人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤
胃癌腹腔种植转移模型小肠电生理变化及哇巴因干预效应

1 . 1 材料 及设 备
开腹 腔 , 距 离空 肠始 端 1 c m插 埋一 根铂 丝 电极 至浆
模下 肌层 , 不 能穿破 肠壁 。同样方 法 , 距 离空 肠始端 2 c m处插 埋 另 一 电极 , 使 两根 电极 在 同一 轴 线 上 。 设 定 参数 为 : 生 物 电模式 , 2 0 0 p , V, 1 . 0 s / d i v , 3 0 H z 。
清液 , 注 人到裸 鼠腹腔 内 , 按 摩腹 部 2 mi n 。
动减 慢 有关 , 用 哇 巴 因可 改 善 或提 高 小 肠 的运 动 功 能 。哇 巴 因 可 以使 络 氨 酸 蛋 白磷 酸 化 , 由此 激 活
R A S , 进 一步 激活 丝裂 原活 化 的蛋 白激 酶 ( MA P K s ) ,
比妥 钠麻 醉 ( 4 0 mg / k g ) , 上 腹 正 中切 口 1 . 5 c m, 打
缩_ 4 ] 。本研 究模 拟 胃癌 腹 腔 种 植模 型 , 再 用 哇 巴 因 进行 干 预 , 检测 小 肠 的电生 理改 变 , 寻找 胃癌 晚期治 疗 的新策 略 , 提高 胃癌 晚期 患者 的生存 质量 。
第 2期
赵宝 山 , 等. 胃癌腹腔种植转移模型小肠 电生理变化及哇 巴因干预效应
l 1 3
o f i n t r a — a b d o mi n a l i mp l a n t a t i o n c a n r e d u c e t h e e l e c t i r c a l a c t i v i t y o f t h e s ma l l i n t e s t i n e ,a n d
白组 5只 , 模 型组 8只 , 用药 组 2 4只 , S G C 7 9 0 1胃癌 细胞 培 养液 上 清 液 组 4只 ( 以下简称 : 培养液组 ) 。
裸鼠成瘤实验方法

裸⿏成瘤实验⽅法肿瘤细胞有良性和恶性之分;癌细胞则是恶性,是会扩散的细胞。
肿瘤细胞包含癌细胞,它们共同特点是从基因⽔平上失控的、能⽆限增殖的细胞。
癌细胞有三个显著的基本特征即:不死性、迁移性和失去接触抑制。
常规较容易成瘤的细胞Hep-G2(肝癌),Hep2(喉癌),NCI-H460(⼤细胞肺癌), SK-OV-3(卵巢癌),MCF-7(乳腺癌)SKBR3, A375/B16-F10(⼈⿊⾊素瘤细胞),SGC7901 ⼈胃肿瘤细胞,CNE(⿐咽癌),H1299(肺癌), SPC-A-1(肺腺癌), HT-29/HCT116(结肠癌),BEL-7402(肝癌),MDA-MB-231 乳腺癌, CT26 (⼩⿏结肠癌细胞),U87 (⼈胶质瘤细胞), MGC-803(⼈胃癌细胞),PC-3 (⼈前列腺癌细胞)。
裸⿏的选择实验室常⽤的是BALB/c-nu裸⼩⿏ ,随着裸⼩⿏年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸⿏体内正常T细胞会增加,故接种肿瘤实验⼀般采⽤4--6周龄的裸⿏。
裸⿏成瘤实验技巧1、细胞的状态是成瘤实验的关键,所以细胞⽣长状态⼀定要好,取处于对数⽣长期的细胞,细胞达80-90%左右密度为宜。
收集细胞前⼀天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后⽤预冷的PBS洗两遍,⽬的为去除细胞中残余的⾎清。
3、⽤PBS或者⽆⾎清培养基吹打细胞沉淀⾄合适的浓度,⼀般⽪下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/⽀,接种体积为0.1-0.2ml,因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml,如若有条件的实验室,也可以加基质胶以加速瘤块的⽣成,基质胶与PBS或⽆⾎清的⽐列为1:1。
4、细胞消化后应尽快接种到裸⿏⽪下,⼀般尽量在半⼩时内完成(如果接种量⼤,可以分批接种),途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性。
5、选择的裸⿏⼀般在4-6周龄,体重16-18g左右,种植部位选择⾎供丰富区域,如腋窝中后部。
肿瘤移植(TT)小鼠模型具体方法及步骤

肿瘤移植(TT)小鼠模型具体方法及步骤原型物种人来源黑色素瘤B16细胞导致的肿瘤肝转移及肺转移模式动物品系SPF级C57BL/6小鼠,健康,雄性,4~6W,体重为18g~20g。
实验分组实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。
实验周期4-6 weeks建模方法恶性黑色素瘤(malignant melanoma MM)的发病率较低, 但恶性度高, 转移早而广泛,且对常规放疗有较强抗性,临床治疗颇为棘手,目前尚无有效的治疗方法,其常规治疗主要有免疫治疗、化疗、生物治疗、近距放射疗法和外束放射疗法等。
