基因工程作业(引物设计)
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）
一、选择原因及应用
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNA
NCBI Reference Sequence: XM_004055801.1
FASTA Graphics
LOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012
DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),
mRNA.
ACCESSION XM_004055801
VERSION XM_004055801.1 GI:426378238
KEYWORDS .
SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorilla
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;
Catarrhini; Hominidae; Gorilla.
COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computational
analysis. This record is derived from a genomic sequence
(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,
supported by mRNA and EST evidence.
Also see:
Documentation of NCBI's Annotation Process
##Genome-Annotation-Data-START##
Annotation Provider :: NCBI
Annotation Status :: Full annotation
Annotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100
Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipeline
Annotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA
##Genome-Annotation-Data-END##
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..2872
/organism="Gorilla gorilla gorilla"
/mol_type="mRNA"
/sub_species="gorilla"
/db_xref="taxon:9595"
/chromosome="14"
gene 1..2872
/gene="MTA1"
/note="Derived by automated computational analysis using
gene prediction method: GNOMON. Supporting evidence
/codon_start=1
/product="metastasis-associated protein MTA1"
/protein_id="XP_004055849.1"
/db_xref="GI:426378239"
/db_xref="GeneID:101134898"
/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN
1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc
61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgcc
gcgccgagcg ccgcgcccgc
aacatgtaca gggtcggaga
241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct
301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga
361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa
421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc
481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct
541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct
601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc
661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg
721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga
781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat
841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag
901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac
961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc
1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc
1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat
1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg
1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa
1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa
1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg
1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc
1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt
1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc
1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc
1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct
1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc
1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt
1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc
1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc
1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg
1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg
2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac
2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg
2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa
2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccct
gcgcccgtca acgacgagcc
gccccccgcc cctcgcccgc
2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct
2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa
2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt
2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc
2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt
2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc
2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt
2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa
//
三、表达载体的选择
我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；
pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。
pBR322 携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。
四、宿主菌为大肠杆菌。
五、酶切位点
用primer 5.0检查编码序列
经检验编码序列中没有EcoRI和HindIII识别位点，所以可用EcoRI和HindIII识别位点
为了使目的基因片段能连接到载体质粒pBR322上，所以在目的片段的5’端和3’端分别连接上HindⅢ识别序列和EcoRI识别序列，如下
5’——G↓AATTCATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAGA↓AGCTT----3’3’----CTTAA↑GTACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATCTTCGA↑A----5’↓↓
EcoRI识别位点 HindIII识别位点
六、引物设计
PCR引物设计原理：
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
PCR引物设计原则：
1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
