小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立
小鼠成纤维细胞原代培养.docx
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2 •熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3•了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
小鼠间充质干细胞一、细胞复苏和接种1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
解剖小白鼠实验
实验步骤
动 物 细 胞 原 代 培 养 过 程 图
方法与步骤
（1）动物拉椎处死 （2）取肝及剪碎：剖开腹部，将肝脏取出，放
入小培养皿中，用PBS液洗涤1次；将肝剪成 1mm大小的块，再用PBS液洗涤2次，直到液体 澄清。
（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的 组织放入试管内，加入的0.25％胰蛋白酶 液，完全没过组织，置37℃水浴中消化 20 ～ 30min，每隔10min摇动一次，直到 组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白 色为止。取出试管，吸去胰蛋白酶液，加 入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块， 使其分散成细胞悬液，取上清液至另一试 管中。
倒置显微镜
自动双重纯水蒸馏器 纯水仪
培养板
培养瓶
实验材料
2月龄的小鼠
实验试剂
（1） 1640-RPMI培养液 （2） 小牛血清 （3） 青、链霉素 （4） PBS液 （5） 5％NaHCO3 （6） 75％酒精
实验步骤
一、培养前的准备工作
（1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 紫外线消毒 （4） 洗手和着装 （5） 进入无菌室
滤器
滤器工作原理
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。
使用CO2培养箱应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松， 以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90℃ ，14 h)。
③箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以 保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
（4）观察与计数：从细胞悬液中取出1 滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的 数目。看到球型的细胞，证明消化下来 细胞，实验成功。
作业:
1.在细胞培养过程中如何防止污染?
动物细胞原代培养
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• 3．实验器材
• 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、 水浴锅、离心机、眼科剪、眼科镊、移液 器及枪头、培养皿、烧杯、细胞培养瓶、 吸管、离心管、血球计数板、载玻片、盖 玻片、200目不锈钢筛网、酒精灯、75％酒 精棉球、记号笔等。
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四、实验方法与步骤
• 1．取1只大鼠，颈椎脱臼法处死，浸入75%乙醇消毒。 • 2. 将小鼠置于超净台中的大培养皿中，背部朝上，用
细胞被污染。 • 3. 在CO2培养箱中，若选用的培养瓶螺旋盖不带有滤膜，
则应将瓶盖拧松，保持通气状பைடு நூலகம்。 • 4．实验过程中，实验人员要严格遵守无菌操作流程。
动作要轻柔，安装吸头、打开或封闭瓶口等操作应在火 焰近处并经过烧灼后进行。操作时，避免讲话、咳嗽， 以防唾沫或呼出气流造成污染。取用液体前不宜过早开 盖，使用完毕应立即封闭瓶口。吸取液体或细胞悬液时， 应专管专用，一旦吸管前端接触了手或其他污染物时应 更换，吸出后残留的液体不可重新加入原瓶，以防污染 扩大或造成培养物间的交叉污染。 • 5. 实验结束后，应将实验废液或废物及时移出无菌室， 并用消毒水擦拭超净台，保证清洁。
实验一 动物细胞原代培养
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• 一、实验目的 • 1．掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 • 2. 掌握动物细胞原代培养的基本方法。
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• 二、实验原理 • 原代培养( primary culture )是指取自体内的
新鲜组织、细胞，在体外条件下生长至传 代之前细胞培养阶段，是细胞培养的最初 和必经阶段。原代培养方法主要有组织块 贴壁培养法和分散细胞培养法。
• 组织块贴壁培养法是将切成小块的组织贴 附在适宜的支持物上，细胞从组织块边缘 游离、生长，形成单层细胞即为原代培养 细胞。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。
用滤器过滤除菌。
④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数陈素君200900140007实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。
学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。
初步掌握无菌操作方法。
学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。
因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。
细胞培养分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。
要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。
细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。
细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。
实验用品：一、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。
上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板二、试剂PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝三、小白鼠实验方法：1. 细胞的原代培养1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。
AttractinmRNA和Attractin蛋白在原代培养小鼠Leydig细胞的表达
光细胞化学结果显示 Ａ ｔ ｒ ｎ 蛋 白在小鼠睾丸 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ 细胞胞膜和胞浆表达。结论 ： 原代培养小 鼠睾丸 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细胞 表达 Ａ ｔ ｍ ｍ Ｒ Ｎ Ａ和
Ａｔ ｍ 蛋 白， Ａｔ ｒ ｎ蛋 白定位于细胞胞膜和胞浆 。
关 键 词 ： 小 鼠 ； Ａｔ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ； Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细 胞 ； 睾 酮
大鼠睾丸间质 和精 曲小管 中均有分 布 ， 而且在 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细胞的 表 达明显强于睾丸生精细胞＿ ５ ］ ， 推测 Ａｔ ｒ ｎ在调节 睾酮分 泌方
面 可 能起 着 一 定 的 作 用 。
１ 材 料 与 方 法
Ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ ｌ 之上 ， ４ ℃８ ０ ０ ｇ离心 ３ ０ ｍｉ ｎ 。收集第 ３细胞带 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ
度 。 １ ． ３ ． ２ Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ检 测 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细 胞 Ａｔ ｒ ｎ ｍＲ ＮＡ 表 达 分 离
纯化 的小 鼠 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细胞 经 ２ ４ ｈ培养 后 ， 用 Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 提 取细胞 总
Ｒ Ｎ Ａ， 按试 剂盒说 明书进行 Ｒ Ｔ反应 ， 以２ １ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 为模板 ，
ｄ ０ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ｊ ． ｉ ｓ ｓ Ｉ Ｉ ．１ ０ ０ ４ － ４ ３ ３ ７ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ６ ． ０ １ ６
睾丸 Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ细 胞具有分 泌类 固醇 激素的能力 ， 分 泌的雄 激素 有促 进精 子发生 和成 熟 ， 刺 激雄 性生 殖器 官 的发 育 与分 化并 维持 其机能以及维 持第二 性征 和性 功能 等作用 。Ｌ ｅ ｙ ｄ ｉ ｇ
化完毕 ， 立 即加入不含 胶原酶 的 Ｄ ＭＥ Ｍ／ Ｆ １ ２ 。静置 后取细胞 悬液用 ２ ０ ０目筛 网过滤 ， 滤液 １ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ离心 １ ０ ｍｉ ｎ （ ４ ℃） ， 弃上 清 。细胞沉淀 用 Ｄ ＭＥ Ｍ／ Ｆ １ ２重悬 混 匀 ， 接 种于 细胞 培 养瓶 中。３ ７ ℃培养 箱 内孵 育 １ ｈ 。吸 出细胞 悬 液 ， 缓 慢 加 于 梯度