近年恶性黑素瘤发病率和死亡率明显上升,肿瘤侵袭及转移是其治疗失败的主要原因,很大一部分肿瘤病人在初治时已有微小的或潜在的转移病灶。
为了能彻底治愈癌症,控制肿瘤侵袭和转移是治疗的关键。
黑色素瘤B16细胞株是生长在C57BL/6小鼠耳根部的自发性肿瘤,C57BL/6小鼠的B16移植瘤和转移瘤模型是肿瘤研究的常用模型之一。
小鼠成瘤实验:取对数生长的细胞,胰酶消化后培养基重悬收集细胞,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度备用。
选用C57BL/6J 小鼠建立B16 细胞肿瘤转移模型,每组10 只。
试验组小鼠尾静脉注射浓度为5×10 6 /L 的B16 细胞悬液0.1ml,每组于接种细胞次日起腹腔注射药物,10 日后改为隔日注射一次。
于第21天,处死动物,取肝脏及肺组织,解剖镜下计数转移的结节数量,数码相机拍照,并对各组小鼠肺转移结节的数目进行统计学分析。
应用肿瘤转移疾病模型模型评价各组小鼠尾静脉注射接种肿瘤细胞后,生长良好,体重无明显变化,组间无明显差异。
第21 天时处死小鼠,取肝脏及肺组织,解剖镜下观察,可发现肝脏及肺组织有明显转移的结节。
解剖镜下计数转移的结节数量,可见给药组小鼠肝脏及肺结节数目明显低于阴性对照组。
取材:1.实验结束后每组取肝组织、肺组织和肿瘤组织,每个组织从瘤体中央分为2份,一份置于甲醛固定;另一份液氮冷冻置于-80度保存,用于分子生物学和WB检测等等。
青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进度

青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用研究进度青蒿素是从菊科植物黄花蒿中提取别离出的一种具有过氧基团的倍半萜内酯类化合物。
以往研究发现其是治疗疟疾的有效药物,后续抗血吸虫、抗病毒、抗心律失常等用途也相继被发现。
近年来,据国内外研究报道青蒿素在抗炎、抗孕、抗肿瘤等方面也具有较好效果。
尤其在抗肿瘤方面,青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞都有显著抑制或杀伤作用,且耐受性好,不良反响少。
1 青蒿素及其衍生物对肝癌的抗肿瘤作用近年来研究发现,青蒿素及其衍生物对肝癌HepG2 细胞、SMMC-7721 细胞、H22 细胞均有明显抑制作用。
黄俊玲等取处于对数生长期的HepG2 细胞进行实验,分别给予不同浓度的青蒿素,采用MTT 法检测青蒿素对HepG2 细胞作用后的增殖抑制率,用流式细胞术检测药物作用HepG2后的细胞周期及细胞凋亡,结果显示青蒿素对HepG2 具有增殖抑制作用,其抑制率呈剂量、时间依赖效应,可使HepG2 细胞周期阻滞于G0 /S 期,并诱导肝癌细胞发生凋亡。
潘雷等将人肝癌细胞株SMMC-7721 接种于小鼠腰部皮下,制成小鼠荷瘤动物模型,给予青蒿素对荷瘤小鼠进行干预,观察小鼠肿瘤的体积变化,并用TUNEL 法检查肿瘤细胞的凋亡。
结果显示,青蒿素对SMMC-7721 具有明显肿瘤抑制作用和促进肿瘤细胞凋亡的作用。
盛庆寿等研究不同剂量双氢青蒿素含药血清对SMMC-7721 细胞的作用,结果显示双氢青蒿素含药血清浓度在30 mg /kg 以上时具有明显抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用。
邓小荣等取生长状态良好的小鼠肝癌H22 细胞为实验对象,采用台盼蓝染液染色细胞计数法检测不同浓度青蒿素对H22 的细胞活力和生长曲线的影响,并利用MTT 比色法对处于对数生长期的H22 细胞进行细胞生长抑制实验,结果说明青蒿素能有效抑制H22 的细胞活力、细胞增殖,并能影响其生长曲线。
青蒿素抗肝癌细胞的作用机制与Fe2 + 浓度有关。
健脾解毒中药胃肠安对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长及ERK1_2表达作用_沈克平

人才项目( PWZ2008 - 20 - 104) 作者简介:沈克平( 1963 - ) ,男,教授、主任医师,硕士研究生导师,研究
方向: 消化道肿瘤研究。
在胃癌治疗中起了一定作用,胃肠安是上海市名中医 邱佳信教授 依 据 中 医 学 理 论 及 多 年 临 床 经 验 创 制 而 成,主张“脾虚贯穿疾病始终,治瘤应从健脾着手”[3]。 本实验在人胃癌 SGC - 7901 裸小鼠移植瘤模型中,观 察胃肠安对胃癌生长、转移作用及对 p - ERK1 /2 蛋白
[14] Korzeniewski C,Callewaert DM. An enzyme - release assay for natural cytotoxicity[J]. J Immunol Methods,1983,64( 3) : 313 - 320.
