，可以有效地去除果汁中的浊物和悬浮物，使得果汁口感更佳。
此外，酶还可以用来防止果蔬的褐变和质变，延长果蔬的保质期。
4. 饮料领域饮料是指各种口感好的、含有丰富营养成分的饮品。
在饮料的制作过程中，酶被广泛应用于饮料的发酵、澄清和浓缩等环节。
通过使用适当的酶，可以有效地促进饮料中的发酵，使得饮料口感更加醇厚。
此外，酶还可以用来澄清饮料中的浊物和悬浮物，并进行浓缩操作，提高饮料的品质和口感。
总之，酶工程技术在食品生产领域中的应用十分广泛，通过合理选择和应用酶，可以有效提高食品的品质和口感，同时促进食品的发酵、酶解、澄清和浓缩等过程，从而实现食品加工的自动化和高效化。
酶工程技术在生物制药中的应用
酶工程技术在生物制药中的应用生物制药是以生物技术为基础，利用生物系统合成药品的过程。
与传统化学合成的药品相比，生物制药更具有针对性，效果更加显著。
虽然生物制药市场前景广阔，但是生产过程复杂，生产成本高昂，制约了生物制药产业的发展。
酶工程技术在生物制药中的应用，可以解决这一难题，有效提高了生物制药的生产效率，降低了生产成本，促进了生物制药的发展壮大。
1. 酶工程技术的基本原理酶是一种生物催化剂，具有高效、高选择性和环境友好等特点。
酶工程技术是指通过改造酶基因序列，结构和功能的方式，使得酶的催化效率、反应条件适应性、稳定性、选择性等性能指标大幅度提高。
具体的酶工程技术包括基因工程、蛋白质工程、化学修饰等。
酶工程技术是基于对酶本质的研究，通过改造酶的结构和功能，提高其催化效率和生产效率，进而实现低成本、高效高产的生产过程，从而推动生物制药产业的发展。
2. （1）表达系统的优化针对不同的生物材料，如大肠杆菌、酿酒酵母、哺乳动物细胞等，建立不同的表达系统可以有效提高目标蛋白的表达效率。
例如，在大肠杆菌表达系统中表达重组蛋白，采用适当的宏观生理策略、优化培养条件以及合适的发酵设备，可以实现高密度、连续生产，从而大幅度降低生产成本。
（2）酶的改造与增效酶的改造与增效是酶工程技术的核心内容。
通过基因工程、蛋白质工程等手段改造酶的结构和性质，使其更好地适应生产环境，从而实现催化效率的提高，进而实现生产成本的降低。
例如，利用基因工程在酿酒酵母中表达次黄嘌呤酶，可以使得次黄嘌呤的产生率增加十倍，从而产量大幅度提高，效率大大增加。
（3）酶的固定化技术酶的固定化技术是将酶固定在载体上，形成稳定的酶液，进而实现酶的长时间耐高温、耐酸碱等特性。
这种技术可以大大提高酶的使用寿命，从而提高生产效率，并且可以节约原材料和降低生产成本。
例如，在生产青霉素时，将青霉素酰化酶固定在斜坡填充床上，可以增加设备的流量和生产效率，实现了生产青霉素的连续化和大规模化。
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二、酶工程简介由酶学与化学工程、基因工程、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
（酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程）分为：化学酶工程与生物酶工程。
1.化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。
主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
2. 生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。
利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。
固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅助因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。
用微生物和动植物组织研究生物传感器。
非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。
一、酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。
国际酶学委员会（EC）规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：EC 数字.数字.数字.数字乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1第一个“1”——第1大类，即氧化还原酶类；第二个“1”——第1亚类，供氢体为CHOH；第三个“1”——第1亚亚类，受氢体为NAD+；第四个“1”——在亚亚类中的顺序号。
P酶和R酶的分类与命名有何异同？总原则相同，都是根据酶的作用底物和催化反应的类型进行分类和命名由于P酶和R酶具有不同的结构和催化特性，所以各自的分类与命名又有所区别。
显著区别之一是P酶只能催化其它分子进行反应，而R酶却可以催化酶分子本身，也可以催化其它分子进行反应，由此R酶的分类中出现了分子内催化R酶、分子间催化R酶等名称。
微生物发酵产酶是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理等方面的内容。
微生物酶的类型1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。
包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶，也指释放入培养基的酶。
2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。
二、酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。
意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。
二) 酶合成调节的类型1.诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。
诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。
2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression反馈阻遏(feedback repression)酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。
细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。
同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。
滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。
中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。
一1、植物细胞培养的特点1.提高产率2.缩短周期3.易于管理、减轻劳动强度4.提高产品质量5.其他2、培养基的特点应用最广的是MS培养基和LS培养基.MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。
LS培养基是在其基础上演变而来的。
3、培养方法：——悬浮细胞培养①细胞株的建立（外植体与愈伤组织）②扩大培养③大罐培养4、培养条件的影响与控制1.温度2.pH3.溶解氧的调控4.光照的控制5.前体的添加6.诱导子的应用二动物细胞培养与微生物培养的不同点a.动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；b.生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；c.大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长；d.对营养要求严格；e.大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验一、动物细胞培养的特点1.细胞生长速度慢（需添加抗生素）2.细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感3.反应过程成本高，产品价格贵4.细胞具有锚地依赖性5.原代细胞一般繁殖50代2、培养基1.天然培养基 2.合成培养基3.无血清培养基3、细胞培养的目的及其在研究工作中意义：目的是获得细胞产物1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。
