富血小板纤维蛋白(PRF)诱导骨髓间质干细胞分化成骨细胞的实验
通讯作者：王稚英，Email ：weisiwei703@hotmail．com 。收稿日期：2011－12－16
·短篇论著·
富血小板纤维蛋白（PRF ）诱导骨髓间质干细胞
分化成骨细胞的实验研究
魏思维1，王稚英
2
（辽宁医学院附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121000）
摘要：目的研究富血小板纤维蛋白在诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞转化的作用。方法取7天新西
兰大白兔股骨，分离骨髓间质干细胞进行体外培养，在各自的培养条件下分为三组：实验组（不同剂量的PRF 组）、空白对照组（MSCS 组）和阳性对照组（BMP －2组）。三组细胞的比较采用MTT 测定细胞增值率、PNPP 法测定碱性磷酸酶的表达、免疫组化标记Ⅰ型胶原蛋白的表达、检测细胞为成骨细胞。结果细胞形态学观察，MSCS 分化后，细胞形态从长梭形变成三角形，多角形，立方形；MTT 测定细胞增殖显示，随着PRF 膜剂量的增
加，细胞增殖数量增加，PRF 剂量为4，5mL 时，与BMP －2组差别不大；ALP 活性结果显示，MSCS 分化后，ALP 活性远高于MSCS 细胞。两者差异具有显著统计学意义（t =24．608，
p =0．000）；免疫组化标记Ⅰ型胶原结果显示，
PRF 组分化后的MSCS Ⅰ型胶原表达显著。结论富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性，可以作为自体材料应用于口腔种植学领域里骨缺的修复。关键词：富血小板纤维蛋白（PRF ）；骨髓间质干细胞；分化；成骨细胞中图分类号：
R331．143
文献标识码：
B
The study of the function of PRF in the process
of inducing MSCs into osteoblasts
WEI Si －wei ，WANG Zhi －ying
（The Second Affiliated Hospital ，Liaoning Medical College ，Jinzhou ，Liaoning 121000，P．R．China ）
Abstract ：
【Objective 】to study the function of PRF in the process of inducing MSCs into osteoblasts．【Meth-ods 】isolate MSCs from the femur of 7－day －old rabbits and divided into 3groups．Experimental group （different does of PRF ），control group （MSCs ）and positive control group （BMP －2）．Use MTT assay to calcuLate cell prolif-eration rates of each group ，use PNPP assay to measure expression of alkaline phosphatase （ALP ），and use IHC to de-tect collagen one．【Results 】morphological observation shows cells shape change from long spindle into triangle ，quad-rangle and polygon after MSCs differentiation．MTT shows cell proliferates as PRF does increases．ALP expression of differentiated MSCs is higher than MSCs （t =24．608，p =0．000）．IHC shows collagen one express significantly in ex-perimental group．【Conclusion 】PRF promotes the process of inducing MSCs into osteoblasts．It can be used as autog-enous material in bone repairmen of oral implantology．
Key words ：platelet －rich fibrin ，PRF ；mesenchymal stem cell ，MSCS ；trans －differentiation ；osteoblast cells
种植领域里常见的临床难题是骨缺损，骨组织工程技术
的发展为骨缺损提供了新的途径，
骨髓间质干细胞被认为是骨组织工程理想的种子细胞，它可在体外大量扩增并保持成