[15] 蔡晓波,陆伦根. 谷胱甘肽过氧化物酶与肝脏疾病[J]. 世界华人 消化杂志,2009,17( 32) : 3279 - 3282.
使用 SPSS 15. 0 进行统计。计量资料以 x珋± s 表 示,采用完全随机方差分析 LSD - t 检验,P < 0. 05 为
差异有统计学意义。 2结果 2. 1 胃肠安对人胃癌裸小鼠皮பைடு நூலகம்移植瘤模型肿瘤体 积变化的影响
结果如图 1 所示,肿瘤体积随时间延长逐渐增大, 胃肠安治疗后前 28 天肿瘤体积增长程度与对照组相 似,28 天后肿瘤体积增长减慢,5 - Fu 组治疗后体积一 直增长较为缓慢。 2. 2 胃肠安对人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型肿瘤质量 的影响
Key words: Chinese Compound Formula; Weichangan Decoction; gastric cancer; ERK1 /2
裸鼠抑制肿瘤瘤实验具体步骤及方法

动物体内抑瘤实验具体步骤及方法活体生物发光成像技术的原理:在小型哺乳动物体内利用报告基因(荧光素酶基因)表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+存在的条件下消耗ATP 发生氧化还原反应,将部分化学能转化为可见光能释放。
因此只有在活细胞内才会发生发光现象。
并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
一、材料准备1. 动物:裸鼠9 只,6~8周龄,雄性;C57小鼠24 只,6~8 周龄,雄性;动物均为自由饮水采食。
2. 细胞:MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,使用荧光素酶基因标记。
方法:用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞,共转染的还有选择性标记基因,从而保证转染细胞的稳定性,形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株;B16 黑色素瘤细胞。
二、实验步骤1. 紫杉醇混合胶束的制备(1)将适量紫杉醇溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.(2)加入适当比例的磷脂和表面活性剂A 进行充分混合,制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂,载药浓度为6 g/L。
(3)临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。
制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。
2. MDA-MB-231人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立(1)培养荧光素酶基因标记的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,使用DMEM 培养基(添加10%胎牛血清),37 ℃、5% CO2 培养箱中培养,每3天传代1次。
(2)待细胞密度为80%~90%、细胞总量达到实验所需要求时,使用胰酶消化,收集于PBS溶液重悬。
(3)如有需要,在细胞培养一定时间后,应使用抗生素Zeocin进行抗性筛选,保证荧光素酶基因的表达量足够。
(4)收集细胞,使用PBS稀释至细胞数1.5×108/mL,接种于裸鼠腋下,每只裸鼠的接种量为0.1 mL 。
3. 动物活体成像检测(1)接种后将裸鼠随机分为3组,分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组,每组3只。
裸大鼠人高转移肝癌皮下和原位移植模型的建立

表 1皮下移植裸 大鼠体重和瘤体积 变化
1 . 病理取材及形态学观察 处死裸大 鼠,肉眼 .2 6 大 体 观 察 皮 下 和 原位 移 植 瘤 生长 部 位 、体 积 、质
地 、 活 动 度 、 有 无 胸 腹 水 , 肝 、肺 、 肾 、脾 等
雌雄 兼用 , 1 0g左 右 。 由复旦 大 学 附属 公 共卫 生 0 临床 中心提 供 [C S XK( )0 50 0 ] 沪 2 0 .0 1( 从美 国 C als hr e
Rvr aoaois ie b rtr 引进) L e 。裸 大 鼠饲 养于 复旦大 学 附 属公共 卫 生临床 中心 动物 中心 S F屏 障系统 中 ,饲 P 以 高压灭 菌 水和 辐照 饲 料 ,饲 养 室相对 湿 度(0± 5 1) %,温 度 ( 24 2 ℃ ,光 照 1 0 2 - ) h明暗 交 替 。 2
1 35 5 .4± 16 .9
l 14 5 . 4± 18 .8
液化 ,有弹性 的实性瘤体 ,4周左右 时瘤块增大 ,
实验动物与 比较医学 L b rtr i ln o aaie d i a oa y maa d mprt i n o An C v Me c e
2 结果
21 皮 下移 植模 型 .表 2 原 位 移 植 裸 大 鼠 体 重 变 化 后时间 / 周 体重 儋
1 08 0 .9± 1 3 . 7 1 46 1 . 1± 16 .6
211 裸 大 鼠及 皮下瘤 的生 长情 况 ..
