微生物脂肪酶的纯化方法概述
脂肪酶的产生菌的分离生产及其运用
三、脂肪酶的分离纯化
酶的分离纯化书将酶从细胞中或其它酶原料中提取出来，再与杂 质分开，从而获得符合研究和使用要求的酶制品过程。主要内容包括 细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分 离，电泳分裂，萃取分离，浓缩，干燥和结晶等。酶的纯化策略的选 择首先要考虑的是其用途，在实验室研究和临床治疗中所使用的应为 高纯度的酶；而工业用途的酶对纯度的要求就不是很严格，但是一定 纯度的酶制剂不仅可以保证催化反应快速有效地进行，而且也降低了 反应的复杂性，增加了反应的可预测性。一次，脂肪酶的纯化研究具 有重要的意义。大部分微生物脂肪酶为胞外酶，发酵后通过离心或抽 滤出去菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵或有机溶剂萃取浓缩，出 去部分蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因 工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两 种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质。
实验
1．1试剂和仪器 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 000 PLU／g；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯)； PLU／ ；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯) 油酸甲酯(化学纯) 1102型气相色谱仪(氢火焰) CDMA色 油酸甲酯(化学纯)。1102型气相色谱仪(氢火焰)，CDMA色 谱工作站进行数据处理。 1．2实验方法 将一定量的脂肪酶在油酸甲酯中浸泡、过滤，用菜籽油淋洗 0．5 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 者将脂肪酶依次在菜籽油和油酸甲酯中浸泡、过滤，最后用 菜籽油淋洗0 菜籽油淋洗0．5 h。 h。 在具塞锥形瓶中加入一定量的脂肪酶、菜籽油和甲醇，置于 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 空气浴振荡器中进行反应，每间隔一定时间取样，静止，分 层，由气相色谱分析上层产品中甲酯含量。待 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏( 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏(回收甲 醇)、反复洗涤，得到黄色澄清透明的产品。
酶的分离纯化思路
酶的分离纯化思路 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。 2.离心 离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。 在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。 3.膜分离技术 在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。 超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。 超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。 还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。 4.泡沫分离 原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。 蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。 泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。
酶产品工艺流程
酶产品工艺流程
酶产品是一种广泛应用于工业生产中的高效催化剂。
酶产品可以通过提取、精制和纯化等工艺步骤进行制备。
下面将详细介绍酶产品的工艺流程。
首先是酶的提取步骤。
酶可以从多种来源中提取得到，如微生物、植物和动物等。
对于微生物来源的酶，可以通过培养微生物菌种，然后收集并离心获得菌体。
接着，通过破碎细胞壁、离子交换、凝胶过滤等操作，将酶从细胞中提取出来。
其次是酶的精制步骤。
在提取过程中，酶会伴随着其他杂质存在，需要通过精制步骤进行去除。
首先是固体分离，通过离心、滤网等操作将固体杂质去除。
然后是液体分离，通过超滤、溶液过滤等操作将液体杂质去除。
最后是浓缩和干燥，将酶溶液经过浓缩、喷雾干燥等工艺，得到酶的粗品。
最后是酶的纯化步骤。
粗品酶仍然存在一些不纯的成分，需要进行纯化以提高酶的纯度。
首先是蛋白质分离，通过离子交换、凝胶过滤等操作将酶与其他蛋白质分离。
然后是酶的活性测定与分析，通过比色法、荧光法等方法检测酶的活性。
接着是纯化酶，可以通过柱层析、电泳等操作去除其他杂质，提高酶的纯度。
最后是酶的活性修饰，通过酶的修饰剂，如金属离子、有机物等，来调节酶的活性和稳定性。
总之，酶产品的工艺流程主要包括提取、精制和纯化等步骤。
在整个工艺流程中，需要使用各种不同的设备和试剂来实现对
酶的提取和纯化。
通过这些步骤，可以得到高纯度和高活性的酶产品，用于各种工业生产中的催化反应。
脂肪酶综述
可养微生物脂肪酶高产菌筛选