骨潜能。由于目前用于骨组织工程的大多数材料在生物活性和机械性能等方面不能满足临床要求，模拟天然骨的成分和结构，寻找新的组织修复材料随即成为口腔种植学领域里的热点。富血小板纤维蛋白为自体全血离心的产物，是一种自体移植物，全血经低速离心的过程中促发凝血，血液中的纤维蛋白原缓慢聚合成纤维蛋白，结构为三分子网状结构。由于这种网状结构与人类天然的组织结构非常相似，又具有诱导细胞迁移和细胞增殖，从而加速愈合过程的功能。骨移植手术的初期，移植物内的细胞成分依靠进入的营养物质而存活。PRF 的纤维蛋白立体网状结构，使得营养成分及氧气轻松弥散至细胞周围，促进骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，沉积骨质，加速成骨的形成。本文是在细胞水平上研究
骨髓间质干细胞分化为成骨细胞这一过程中PRF 膜的作用，
指导PRF 膜在整形外科及口腔种植等多领域里的应用。1材料与方法1．1材料1．1．1实验动物
新生（7天）新西兰大白兔两只，雌雄不
限。1．1．2
实验仪器及试剂
培养皿、离心管、
DMEM 培养基、青－链霉素溶液、胰蛋白酶、胎牛血清、I 型胶原酶、小鼠抗兔
I 型胶原蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG 多克隆抗体、DAB 显色剂、倒置显微镜、离心机、二氧化碳培养箱，10mL 离心采血管等。1．2方法1．2．1兔BMSCs 的分离培养
1．2．1．1
原代细胞的分离培养将出生7天的新西兰大白兔脱颈处死，75%乙醇浸泡10min ，在无菌操作下取双侧股骨和胫骨，去除肌肉，骨膜，剪去股骺，用注射器抽取完全培养基（含13%胎牛血清的DMEM ）冲出骨髓，反复吹打均匀制
·
71·第20卷第2期2012年2月
中国医学工程
China Medical Engineering
Vol．20No．2Feb ，2012
富血小板纤维蛋白—PRF在口腔种植中的应用
富血小板纤维蛋白—PRF在口腔种植中的应用 组织再生需要生长因子、成骨相关细胞、支架材料和良好的血供。其中富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）富含血小板及各种细胞因子，具有良好的促进软、硬组织再生的能力。临床口腔种植患者中有很多牙槽骨缺损或不足的情况，PRF可促进牙槽骨缺损修复，增高牙槽骨，促进种植体周围软组织愈合，治疗种植体周围炎。 Abstract：Tissue regeneration need growth factors，osteogenic cells，scaffolds and good blood supply. Wherein platelet rich fibrin （platelet-rich fibrin，PRF）platelet rich and various cytokines，with soft and hard tissue regeneration capacity of good promotion. Oral Implantology in patients with clinical situations many alveolar bone defect or lack of，PRF can promote alveolar bone defects，increased alveolar bone，soft tissue implants promote healing，inflammation around the implant treatment. Key words：Platelet rich fibrin；Oral Implantology；Bone tissue regeneration；Alveolar bone defect 对于很多牙槽骨骨量缺损或不足的患者，临床口腔种植时往往需要植入骨材料才能达到理想的种植修复效果。植骨材料可分为自身骨和异体骨。在植骨过程中，自身骨移植是移植骨材料中的最佳方法，因为其可提供骨移植所需的必要條件。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是继富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）之后的第二代血小板浓缩制品。其完全取自自体血，且制备简单，并富含血小板及各种细胞因子，具有良好的促进软、硬组织再生的能力。同时，PRF所含有的免疫细胞具有良好的调节炎症反应和抗感染能力。本文主要对PRF 的制备方法、生物学特性及其在口腔种植医学研究中的应用作一综述。 1 富血小板纤维蛋白的制备方法 1.1采血取静脉血10ml置于试管内。 1.2离心以2500～3000r/min离心10～12min。 1.3制备PRF膜静脉血经离心后分三层，上层淡黄色澄清物为去血小板血浆，下层红色疏松物为红细胞碎片，其中间层为PRF凝胶。静置离心物3min后弃上清，取出中间层PRF凝胶，并用无菌纱布挤压成膜状，即可得到具有一定形态、弹性及韧性的PRF膜。 1.4取PRF凝胶，盛于无菌种植器械工具内，剪碎加入人工骨粉，搅拌均匀呈粘稠凝胶状待用。 2 富血小板纤维蛋白的生物学特性
大量输血后纤维蛋白原和血小板的临床分析