连续观 察皮下
1 63 ± 12 2 .8 .0
() b ,依据 公 式 V= b 2计算 肿 瘤体 积 ; aV 原位 移植 和大 小 , 以腹部 出现可 触及 的实体 性包块 作 为成瘤 标 志 。 当裸 大 鼠出现 明 显 消瘦 、 弓背 、精 神萎 靡 等衰竭体征时结束实验 。
葡萄球菌肠毒素B对实验性原位接种胃癌抑瘤作用的研究

L U Mio JN X a — n , n, t l I a , I i o mi g HE Ya e a
( eatet fP tooy H ri Me i l nvrt, ab 5 0 1 C i ) D p r n o ah l , abn d a U i sy H ri 10 8 , hn m g ei n a
o g a c a gsm t ai o t t i t npa t m r i em c eeo sre . eut ①T 0 l i l h ne ea s f r oo c r sl e t os nt i w r be d R sI oc b s oh p a n du h e v S w
t mo e l i e r a l at o g tc ud d sr y te n n c nc rts u r u d c r i o u rc lsk l d g e t l y, l u h i o l e to h o — a e is e ao n ac n ma, n v n la h a d e e e d
S u fa t-u o fe to t p o o a n e o o i b r ho o i t dy o n it m r e c fs a hy c c le t r t x n B y o t t p c t a s a e m o s o e fg s rc c r i m a r n pl ntd u e m d lo a t i a c no
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第4 2卷
第 4期
哈 尔 滨 医 科 大学 学 报
J OURNAL OF HARB N ME C I DI AL UNI VERS TY I
Vo . 2. . 1 4 No 4
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人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤
以反复接种传代于裸鼠皮下的SGC-7901 人胃癌细胞株建立的移植瘤组织块为材料,将其用生物吻合OB胶原位粘贴于裸鼠胃壁,并与传统"胃囊法"、”皮下移植法“比较观察移植肿瘤的生长情况、移植成功率和自发转移的发生率。
一、实验材料准备
6周龄BALB/c 无胸腺裸鼠24只,雌雄兼用,体重18-20 g。
传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株,本实验肿瘤组织为第6代。
二、人胃癌SGC-7901组织块制备
1. 无菌条件下取人胃腺癌SGC-7901J标本中的组织数块,直径约0.5-1.0 cm,去除坏死组织,漂洗,滤纸吸干后置RPMI-1640液中剪成1-2 mm 的小块,制备成单细胞悬液(5×108-
2.5×1011 /L)。
2. 置于18号套管针针口,碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下,局部接种,逐日观察,待肿瘤长至1.0-1.5 cm时处死裸鼠,取出肿瘤组织按上述方法传代,传代瘤鼠与实验用鼠同为BALB/c无胸腺裸鼠,本组瘤源为第6代。
三、模型的建立
1. 将24只健康裸鼠随机分为3 组,即皮下移植组、胃囊法组和OB胶粘贴组,每组8只。
2. 将传代瘤鼠拉颈处死,无菌操作,从腋部皮下剥取肿瘤组织,剔除纤维包膜,切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织,切成1 mm ×1 mm×1 mm小块,置于生理盐水中备用。
3. 皮下移植组:将切好的瘤块置于18号套管针针口,碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下,局部接种。