4. 设计的引物中，应含有进一步操作中可利用的限制性内切酶识别序列，若靶DNA 一端或两端不含这样的序列，则可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。这种情况下，设计引物要长一些。
第一部：扩增基本序列
5’——ATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAG ----3’
……GTAGCAGTAGCTCCTGATC ----5’primer2
3’----TACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATC ----5’5’ ------ATGGCCGCCAACATGTACA…… primer1
第二步：GC比值和Tm值
Primer1 5’ ------ATGGCCGCCAACATGTACA……(GC:53% Tm=58) Primer2 5’
Primer1 5’
------ATGGCCGCCAACATGTACA (GC:53% Tm=58)
Primer2 5’----CTAGTCCTCGATGACGATG (GC:53% Tm=58)
第三步：酶切位点
Primer1 5’ ------GAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer2 5’----AAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
第四步：保护序列
Primer1 5’
Primer2 5’
故得出结论：
1、在上游引物中加入EcoRI酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物：
2、在下游引物中加入HindIII酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物：Primer1 5’ ------GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer2 5’----GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
七、过程
1、PCR体外扩增
反应体系：
模板0.5ul
上游引物1ul
下游引物1ul
10XTaq DNA聚合酶缓冲液 2.5ul
dNTP混合物f各2．5mM) 2ul
Taq酶1ul
dH20 17ul
总量25ul
程序设计
1、94℃预变性2min
2、94℃变性45s
3、58℃退火30s
4、70℃延伸30s
5、重复步骤2—4,30次
6、72℃延伸3min
7、4℃保存
2、分离质粒载体
先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS），使其发生温和的溶菌作用。这样质粒DNA 、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA 等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA 的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的DNA 混合物中，质粒DNA （cccDNA ）呈超螺旋状态。为进一步纯化出cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA 分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA 分子在氯化铯中的密度。又由于cccDNA 同EB 的结合能力比开环DNA 和线性DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA 同其他两种类型的DNA 分离开来其他载体DNA 分高纯化的原理与上述类似。
3、目的基因与载体的连接
外源DNA 片段与载体DNA 分子的连接，即DNA 分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。
4、感受态细胞的制备
首先配制以下试剂：
1)SOB培养基
配制500ml SOB培养基，在450ml水中加入以下试剂：
胰蛋白胨(tryptone) 10g
酵母提取物(yeast extract)．2．5g
NaCl 0．25g
用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解，然后加入250mmol／L KCI溶液5ml，用NaOH调
节溶液的pH值至7．0．然后加dH20定容至500ml，高压灭菌．在使用前加入2．5ml 经灭菌的2mol/LMgCl2溶液
n配置200 ml TB buffer，加入以下溶液：
nKCl 40 ml
nMnCl2 24ml
nCaCl2 6ml
nK-MES buffer 5ml
ndH20 125ml
n总量200ml
n1)大肠杆菌(LB培养基含7％DMSO保种)解冻，接种于LB平皿上，37℃培养箱内培养过夜．
n2)挑取单克隆，转入500ml SOB培养基中，1813，摇床培养18～24h左右，直到OD600值达到0．6为止．
n3)从摇床上取出摇瓶，将菌体转到500mi离心管，冰浴10min．
n4)3500rpm，4℃，冷冻离心，10min，弃上清．
n5)用150ml冰浴过的TB buffer重悬菌体沉淀，再次冰浴10min，按步骤4条件离心，弃上清．
n6)用40mlTBbuffer和2．8mlDMSO的混合液(DMS0的含量约占7％)再次重悬沉淀．n7)冰浴10min，混匀，超净台内分装(每管0．5～1．0m1)感受态大肠杆菌，置液氮罐中冷冻保存．用时从液氮罐中取出放在冰上约20min，融化后即可用于转化
5、重组子的筛选
6、目的基因导入受体细胞
7、外源基因的表达
8、用选择培养基判断目的基因是否表达
因为pBR322 携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。
所以用含有氨苄青霉素的培养基中培养，若该基因组的表达物，能在该培养基上生长则说明该重组子已经表达了，反之，则没有表达。
基因工程实验技术介绍
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
引物设计基本方法
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
【精品】2021年高中高三生物二轮复习专题练习含答案解析4：基因工程
2021年高三生物二轮复习专题练习4含答案解 析：基因工程 一、选择题 1.下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( ) A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因 B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交 C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒 D．利用基因工程生产乙肝疫苗时，目的基因存在于人体B淋巴细胞的DNA中 2.1970年，特明和巴尔德摩证实了RNA病毒能依赖RNA 合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA 的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解分析，下列说法不．正确的是( ) A．催化①过程的酶是逆转录酶 B．从图示可以看出要将碱基对之间的氢键断开可以用核酸酶H和高温处理 C．从图中信息分析可知，②⑤过程为DNA复制，催化⑤过程的酶能耐高温 D．如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶30
个 3.在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( ) A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体 C．将重组DNA分子导入烟草原生质体 D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞 4.如图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是( ) A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 5.在基因工程操作中限制性核酸内切酶是不可缺少的工具酶。下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是( )
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
引物设计的11条黄金法则
引物设计的11条黄金法则
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端
高中生物《基因工程》练习题(含答案解析)
高中生物《基因工程》练习题 题号一二总分 得分 一、单选题（本大题共20小题，共20.0分） 1.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（） A. 解旋酶、限制酶、DNA连接酶 B. 限制酶、解旋酶、DNA连接酶 C. 限制酶、DNA连接酶、解旋酶 D. DNA连接酶、限制酶、解旋酶 2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 选用细菌为重组质粒受体细胞是因为质粒易进入细菌细胞且繁殖快 D. 只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达 3.如图为基因表达载体的模式图。下列有关基因工程的说法错误的 是（） A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B. 任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C. 图中启动子和终止子不同与起始密码子和终止密码子 D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了载体 4.一些细菌能借助限制性核酸内切酶抵御外来入侵者，而其自身的基因组DNA经预先修饰能躲避 限制酶的降解。下列在动物体内发生的过程中，与上述细菌行为相似的是（） A. 巨噬细胞内溶酶体杀灭病原体 B. T细胞受抗原刺激分泌淋巴因子