通常采用含甘油三酯琼脂平板法, 并通过在 培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维 多亚蓝等作为筛选标记。 施巧琴( 1981) 采用脂 肪酶水解脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应 呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性脂肪酶的扩 展青霉。
2、 活性中心是丝氨酸残基, 正常情况下受1 个α - 螺旋盖保护。
嗜热芽孢杆菌脂肪酶
3、脂肪酶的特性
（1）位置专一性 是指酶对底物甘油三酯Sn- 1( 或3) 和Sn- 2 酯键的识别和水解。
（2）立体专一性 一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1 位和3 位酯键识别和选择 性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1 和3 位立体选择性; 人奶和 牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1 位酯键。
碳源
包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油 脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等
表面活性剂
包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等
发酵培养基优化
由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 。
速效碳源
如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如 玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。
二、脂肪酶的性质
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与 pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个 方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生 物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子 量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、 等电点和其他生化性质方面存在不同。
脂肪酶ppt课件
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4拆分消旋混合物
脂肪酶对手性化合物如醇、羧酸、酯、酰胺和 胺等均有较好的立体选择性,因此脂肪酶被广泛 地用来拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途径 为立体选择性水解、酯化或转酯反应。
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七未来趋势
• 以大豆油和十六醇为底物，固定化酶在无
溶剂体系中催化转酯化反应合成蜡脂。脂 肪酶作为催化剂节能环保使用的固定化酶 为实验室自制，生产成本低，可以考虑利 用此方法实现液态蜡脂的工业化生产。
脂肪酶催化油脂改性， 由一种甘油酯生成 另一种甘油酯。
作用：改善食用油的质量
开发食用油的品种
提高食用油的营养价值
RCOOR,+R”COOR
RCOOR+R”COOR,
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2洗涤工业
3合成精细化学产品
用脂肪酶在有机溶剂中催化合成羧酸酯系列香 精酯、萜烯醇酯、中长链脂肪酸短链醇酯及长 链脂肪酸长链脂肪醇酯等系列产品。
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2
• 脂肪酶催化的反应
反应
方程式
酯的水解 RCOOR’+H2O RCOOH+R’OH 酯的合成 RCOOH+R’OH RCOOR’+H2O 酯交换反应 RCOOR’+R”COOR R”COOR’+RCOOR
醇解反应 RCOOR’+R”OH RCOOR”+R’OH
酸解反应 RCOOR’+ R”COOH R”COOR’+RCOOH
1食品工业
脂肪酶在食品工业中用于改善甘油三酯的结构， 从而使其物理性质发生变化，用于开发一系列 的功能性和营养性油脂食品。
①三酰甘油的水解
脂肪酶酶促水解三酰甘油法可为食品工业提供 优质的原料，短链脂肪酸还可以改善食品的风 味和香味。（比较三酰甘油的常规水解方法和 酶水解方法）
酶蛋白的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
脂肪酶
5Pooja Rathi, Saxena R K, Rani Gupta. A Novel Alkaline Lipase from Burkholdderia Cepacia for Detergent Formulation [J].Process Biochem., 2001, 37: 187-192.
3.2氮源对脂肪酶产生的影响
以1%的植物油为碳源，分别选用玉米浆、豆饼粉、蛋白胨、酵母汁等单一或复合氮源进行产酶实验，实验结果如表5所示。可以看出，3%的玉米浆或3%蛋白胨加1%酵母汁的复合氮源产酶效果相当，酶活力高达55 IU/ml。利用廉价的玉米浆作为氮源，在大规模工业生产中具有重要意义。
3.3培养温度对产酶的影响
4.3酶的pH稳定性
将酶溶液分别置于不同的pH环境中，40℃保温60 min，然后按常规测定剩余酶活力.以pH9.5及40℃条件下的酶活力为100，图6的结果表明，在pH 7.0~10.5范围内，酶活力可保持在起始值的70以上。可见，该酶在加酶洗衣粉及洗涤剂工业中有良好的应用价值。
