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RNAi 在干细胞研究中的应用及其进展
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ RNAi 在干细胞研究中的应用及其进展RNAi 在干细胞研究中的应用及其进展摘要在各类生物中，双链 RNA（ dsRNA）诱导产生特异性基因沉默的机制，被称为 RNA 干扰（ RNAi）。
dsRNA 干扰技术可通过降解靶基因的 mRNA 进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。
本文从 RNAi 相关的 Dicer、 Agronaute 基因家族等来认识其基因沉默必需基因与干细胞功能特性的关系，并综述利用 RNAi 干扰技术在干细胞研究与应用的进展。
关键词 RNAi 干细胞增殖分化 Dicer Agronaute 几十年来，一直认为 RNA 仅仅从 DNA 获取遗传信息，并将信息转换成蛋白质。
但最近研究发现，小 RNA(small RNA) 发挥着基因调控的作用。
小 RNA 能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平。
在发育过程中通过关闭或开放基因的表达，小 RNA 可能指导着细胞的定向分化并决定细胞的命运[1] 。
九十年代初期研究发现 21 到 28 个核苷酸1 / 12的小 RNA 能抑制植物的基因表达，随后在动物细胞中也发现了这一现象。
但直到 1998 年2 月华盛顿卡耐基研究院的 Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的 Mello首次将双链 RNA （ dsRNA）注入线虫，结果发现诱导了比单独注射正义链或者反义链都要强的基因靶向专一性的基因表达沉默（ gene silencing）。
他们将这种现象称为 RNA 干扰（ RNA interference , 简称 RNAi）。
随后许多研究者先后采用不同长度的 dsRNA 使线虫、果蝇、植物、动物卵细胞和哺乳类细胞等的靶向基因表达明显降低或沉默，因此人们把这种利用 dsRNA 使目的基因敲低或使目的基因沉默，从而研究目的基因的功能即为 RNA 干扰技术（ RNAi 技术。
RNA干扰技术(RNAi)及其应用
RNA干扰技术（RNAi）及其应用RNA干扰技术及其应用问题的提出RNA干扰技术是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
试题中也出现了RNA干扰技术的知识，内容涉及基因的表达，本身知识点就有一定的难度，适当进行知识拓展有助于理解相关知识。
问题：什么是R N A干扰技术？有哪些应用？研究过程怎么样？01试题：近几年来R N A干扰（简称R N A i）研究取得了突破性进展。
R N A 干扰的机制是：双链R N A进入细胞内被一个称为D i c e r的特定的酶切割成21～23个核苷酸长的小分子R N A的片段（简称S i R N A）。
D i c e r 能特异性识别双链R N A，切割产生的S i R N A片断解开变成单链，和某些蛋白质形成复合物（简称R I S C）。
R I S C能结合到细胞内与S i R N A 互补的m R N A上，并切割该m R N A，使其被降解，造成蛋白质无法合成，产生基因“沉默”现象（如下图所示）。
请分析回答：（1）R N A i引起相关基因“沉默”的现象，实质上是遗传信息传递中的过程受阻，该过程发生在细胞的中。
（2）R I S C使基因“沉默”的条件是S i R N A上有的碱基序列。
（3）某科学家将能引起R N A干扰的双链R N A的两条单链分别注入细胞内，结果却没有引起R N A干扰现象，最可能的原因是。
（4）研究发现，D i c e r受D N A上某基因控制，如该基因上某碱基发生了改变，是否R N A干扰现象就消除了？你的结论依据是什么？（5）请举一例说明R N A干扰在实际中的运用或意义。
答案：（1）翻译细胞质（核糖体）（2）与m R N A互补配对（3）D i c e r酶只能识别（切割）双链R N A，不能识别（切割）单链R N A（4）不一定因为突变可能是隐性的，或同义突变（指令的氨基酸不变），或突变不是发生在外显子部位（5）可以使致癌基因表达的m R N A被破坏，达到治疗肿瘤的目的解析：根据题图，图示表示R N A干扰现象示意图，D i c e r酶能特异识别双链R N A，切割产生的干涉R N A与一系列酶结合组成诱导沉默复合体（R I S C）；R l S C通过碱基配对结合到与干涉R N A同源的m R N A上，并切割该m R N A，造成蛋白质无法合成。
肿瘤中的RNA，长篇综述了解非编码RNA
