猪四倍体胚胎制作及早期发育初步研究
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１
８（３）：２９５—２９８．
【２】郭志勤等主编．家畜胚胎工程【Ｍ】．长春：吉林科学科技出版社，１９９４．１８７．１８８． 【３】吴耀民，窦忠英．小鼠胚胎嵌合的研究川．西北农业大学学报，１９９３．２１（２）：７７．８０． 【４】Ｐｅｔｒａ Ｗｉｔｈ
Ｋ．ｅｔ ａ１．Ａ Ｍｏｒｅ Ｃｏｓｔ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ
材料与方法
本实验采用电融合法制作猪四倍体胚胎，通过摸索３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０Ｖ／ｍｍ 等不同的脉冲电压强度，获得猪四胚胎并对检测其早期发育能力。 结果 据此，本实验为制作猪四倍体胚胎，在脉冲宽度为３０９ｓ下，分别用７种不同脉冲电压强 度对猪２－Ｃｅｌｌ胚胎进行电刺激融合，结果显示随脉冲电压强度的增大，融合率逐渐增加但胚 胎死亡率显著上升，得出电融合的较佳条件是３０郎．９０ Ｖ／ｎｕｎ。进一步通过荧光原位杂交技术
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中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第卜六届学术研讨会论文集
猪四倍体胚胎制作及早期发育初步研究
何文腾，焦明霞，石永乾，周洋，孔庆然，尹智，刘忠华’ （东北农业大学， 哈尔滨黑龙江１５００３０）
引言 哺乳动物的四倍体（４ｎ）在自然界中是一种染色体畸型，其自然发生率非常低。小鼠的４ｎ 胚胎可以着床，部分可发育到体节期有些甚至可以发育直到出生，但胎儿一般为畸型。由于 ２ｎ／４ｎ嵌合体胚胎在发育过程中，４ｎ来源的细胞主要分布在胚外组织（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）， 如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜和胎盘等，几乎不参与胎儿本身的形成。因此，２ｎ／４ｎ嵌合体胚 胎在胚胎发育调控机理的研究、基因缺陷动物模型的建立和动物克隆方面有着特殊的应用价 值。一般，四倍体胚胎能通过抑制早期胚胎的卵裂或者卵裂球的融合来实现。抑制早期胚胎 卵裂是采用只抑制胞质分裂，而不抑制核分裂的化学药物处理受精卵，使染色体加倍，如秋 水仙碱和细胞松弛素Ｂ等的应用。此外，卵裂球融合的方法主要有聚乙二醇诱导法、灭活的 仙台病毒诱导法和电刺激融合法。电脉冲刺激使２－Ｃｅｌｌ胚胎融合是制作四倍体胚胎方法中最 高效的方法，广泛应用于一系列的物种中包括小鼠、兔、牛和大鼠。
（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）在囊胚期证明融合后的胚胎为四倍体。四倍体的囊胚
发育率为（２８．３８±２．４１％）与二倍体囊胚发育率（３６．３０－士８．５０％）差异不显著（Ｐ＞０．０５），但囊 胚细胞数显著减少（尸．＜０．０５），而且四倍体囊胚的内细胞团细胞数更少。另外，我们发现，在 致密化前，四倍胚胎发育时程晚于二倍体胚胎，但是发生致密化的时间和囊胚形成时间相一 致。 讨论 四倍体胚胎的研制是嵌合体研究和干细胞多能性的验证的基础，对胚胎发育机理的研究 起到十分重要的作用。本研究我们发现，脉冲宽度３０邮，脉冲电压强度９０ Ｖ／ｍｍ为猪２－Ｃｅｌｌ 胚胎融合的较佳条件，为猪四倍体胚胎的研究和应用奠定基础。 参考文献 【Ｉ】孙兴参，谭景和，刘忠华等．小鼠胚胎聚合法的几个技术环节【Ｊ】．中国兽医学报，１９９８．
Ｈｉ曲Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ
Ｇｅｒｍ－Ｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ Ｅｍｂｒｙｏｓ
Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｖｉａ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ．ｇｌｌ，ａｎｄ ８－Ｃｅｌｌ
２０１０．（４８）：３９４－３９９．
‘通讯作者：刘忠华，Ｅ－ｍａｉｈｌｉｕ０８６＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ
５２
猪四倍体胚胎制作及早期发育初步研究
作者： 作者单位： 何文腾， 焦明霞， 石永乾， 周洋， 孔庆然， 尹智， 刘忠华 东北农业大学， 哈尔滨黑龙江150030