大量输血后纤维蛋白原和血小板的临床分析 摘要目的分析大量输血后纤维蛋白原和血小板的水平变化。方法40例接受大手术需大量输血患者，均于输血前后对本组患者纤维原蛋白、血小板水平和凝血酶时间、凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间进行检测和观察，并对其结果进行分析。结果本组患者输血后12、48 h纤维蛋白原和血小板水平均低于输血前，输血后12、48 h凝血功能指标水平均优于输血前，比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论大量输血后手术患者纤维蛋白原容易被溶解，血小板计数水平明显下降，故应对相关指标予以密切监测和相应处理，以减少危重并发症的发生。 关键词大量输血；纤维蛋白原；血小板 输血是治疗宫外孕和产后大出血的必要治疗手段，但由于输血时间较短、输血量较大，患者容易出现凝血功能障碍等不良反应。本文针对已选定的40例接受大手术需大量输血患者，对其纤维原蛋白、血小板水平和凝血酶时间、凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间进行检测并分析结果，以期提高输血质量，现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 一般资料回顾性分析2013年10月～2014年10月本院收治的40例接受大手术需大量输血患者临床资料，本组患者输血量均符合大量输血定义标准[1]，排除有先天性凝血功能障碍者、凝血因子缺失者、本实验前1～2周服用抗凝药物者。本组中患者均为女性，年龄19～62岁，平均年龄（21.36±10.57）岁，围术期24 h出血量1863～3215 ml，平均出血量（2573.68±189.75）ml，输血量2058～3462ml，平均输血量（2735±198.65）ml，疾病类型：宫外孕17例，产后出血23例。本组患者一般资料均未对本实验结果造成严重不良影响，具有重要研究价值。 1. 2 方法 1. 2. 1 标本采集与处理本组患者均于输血前及输血后12、48 h采集空腹静脉血各4 ml，分别注入EDTAK2抗凝管与枸缘酸钠抗凝管中，混匀后及时送检。 1. 2. 2 标本检测经EDTAK2抗凝标本利用SYSMEX五分类血液分析仪XT-2000i及其配套试剂检测血小板水平，经枸缘酸钠抗凝标本利用STAGO Compact全自动凝血分析仪及其配套试剂检测纤维蛋白原水平，并观察凝血酶时间、凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间等指标水平。 1. 3 统计学方法采用SPSS20.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用
骨髓间充质干细胞研究进展(一)
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
富血小板纤维蛋白(PRF)诱导骨髓间质干细胞分化成骨细胞的实验
通讯作者：王稚英，Email ：weisiwei703@hotmail．com 。收稿日期：2011－12－16 ·短篇论著· 富血小板纤维蛋白（PRF ）诱导骨髓间质干细胞 分化成骨细胞的实验研究 魏思维1，王稚英 2 （辽宁医学院附属第二医院口腔颌面外科，辽宁锦州121000） 摘要：目的研究富血小板纤维蛋白在诱导骨髓间质干细胞向成骨细胞转化的作用。方法取7天新西 兰大白兔股骨，分离骨髓间质干细胞进行体外培养，在各自的培养条件下分为三组：实验组（不同剂量的PRF 组）、空白对照组（MSCS 组）和阳性对照组（BMP －2组）。三组细胞的比较采用MTT 测定细胞增值率、PNPP 法测定碱性磷酸酶的表达、免疫组化标记Ⅰ型胶原蛋白的表达、检测细胞为成骨细胞。结果细胞形态学观察，MSCS 分化后，细胞形态从长梭形变成三角形，多角形，立方形；MTT 测定细胞增殖显示，随着PRF 膜剂量的增 加，细胞增殖数量增加，PRF 剂量为4，5mL 时，与BMP －2组差别不大；ALP 活性结果显示，MSCS 分化后，ALP 活性远高于MSCS 细胞。两者差异具有显著统计学意义（t =24．608， p =0．000）；免疫组化标记Ⅰ型胶原结果显示， PRF 组分化后的MSCS Ⅰ型胶原表达显著。结论富血小板纤维蛋白可以诱导骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，分化的类成骨细胞具有成骨细胞的特性，可以作为自体材料应用于口腔种植学领域里骨缺的修复。关键词：富血小板纤维蛋白（PRF ）；骨髓间质干细胞；分化；成骨细胞中图分类号： R331．143 文献标识码： B The study of the function of PRF in the process of inducing MSCs into osteoblasts WEI Si －wei ，WANG Zhi －ying （The Second Affiliated Hospital ，Liaoning Medical College ，Jinzhou ，Liaoning 121000，P．R．China ） Abstract ： 【Objective 】to study the function of PRF in the process of inducing MSCs into osteoblasts．【Meth-ods 】isolate MSCs from the femur of 7－day －old rabbits and divided into 3groups．Experimental group （different does of PRF ），control group （MSCs ）and positive control group （BMP －2）．