2.便于使用各种不同的研究技术对细胞进行研究。
3.易于附加物理、化学、生物药物等实验因素。
4.能同时提供大量生物性状相似的实验材料。
三、动物细胞培养方式1、细胞培养是指离体细胞在无菌培养条件下的分裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。
2、培养动物细胞的步骤1.无菌取出目的细胞所在的组织用培养液漂洗干净；2.用无菌刀割掉多余部分并切成小组织块；3.小组织块置于解离液中离散细胞；4.低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移到培养瓶中。
3、方式：1.悬浮培养2.贴壁培养3.固定化细胞培养4、细胞株是通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化特性或特异标记的细胞群。
细胞系是由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成。
四、培养条件的影响与控制1.温度：一般控制在36.5℃.2.pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。
3.渗透压: 应与细胞内渗透压相同。
4.溶解氧：根据情况随时调节。
培养的动物细胞的存活：渗透压、水的质量、营养条件、气体条件、ph条件、温度条件、无菌条件。
分离纯化1、细胞破碎法及其原理方法：a、机械破碎（捣碎法、研磨法、匀浆法）；b 物理破碎法（温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法）；c、化学破碎法（添加有机溶剂、添加表面活性剂）；d、酶促破碎法（自溶法、外加酶制剂法）2、酶的分离纯化定义、方法、优缺点：酶的分离纯化指从微生物的发酵液或动、植物组织提取液及细胞培养液中得到高纯度、高质量的酶产品。
3、酶分离纯化的方法是根据酶的蛋白质特性而建立的。
分离方法：沉淀分离、离心分离、过滤分离、层析分离、电泳分离、萃取分离4.沉淀分离：A、盐析分离：①中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点： a. 溶解度大 b. 分离效果好 c. 不易引起变性 d. 价格便宜B、等电点沉淀分离：优点：①大多数蛋白质的pH都在偏酸性范围内②无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低③无需除掉多余酸即可进行下一步纯化. 缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活C、有机溶剂沉淀分离.优缺点：优点：①分辨率比盐析法高②沉淀不需脱盐③溶剂易蒸发，沉淀易离心。
缺点:①容易引起蛋白质变性失活②有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。
）影响有机溶剂沉淀的因素：①温度：低温（0℃）操作。
②pH值：尽可能靠近其等电点。
③离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液目的：增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，防止蛋白质变性④蛋白质浓度D.有机聚合物沉淀法1）. 作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。
2）. 沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyene glycol，简写 PEG ）多用分子量为6000～20000的 PEG。
3）. 优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。
②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。
③沉淀后有机聚合物容易去除。
5、离心分离1）．差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。
特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
优点：操作简单。
缺点：①分离效果较差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重；③沉降的颗粒受到挤压。
6、亲和层析(Affinity Chromatography)由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。
1).原理利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。
2). 基质的选择理想的基质应满足以下要求：①高度的亲水性②极低的非特异性吸附性③具有足够的化学基团④适当的多孔性⑤较好的理化稳定性可被应用的基质（载体）：琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。
3)配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。
如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。
优良配体须具备的条件：①与待纯化的物质有较强的亲和力。
②具有与基质共价结合的基团。
4）. 应用①纯化大分子物质②研究酶的结构与功能双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。
由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
1）优点：a.每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物活性物质提供了一个良好的环境；b.PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。
2）萃取原理：利用生物活性物质在双水相体系中的选择性分配。
影响物质分配的因素：a、两相的组分；b、高分子聚合物的分子质量、浓度、极性；c、两相溶液的比例；d、酶的分子质量、电荷、极性：E、温度、pH等。
3）应用胞内酶的提取和精制；除去细胞碎片，并使酶得到纯化。
超临界流体萃取1.利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
特点：超临界流体的物理特性和物质特性介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂，具有很高的萃取速度。
2.超临界流体：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。
3.临界点的概念可用临界温度和临界压力解释：临界温度：高于此温度时，无论加压多大也不能使气体液化。
临界压力：在临界温度下，液化气体所需要的压力。
4.作为萃取剂的超临界流体必须具备的条件：良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；临界温度不能过高或过低，最好在室温附近或操作温度附近；操作温度应低于被萃取溶质的分解或变质温度；临界压力不能过高，可节约压缩动力费；选择性要好，容易制得高纯度的制品；溶解度要高，可以减少溶剂的循环量；萃取剂要容易获得，价格要便宜。