4.3酶的热稳定性
由表4，可以明显看到不同的培养基对杆菌产脂肪酶有较大的影响。可以看出，组合培养基是最适合于杆菌生长并产脂肪酶的一种培养基，因此，将组合培养基作为条件优化的研究培养基。
3.产酶条件的优化
3.1碳源对脂肪酶产生的影响
选用葡萄糖、植物油、动物油、淀粉、蔗糖等单一或复合碳源进行产酶实验.从表5可以看出，油脂作为碳源有利于产酶，酶活力高达54 IU/ml。油脂除作为碳源外，显然还对脂肪酶的形成具有诱导作用，但油的种类对产酶影响不大。
酶主要的分离纯化方法
酶主要的分离纯化方法。
1、根据酶分子大小和形状的分离方法。
(1)离心分离。
许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。
包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。
(2)凝胶过滤。
酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。
这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。
(3)透析与超滤。
通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。
2、根据酶分子电荷性质的分离方法。
(1)离子交换层析。
根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。
(2)层析聚焦。
层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。
(3)电泳。
在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。
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微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有许多优点:(一)微生物脂肪酶种类多、来源广、生长周期短；(二)具有比动植物脂肪酶更广的pH和作用温度适应范围以及更广的底物适应类型；(三)微生物脂肪酶便于进行工业化生产，同时容易制取高纯度制剂。
目前，工业生产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉以及假单胞菌等。
1.3产脂肪酶微生物的育种在生产实践中，提高微生物产脂肪酶能力的方法可采用传统诱导和现代基因工程两种方法进行微生物育种，从根本上改变微生物的产酶特性，从而获得稳定高产的工程生产菌株。
(1)传统诱变法虽然现代基因工程技术在微生物育种中已经有了相当的发展，但由于传统诱变技术具有操作简单快速、成本低和结果稳定有效等优点，目前仍然广泛用于微生物菌种的选育。
(2)基因工程法传统诱变法虽然是一种操作简单、技术成熟的好方法，但比起现代基因工程法，在微生物的育种中存在一定的局限，难以获得突破性进展。
随着生物科技的不断进步，基因工程法用于产脂肪酶微生物的育种技术正逐渐成熟并己经用于研究和生产实践。
目前，基因工程在产脂肪酶细菌育种中的应用主要是通过克隆相应的脂肪酶基因，然后在异源宿主菌中实现大量表达。
常用的异源宿主主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和曲霉表达系统三种。
其中曲霉表达系统由于其强大的分泌能力和成熟的发酵技术而得到生产者的青睐，并成功地用于生产实践。
1987年诺维信公司将克隆的柔毛腐质霉脂肪酶基因在曲霉菌中大量表达，其产量提高了1000倍，该公司销售的Noxozym435.LipozymeRM IM.LipozymeTL IM脂肪酶制剂均是以遗传改良A.oryzae作为异源表达宿主菌发酵生产的。
1.4脂肪酶的应用作为工业生产和生活中的常用酶，脂肪酶被广泛用于食品的增香、脱脂以及防腐等具体工艺。
在消除残余脂肪等具体的皮革工业生产中，脂肪酶也起着重要的作用。
基于特殊的催化性质，在医药、造纸工业中，脂肪酶常有效用于疾病的治疗、诊断和新药品的制备以及‘洽脂’1999)的去除和脱墨等具体实践；同时，脂肪酶还用于加酶洗涤剂的制备和部分化妆品的生产。
此外，随着现代科学技术的不断进步，脂肪酶在环保事业以及生物能源的开发等有关行业中的应用也越来越广泛。
1.5微生物脂肪酶纯化研究脂肪酶的分离和纯化是研究其酶学性质、结构与功能的基础，是整个脂肪酶研究中很重要的一个环节。
Rolf等认为在脂肪酶的分离纯化中，主要存在以下几个问题：(1)微生物发酵合成的是包括脂肪酶在内的酶的混合物，从而给下游的酶分离纯化造成压力，而且脂肪酶还有可能被蛋白酶分解；(2)脂肪酶不仅对油－水界面，而且对极性较水低的界面都有较高的亲和力，这些界面可以不可逆地吸附脂肪酶，使得脂肪酶很容易失活。
除了以上两个因素外，分离纯化时间长，回收率低，成本过高也是一个值得关注的问题。
脂肪酶分离纯化的过程一般包括预纯化过程和层析分离两个过程。
预纯化过程包括细胞破碎(胞内脂肪酶)、离心或过滤去除菌丝体、超滤浓缩酶液、硫酸铵盐析或有机溶剂萃取等步骤。
预纯化过程之后，一般再用层析方法进一步分离以获得高纯度的脂肪酶。
层析方法包括离子交换层析(QSepharose)、凝胶过滤层析(Sephacryl S-200 SF)、亲和层析等方法。
一般用酶活回收率、比活力和纯化倍数等指标来衡量脂肪酶分离纯化的程度。
2微生物脂肪酶的纯化方法2.1常规分离纯化技术2.1.1预分离对于微生物胞外酶，发酵液经离心或过滤除掉细胞，上清液用超滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂抽提等方法浓缩；胞内酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用硫酸铵沉淀的浓缩方法，也有采用乙醇、丙酮或酸(通常是盐酸) 沉淀的方法。