本文链接：/Conference_7715244.aspx
８（３）：２９５—２９８．
【２】郭志勤等主编．家畜胚胎工程【Ｍ】．长春：吉林科学科技出版社，１９９４．１８７．１８８． 【３】吴耀民，窦忠英．小鼠胚胎嵌合的研究川．西北农业大学学报，１９９３．２１（２）：７７．８０． 【４】Ｐｅｔｒａ Ｗｉｔｈ
Ｋ．ｅｔ ａ１．Ａ Ｍｏｒｅ Ｃｏｓｔ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ
材料与方法
本实验采用电融合法制作猪四倍体胚胎，通过摸索３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０Ｖ／ｍｍ 等不同的脉冲电压强度，获得猪四胚胎并对检测其早期发育能力。 结果 据此，本实验为制作猪四倍体胚胎，在脉冲宽度为３０９ｓ下，分别用７种不同脉冲电压强 度对猪２－Ｃｅｌｌ胚胎进行电刺激融合，结果显示随脉冲电压强度的增大，融合率逐渐增加但胚 胎死亡率显著上升，得出电融合的较佳条件是３０郎．９０ Ｖ／ｎｕｎ。进一步通过荧光原位杂交技术
！。一．．——＝＝＝；；＝＝＝＝＝＝＝！＝＝＝＝＝＝＝＝一一一一一—Ｉｍ量！！！！皇曼詈皇曼！暑！皇！！曼苎
中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第卜六届学术研讨会论文集
猪四倍体胚胎制作及早期发育初步研究
何文腾，焦明霞，石永乾，周洋，孔庆然，尹智，刘忠华’ （东北农业大学， 哈尔滨黑龙江１５００３０）
引言 哺乳动物的四倍体（４ｎ）在自然界中是一种染色体畸型，其自然发生率非常低。小鼠的４ｎ 胚胎可以着床，部分可发育到体节期有些甚至可以发育直到出生，但胎儿一般为畸型。由于 ２ｎ／４ｎ嵌合体胚胎在发育过程中，４ｎ来源的细胞主要分布在胚外组织（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ）， 如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜和胎盘等，几乎不参与胎儿本身的形成。因此，２ｎ／４ｎ嵌合体胚 胎在胚胎发育调控机理的研究、基因缺陷动物模型的建立和动物克隆方面有着特殊的应用价 值。一般，四倍体胚胎能通过抑制早期胚胎的卵裂或者卵裂球的融合来实现。抑制早期胚胎 卵裂是采用只抑制胞质分裂，而不抑制核分裂的化学药物处理受精卵，使染色体加倍，如秋 水仙碱和细胞松弛素Ｂ等的应用。此外，卵裂球融合的方法主要有聚乙二醇诱导法、灭活的 仙台病毒诱导法和电刺激融合法。电脉冲刺激使２－Ｃｅｌｌ胚胎融合是制作四倍体胚胎方法中最 高效的方法，广泛应用于一系列的物种中包括小鼠、兔、牛和大鼠。
（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）在囊胚期证明融合后的胚胎为四倍体。四倍体的囊胚
发育率为（２８．３８±２．４１％）与二倍体囊胚发育率（３６．３０－士８．５０％）差异不显著（Ｐ＞０．０５），但囊 胚细胞数显著减少（尸．＜０．０５），而且四倍体囊胚的内细胞团细胞数更少。另外，我们发现，在 致密化前，四倍胚胎发育时程晚于二倍体胚胎，但是发生致密化的时间和囊胚形成时间相一 致。 讨论 四倍体胚胎的研制是嵌合体研究和干细胞多能性的验证的基础，对胚胎发育机理的研究 起到十分重要的作用。本研究我们发现，脉冲宽度３０邮，脉冲电压强度９０ Ｖ／ｍｍ为猪２－Ｃｅｌｌ 胚胎融合的较佳条件，为猪四倍体胚胎的研究和应用奠定基础。 参考文献 【Ｉ】孙兴参，谭景和，刘忠华等．小鼠胚胎聚合法的几个技术环节【Ｊ】．中国兽医学报，１９９８．
Ｈｉ曲Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ
Ｇｅｒｍ－Ｌｉｎｅ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ Ｅｍｂｒｙｏｓ
Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｖｉａ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ．ｇｌｌ，ａｎｄ ８－Ｃｅｌｌ
２０１０．（４８）：３９４－３９９．
‘通讯作者：刘忠华，Ｅ－ｍａｉｈｌｉｕ０８６＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ
５２
猪四倍体胚胎制作及早期发育初步研究
作者： 作者单位： 何文腾， 焦明霞， 石永乾， 周洋， 孔庆然， 尹智， 刘忠华 东北农业大学， 哈尔滨黑龙江150030
本文链接：/Conference_7715244.aspx