4. 胃囊法组:腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠,无菌条件下沿左侧正中旁线切开,刀口约1.5 cm,小心暴露腹膜、胃壁,在胃壁缝制粘膜小囊,将肿瘤组织块包埋于其中,缝合关腹。
5. OB胶粘贴组:腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠,常规消毒皮肤,沿左侧正中旁线切开,刀口约1.5 cm处小心暴露腹膜、胃壁,用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆肌层,以出血为度,将肿瘤组织用医用吻合OB胶粘合在破损处,用0号线缝合腹膜腹壁,关腹。
四、处死动物及观察移植瘤转移情况
1. 12 周后,裸鼠出现消瘦、活动受限、倦呆乏力等衰竭症状,部分裸鼠瘤体突出至皮下,呈蛙形腹,将裸鼠拉颈处死,肉眼观察8 组移植瘤的局部生长、腹水、邻近淋巴结以及远处脏器转移情况。
2. 解剖动物,全面探查胸腹腔,取出原位移植瘤、肿大淋结、肝、脾、胰、肺,并测量
各组移植瘤的体积,同时用电子天平称取瘤重。
3. 标本用10%甲醛固定、切片、染色后进行病理组织学检查。
五、人胃腺癌SGC-7901细胞染色体标本制备
1. 在无菌条件下,剪取部分原位移植瘤组织,放于无血清RPMI-1640培养液中,进行原代细胞培养。
2. 待细胞生长旺盛并长成单层时即可进行第一次传代,并制作染色体标本。
3. 在40倍光镜下观察,并用显微摄影机摄下一个细胞染色体的中期分裂相。
六、统计学方法
所有统计应用SAS 6.12软件包,定量资料采用t检验,必要时采用单因素方差分析,定性资料采用x2 检验。
注意事项
人癌转移模型的原位移植战略是目前国际上普遍接受的研究人癌侵袭和转移的重要理论基础,理想的胃肠肿瘤动物模型应该具备以下条件:(1)致癌方法简单、易行;(2)经济、快速;(3)指标客观、明确;(4)对癌变器官的特异性高;(5)重复性好;(6)诱发肿瘤的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化学改变等应与人体肿瘤相类似。
种植于裸鼠皮下生长的人胃癌组织,在形态、功能、生化特征等方面与人胃癌十分相似,但因其周围有结缔组织包裹,即便是选用高转移性的肿瘤,也仅仅形成局部肿瘤,限制了其浸润及转移。
原位移植模型则能够克服这一限制。
结果表明移植瘤发生局部浸润、淋巴结转移及远处它脏转移,且转移率较高,部分有腹水形成,而且较好地保持了原始肿瘤的组织结构和细胞形态、功能、生化特征,转移的发展也具有与临床胃癌患者基本一致的规律,与皮下移植模型比较具有显著优越性。
许多学者认为肿瘤转移不仅与其生长环境有关(土壤学说),还取决于其本身的转移潜能(种子学说),即依赖于肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与间质、肿瘤细胞与宿主之间的相互作用,激活细胞分泌蛋白降解酶类,降解基底膜,此过程还能诱导肿瘤细胞血管产生,通过信号转导系统激活细胞的移动性,这些都是肿瘤浸润转移所必须的过程。
本实验采用的OB胶粘贴法造模仍然沿用当前公认的完整组织块法建立类似于人胃癌临床转移的原位移植裸鼠模型,既有原位移植的优点,又保持癌组织的完整结构,避免了细胞表面结构遭到破坏而导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性、恶性程度的改变,能更好地模拟临床肿瘤发生与发展的过程;同时将手术方法经过适当的改进,用OB 胶粘贴取代了传统的胃囊法,操作相对简便,手术时间大大缩短,对裸鼠的创伤小,术中出血少,术后恢复相对较快,故活率明显提高;另外选用胃大弯处,因其近胃窦旁血管稠密,血液供应丰富,肿瘤生长迅速,多数可以出现幽门梗阻、腹水、远处脏器转移及恶病质等表现,能够较好地重现胃癌的临床转移过程,为人类胃癌的生长、转移机制及抗转移治疗方面的研究提供了一种较理想的动物模型;本方法操作简便,不需专业人士造模,费用相对较低,有推广的价值。
因此,采用OB胶粘贴法建立胃癌原位移植模型是目前研究人胃癌转移机
制以及抗转移治疗较为理想的转移实验模型,该模型的成功建立为今后胃癌实验研究开辟了广阔的前景。