C. 组织液中抗体与抗原的特异性结合 D. 疫苗诱导机体产生对病原体的免疫 5.某目的基因两侧的DNA序列所含的限制性核酸内切酶位点如图所示，最好应选用下列哪种质粒 作为载体（） A. B. C. D. 6.下图是研究人员利用供体生物DNA中无限增殖调控基因制备单克隆抗体的思路流程。下列相关 叙述正确的是（） A. 酶a、酶b作用位点分别为氢键和磷酸二酯键 B. Ⅰ是经免疫的记忆细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞 C. 筛选出既能无限增殖又能产生专一抗体的Ⅱ必须通过分子检测 D. 上述制备单克隆抗体的方法涉及转基因技术和动物细胞核移植技术 7.下列关于基因工程技术的说法，正确的是（） A. 切割质粒的限制酶均只能特异性地识别3-6个核苷酸序列 B. PCR反应中两种引物的碱基间应互补以保证与模板链的正常结合 C. 载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因 D. 目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 8.在其他条件具备的情况下，在试管中进入物质X和物质Z，可得到相应产物Y．下列叙述正确 的是（）
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
qPCR引物设计原则及具体操作步骤
qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1.找基因（DNA） 1)通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2)通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3)通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存 序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计 1)引物设计注意事项 a)引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出 现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距 不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算； d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其 是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能 搭上 g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的 GC互搭 h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l)需跨外显子设计，避免基因组污染 2)TaqMan探针设计指南 a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个 碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存 在淬灭作用 d)3’端应避免使用碱基A
基因工程练习题(附答案)
基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA
基因工程实验考试试题(答案)
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
引物设计步骤与要点
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
手把手教你设计引物
手把手教你设计引物（图文并茂） 关键词：引物设计2014-05-14 10:33来源：丁香园点击次数：9911 不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。 引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。 就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。 以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED 导出序列不太方便，我介绍个网站 https://www.360docs.net/doc/0113364840.html,/index.html 1. 输入目的基因，进入 2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入
3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA 4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容
5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS 6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断
下载后打开的WORD
7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。选取并复制第6和第7外显子序列
2018年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三)(含答案)
2019年全国卷高考生物总复习《基因工程及转基因技术的安全性问题》专题演练(三) 1．（2019年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。 下列操作与实验目的不符的是（） A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上 【答案】C 2．图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图。 下列叙述正确的是（） A．过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得 B．过程①可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植 C．过程①可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体 D．过程①人β-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译 【答案】AC 3．2019年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。 据图分析，下列叙述错误的是（） A．该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代 B．捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿 C．三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核 D．三亲婴儿的培育还需要早期胚胎培养和胚胎移植等技术
【答案】C 4．在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（）A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞 B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞 C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合 D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽 【答案】C 5．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（） A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得 B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点 C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来 D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用 【答案】C 6．（2019年新课标①卷，38）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是_____________________。 （3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
甲基化引物探针设计方法
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.360docs.net/doc/0113364840.html,/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
pcR引物设计注意事项
ORF (Open reading frame ) 开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。CDS(coding sequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那段序列，是mRNA的一部分. 通常外显子指的是编码蛋白序列.严格地说,外显子是指保留在初级ｍＲＮＡ中不被剪切掉的区域,包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。所以mRNA的外显子的概念应该要大于CDS序列的范畴 何谓PCR？PCR引物设计时有哪些注意事项 （1）聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction）。 （2）PCR引物设计原则 1设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ②引物长度 ②GC含量，一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。 ③退火温度 退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。 ④避免扩增模板的二级结构区域 选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 ⑤与靶DNA的错配 ⑥引物末端 引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 ⑦引物的二级结构 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 ⑧为了下一步操作而产生的不完全匹配 5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。PCR引物设计的黄金法则