肿瘤中的RNA，长篇综述了解非编码RNA 围绕“肿瘤免疫”这一核心主题，在果友们的大力支持下，芒果公号已翻译多篇经典综述。肿瘤中的RNA是研究热点，也是生信分析的热点。肿瘤中的RNA（全文版），供大家阅读！ 原始文献： RNA in cancer. Nat Rev Cancer 21, 22–36 (2021). /10.1038/s41568-020-00306-0. ——————青枣队长—————— 基因表达紊乱是肿瘤的一个主要标志。事实上，目前已经证实转录因子活性的改变是许多肿瘤最常见亚型的驱动因素1。RNA对基因表达至关重要，无论是蛋白质编码RNA (mRNA) ，还是参与调节转录的非编码RNA (如长链非编码RNA (lncRNA)或7SK小核RNA (snRNA))、剪接 (如snRNA)和翻译(如核糖体RNA、tRNAs、microRNAs (miRNAs)相关的RNA2-6。最近研究表明，在肿瘤中RNA加工过程系统地改变表明RNA对肿瘤的发生、生长和进展有重要影响7 – 19。RNA处理因子的基因突变水平、表达水平以及RNA水平本身上的变化是以一些非编码RNA的形式展现，如microRNA，lncRNA， tRNA片段BOX1和环状RNA (circRNAs)，它们的表达可能会发生改变，促进肿瘤的发生。N6-甲基腺苷BOX2的 RNA修饰已被证明在肿瘤20–23
中发挥重要作用，已有综述概述了RNA修饰如何促进肿瘤24，但并未对此做深入讨论。 在肿瘤中RNA加工改变是常见的。研究认为，RNA亚型有助于探索肿瘤发生的潜在机制。例如，肿瘤途径既可由单个miRNAs调控，也可由多个miRNAs相互连接的调控网络控制，这些调控网络可能与它们所调控的靶点形成反馈环路4。剪接体突变可能促进血液系统恶性肿瘤发展的机制也被发现16-18,25,26。编码剪接调控因子SF3B1、U2AF1、SRSF2和ZRSR2的基因突变相互排斥16,17。影响剪接体部分蛋白质的突变可以影响一些常见的下游途径，这些途径通过改变mRNA剪接13，27或增加基因组的不稳定性28来促进肿瘤的发生，从而可能导致大量肿瘤标志物产生29。这些机制的进一步描述对于未来有希望出现的以改变RNA加工为靶向的肿瘤疗法的发展是至关重要的。 在这篇综述中讨论了如何改变编码和非编码RNA的加工或活性调控肿瘤的发生、生长和进展。明确RNA在肿瘤中已有作用 (miRNA和lncRNA)和新发现的作用 (选择性mRNA加工和circRNA)，以及它们参与肿瘤发生发展的机制。 基因表达途径mRNA被RNA聚合酶II合成后，进行剪接，进而加工为成熟转录本，从细胞核运送到细胞质中翻译成蛋白质。这些相互关联的处理步骤是由许多大型高分子复合物完成的，如剪接体[3]和转录-出核复合体TREx和TREx2 (Fig. 1)。在生理条件下，许多非编码RNA也可对基因表达进行正向或负向调控，包括miRNA， lncRNA和circRNA。通常，miRNAs通过加速靶mRNAs30的脱腺苷化和降解来负向调控基因表达，而lncRNAs可以通过充当调节蛋白复合物的支架，通过定位于基因组DNA或通过改变基因组结构，通过顺式或反式作用调控基因表达31。
RNA干扰设计
什么是siRNA和RNAi双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。
实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。
目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。
随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。
RNAi技术发展历程1998：植物基因中基因沉默现象的发现2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一2003：动物体内观察到RNA干扰作用2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验RNAi 2006诺贝尔医学奖述评——年轻的获奖者——2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。
RNA
165BIOTECHWORLD 生物技术世界RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指通过内源性或外源性双链RNA(double strand RNA, dsRNA)的介导,特异性降解相应序列的mRNA,导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能型缺失的现象,属于转录后水平的基因沉默。
其广泛存在于微生物、植物、动物基因序列特异性转录后的基因沉默,在生物体进化过程中,是一种抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制[1]。
1 RNA 干扰的发现1989年,Matzke等[2]首次报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草,可引起转基因表达发生沉默现象。
1990年,Napoli 等[3]把已知色素基因导入矮脚牵牛花中,结果发现花的颜色全部或部分变白,该现象在当时被称为“共抑制”,即导入的基因和牵牛花内源着色基因都被抑制。
1995年,Su Guo [4]本想利用反义RNA技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫的par-1基因的表达,同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强,但结果二者都切断了par-1基因的表达途径。
这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。