沉淀用于纯化早期粗分离，为了获得更高的纯度，还要用凝胶过滤或亲和层析等方法进行细分离。
硫酸铵浓度会影响纯化酶的活力。
与层析相比，沉淀工序受非蛋白质物质干扰的程度较小，而且能够分离得到大量蛋白质。
不能忽视发酵条件的重要性，因为发酵条件与蛋白质纯化有关。
培养介质的性质和抗泡沫剂可影响酶的抽提，而收获细胞的时间常决定细胞壁强度和蛋白水解酶的含量。
2.1.2层析酶的常规分离纯化方法有凝胶过滤、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等，它们的技术特点及用途比较见表1。
单一的层析方法难以达到理想的分离效果，因此蛋白质分离纯化中常采用几种层析联合的方法。
表1 酶的常规层析纯化技术分离原理分离方法特点用途分子大小电荷凝胶过滤离子交换分辨率适中，分级分离时流速较慢，脱盐时流速快，容量受样品体积限制分辨率高，视支持物不同流速可很快；容量很大，不受样品体积限制适用于纯化的后期阶段，脱盐可用于任何阶段，特别是步骤衔接时的缓冲液更换最适用于大体积样品且蛋白纯度较低的样品早期纯化，可分批操作疏水极性疏水层析分辨率较高，流速快；容量很大，不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段，特别适用于离子强度较高的样品，如沉淀、离子交换后的样品生物亲和性亲和层析分辨率较高，流速快；容量视配体可大可小，不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段，特别是样品浓度小，杂质含量多时，可以减少纯化步骤等电点聚焦层析分辨率较高，流速快；容量大，不受样品体积限制最适用于纯化的最后阶段纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的特殊次序位置。
为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及层析分离次序的选择至关重要。
工艺次序的选择策略包括:应选择不同机制的分离单元组成一套工艺；应将含量多的杂质先分离去除；尽早采用高效的层析分离手段；将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高目的蛋白浓度，去除最主要的杂质(包括非蛋白质类杂质) ，随后是高分辨的操作单元，如具有高选择性的离子交换层析和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速率慢的操作单元放在最后，这样可提高分离效益。
层析分离次序的选择同样重要，一个优化的层析次序组合不仅能够获得高的纯化倍数和纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的特殊次序位置。
为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及层析分离次序的选择至关重要。
工艺次序的选择策略包括：应选择不同机制的分离单元组成一套工艺；应将含量多的杂质先分离去除；尽早采用高效的层析分离手段；将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高目的蛋白浓度，去除最主要的杂质(包括非蛋白质类杂质) ，随后是高分辨的操作单元，如具有高选择性的离子交换层析和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速率慢的操作单元放在最后，这样可提高分离效益。
层析分离次序的选择同样重要，一个优化的层析次序组合不仅能够获得高的纯化倍数和回收率，而且使分离纯化顺畅，改变很少的条件即可进行各步骤间的衔接。
离子交换、疏水层析和亲和层析通常可起到蛋白质的浓缩效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释。
在离子交换色谱之后进行疏水层析，不必经过缓冲液的更换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强，凝胶过滤层析最后进行又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成型保存。
但在包涵体重组蛋白的纯化中，凝胶过滤层析可作为首选步骤。
如原核基因工程重组细胞因子的相对分子质量大多为15000～20000 ，而包涵体蛋白质相对分子质量通常大于30000，因此选用凝胶过滤层析可很容易获得高纯度产品。
2.2新颖的分离纯化技术得到回收率30 %、总纯化倍数320 的蛋白质通常需要4～5 个纯化步骤，常规的纯化方法耗时，得率低。
因此，开发出一些新的分离纯化技术，如膜处理技术、免疫纯化技术、活性环氧连接臂作为配体的疏水层析、聚乙二醇-琼脂糖凝胶和聚乙烯醇作为固相的柱层析、双水相体系及界面亲和层析技术等。
2.2.1膜处理技术错流膜过滤中微生物发酵液以横过膜表面的方式流动，液流可清扫膜表面的溶质层，使溶质无法在膜表面处积聚，从而截留微生物细胞和浓缩含酶发酵液，在下游处理技术中常有应用。
Sztajer 等用毛细管超滤膜纯化Pseudomonas fluorescens脂肪酶。
他们比较了2 种毛细管超滤膜:内径111 mm 截断相对分子质量为10000聚丙烯腈(PAN) 和聚砜(PS) 。
通过2种膜的脂肪酶滤液都得到浓缩，尤其是亲水的PAN 膜，浓缩15 倍；PS 浓缩3倍。
对PS而言，仅观察到浓缩效果，适合浓缩酶；而PAN 除了浓缩，还除去杂蛋白而应用于初分离。
PAN 膜吸附了15 %总蛋白和30 %总活力，而PS 膜吸附30 %总蛋白和40 %总活力，2种膜损失15 %～30 %总蛋白和30 %～40 %总活力。