1998年,华盛顿卡耐基研究院的Fire和麻省大学医学院的Mello [5]首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。
其是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA所引起。
当体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达,其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA 高2个数量级。
该小组将这一现象称为RNA干扰。
不断的研究发现RNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、小鼠、大鼠、猴以及人类的几乎所有的真核细胞[6]。
Tchurikov报道大肠杆菌等原核生物中也存在RNA干扰现象。
2 RNA 干扰的特征2.1 特异性RNA干扰具有高特异性特征,其只降解与其序列相应的单个内源基因的mRNA,而对不相关序列的表达无干扰作用。
RNA interference
Molecules tailor-made in the laboratory
Regulation of gene expression
RNA 干扰
1：简介
2：RNAi 的研究进展 3：RNAi 的特征 4: RNAi 的分子机制 5: RNAi 的生物学意义 6: RNAi 的应用 7：应用前景展望
线虫全基因组已于1998 年测序完毕,RNAi 的发现为系统和高通量研究 线虫全基因组功能提供了可能.，它的实验方法是:先用PCR 方法或反转录 方法大规模获得基因库,直接体外或体内转录生成dsRNA ，再用显微注射、 浸泡或喂养的方法导入线虫，然后用解剖显微镜或微分干涉差显微镜观察 RNAi 表型变化。目前已探索了几乎整个线虫的所有基因(约19 000个) 。 植物的全基因组探索也正在进行中。
4： RNAi 的分子机制
siRNA：小干扰RNA (small interference RNA ) 。 RISC：核酸诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex ) ，能与 siRNA结合。 DICER ：dsRNA 特异性核酸内切酶( dsRNA specific endonuclease ）, 是RNA 酶Ⅲ家族中dsRNA 特异性核酸内切酶，具有解旋活性。它的作 用底物是长度200～500bp左右的dsRNA。 RdRP：RNA 依赖性RNA 多聚酶(RNA dependent RNA polymerase ) ， 作用是以siRNA 为一种特殊的引物，以靶mRNA为模板，将mRNA 通过 聚合酶链式反应转变为dsRNA ，为DICER 提供底物。
虽然RNAi 在小鼠卵细胞和胚胎中得到证实，但双链RNA 在其他哺乳动物细胞通 常引起整个细胞蛋白合成非特异性抑制，mRNA 降解，细胞死亡。
RNA干扰
RNA i的应用 研究信号转导通路的新工具
RNA干扰能高效特异地阻断基因的表达的特点可使其成 为研究信号传导通路的良好工具。Clemens等应用RNA干 扰研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路。实验证明， RNA干扰能特异性地阻断培养细胞靶向蛋白质的产生，且 应用RNA干扰技术所阐明的转导通路与已知的胰岛素转导 通路完全一致。在整个实验过程中，发现RNA干扰技术比 传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验 中重组蛋白非特异性聚集和转染效率不高的缺点。故此认 为，RNA干扰技术将可能成为一种研究细胞信号转导通路 的重要方法，并将在研究哺乳动物信号转导通路中发挥重 大作用。
siRNA干扰效果的检测方法
• 核酸水平：检测转录量 • 蛋白水平检测：检测蛋白产物表达量 • 动物实验或TCID50检测
RNAi的生物学功能
• 防止病毒感染 • 抑制转座子转座 • 基因表达调控
RNAi的生物学功能
防止病毒感染 双链RNA是众多病毒的遗传物质，即使 在被单链RNA病毒感染的细胞中，也发现 了病毒特异性双链RNA。当病毒侵入生物 体后可诱发RNA干扰，封闭病毒生存和繁 殖必需的基因，产生抗病毒效应。
siRNA的获得
通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA
基于PCR的siRNA表达框架(siRNA expression cassette,SEC)，它由RNA pol、Ⅲ启动子、发夹 结构siRNA、RNA polⅢ终止位点组成,制备方法 为PCR，无需克隆和测序。
RNA干扰及其应用
药物研发
靶点筛选
利用RNA干扰技术可以快速筛选出药物作用的靶点， 加速新药的研发进程。
药效评估
通过RNA干扰技术沉默特定基因，可以评估药物对疾 病的治疗效果和潜在副作用。
个体化用药
根据患者的基因型差异，利用RNA干扰技术定制个体 化的药物治疗方案，提高治疗效果和安全性。
个体化治疗
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基因治疗
通过RNA干扰技术沉默缺陷基因或过表达基因， 实现基因治疗，治疗遗传性疾病和罕见病。
基因治疗：RNA干扰技术还可以用于基因治疗，通过沉默致病基因的表达，达到预防和治疗遗传性疾病的目的。例如，针对 杜氏肌营养不良症的RNA干扰药物已经进入临床试验阶段。
在癌症研究中的应用
癌症是由于基因突变引起的疾病，RNA干扰技术可以通过沉默致癌基因的表达，达到治疗癌症的目的 。例如，针对某些致癌基因的RNA干扰药物已经进入临床试验阶段。
细胞类型和组织特异性
RNA干扰在某些细胞类型或组织中的效率和特异性可能 较低，这限制了其在某些研究或治疗应用中的使用。
长期沉默和脱靶分析
在某些情况下，RNA干扰可能导致基因的长期沉默，这 可能对细胞或生物体产生不可逆的影响。同时，对脱靶效 应的全面分析仍是一个挑战。
体内应用
将RNA干扰技术应用于体内实验或治疗时，如何有效地 将siRNA传递到靶组织是一个关键挑战。
药物研发：RNA干扰技术还可以用于药物研发，通过沉默致癌基因的表达，筛选出具有抗癌活性的小 分子药物。例如，针对某些致癌基因的小分子药物已经进入临床试验阶段。
在神经科学中的应用
神经科学是研究神经系统和神经元活动的科学，RNA干扰技 术可以通过沉默某些基因的表达，达到调节神经元活动和行 为的目的。例如，针对某些神经递质受体的RNA干扰药物已 经进入临床试验阶段。
RNAi技术进展概论
RNAi技术进展概论RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在生物体内导入双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），会诱发同源mRNA高效特异性降解的现象，从而达到阻止特定基因表达的目的。
1发展历程1.1研究进程1990年，有研究表明将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达,但其转录不受任何影响,并称这种现象为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)。
1993年，Rich Jorgensen等人对矮牵牛(petunias)进行花朵颜色研究，将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中,结果没有看到期待的深紫色花朵，多数花朵成了花斑色甚至白色。
因为导入的基因和其内源基因同时都被抑制,所以Jorgensen将这种现象命名为共抑制（co-suppression）。
开始认为这种现象是矮牵牛特有,后来发现在其他许多植物，甚至真菌中也有类似情况[1]。
1994年,Cogin把合成类胡萝卜素的基因(albino-1或albino-3)转入野生型粗脉孢霉(Neurosporacrassa),发现大约30%转染细胞内源性al-l或al-3基因的的表达水平反而大为减弱,当时称这种现象为阻抑作用（quelling）[2]。
1995年，Su Guo和Kemphues在用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）基因表达的试验中发现,反义RNA（antisense RNA）和正义RNA（sense RNA）都能有效并特异性地抑制线虫par-1基因的表达, 该结果与反义NRA技术的传统机制完全违背。
1998年，Andrew Fire和Craig Mello证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发。
实际上每个细胞只要很少几个分子的dsNRA已经足够达到完全阻断效果。
RNA干涉
R N A
干 涉 的 可 能 机 制
• RNAvirus 的侵染
转座子的转录 反向重复序列的转录
两个RNA分子的互补 单链RNA的分子内折叠
• 细胞中一组特异蛋白质 依赖RNA的RNA聚合酶
结合
D.S RNA 复制D.S RNA
RNAseIII 降解D.S RNA at U
21-25nt D.S RNA
5` 3`UUUU
2 separate siRNA strands
Pol III
5` TTTTT 3`
UUUU UUUU
Pol III
5` TTTTT 3`
UUUU
UUUU
体内转录
siRNA表达载体
质粒载体
原 理
Cloning Site
RNAi Vector
(double-stranded plasmid DNA)
injection
anti-mRNA
秀丽新小杆线虫
Par-1基因表达未被增强反 而发生了特异性阻断？！
Par-1基因表 达特异性阻断
Andrew Fire
(1998.2 华盛顿卡耐基研究院)
纯化的 S.S mRNA of par-1 纯化的 D.S mRNA of par-1 证明；Dr. Su Guo
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核 酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物 （RNA-induced silencing complex, or RISC）
激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双 链的过程
激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上
并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割 mRNA