Use MTT assay to calcuLate cell prolif-eration rates of each group ，use PNPP assay to measure expression of alkaline phosphatase （ALP ），and use IHC to de-tect collagen one．【Results 】morphological observation shows cells shape change from long spindle into triangle ，quad-rangle and polygon after MSCs differentiation．MTT shows cell proliferates as PRF does increases．ALP expression of differentiated MSCs is higher than MSCs （t =24．608，p =0．000）．IHC shows collagen one express significantly in ex-perimental group．【Conclusion 】PRF promotes the process of inducing MSCs into osteoblasts．It can be used as autog-enous material in bone repairmen of oral implantology． Key words ：platelet －rich fibrin ，PRF ；mesenchymal stem cell ，MSCS ；trans －differentiation ；osteoblast cells 种植领域里常见的临床难题是骨缺损，骨组织工程技术 的发展为骨缺损提供了新的途径， 骨髓间质干细胞被认为是骨组织工程理想的种子细胞，它可在体外大量扩增并保持成 骨潜能。由于目前用于骨组织工程的大多数材料在生物活性和机械性能等方面不能满足临床要求，模拟天然骨的成分和结构，寻找新的组织修复材料随即成为口腔种植学领域里的热点。富血小板纤维蛋白为自体全血离心的产物，是一种自体移植物，全血经低速离心的过程中促发凝血，血液中的纤维蛋白原缓慢聚合成纤维蛋白，结构为三分子网状结构。由于这种网状结构与人类天然的组织结构非常相似，又具有诱导细胞迁移和细胞增殖，从而加速愈合过程的功能。骨移植手术的初期，移植物内的细胞成分依靠进入的营养物质而存活。PRF 的纤维蛋白立体网状结构，使得营养成分及氧气轻松弥散至细胞周围，促进骨髓间质干细胞分化为成骨细胞，沉积骨质，加速成骨的形成。本文是在细胞水平上研究 骨髓间质干细胞分化为成骨细胞这一过程中PRF 膜的作用， 指导PRF 膜在整形外科及口腔种植等多领域里的应用。1材料与方法1．1材料1．1．1实验动物 新生（7天）新西兰大白兔两只，雌雄不 限。1．1．2 实验仪器及试剂 培养皿、离心管、 DMEM 培养基、青－链霉素溶液、胰蛋白酶、胎牛血清、I 型胶原酶、小鼠抗兔 I 型胶原蛋白单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG 多克隆抗体、DAB 显色剂、倒置显微镜、离心机、二氧化碳培养箱，10mL 离心采血管等。1．2方法1．2．1兔BMSCs 的分离培养 1．2．1．1 原代细胞的分离培养将出生7天的新西兰大白兔脱颈处死，75%乙醇浸泡10min ，在无菌操作下取双侧股骨和胫骨，去除肌肉，骨膜，剪去股骺，用注射器抽取完全培养基（含13%胎牛血清的DMEM ）冲出骨髓，反复吹打均匀制 · 71·第20卷第2期2012年2月 中国医学工程 China Medical Engineering Vol．20No．2Feb ，2012
附,分别形成纤维蛋白和血小板血栓,二者又会互相促进
YY/TXXXX.1《医疗器械血栓形成试验第1部分：犬体内血栓形成试验》标准编 制说明 一、工作简况 1.任务来源 根据食药监办械管〔2019〕23号文《国家药监局综合司关于印发2019年医 疗器械行业标准制修订项目计划的通知》确定的标准制修订工作计划，由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口，山东省医疗器械产品质量检验中心等单位负责制定《医疗器械血栓形成试验第1部分：犬体内血栓形成试验》方法 标准（项目编号：N2019066-JN）。 2.工作过程 在接到起草任务后，标准起草工作组认真研究，于2019年3月召开首次视频工作组会议，召集共同验证单位确定工作组讨论稿和标准验证方案，结合国内血栓形成试验的现状，在多次实验分析和验证的基础上，于2019年7月份形成征求意见稿，向各有关单位征求意见。 3.预期构建的医疗器械血栓形成试验标准体系 YY/T XXXX《医疗器械血栓形成试验》预期构建的标准体系如下： ——第1部分：犬体内血栓形成试验； ——第2部分：体外血栓形成试验。 本标准为YY/T XXXX的第1部分。 二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据。 1.制定本部分的主要参考文件 标准起草工作组按照GB/T1.1—2009的规则制定本部分。其他参考性文件如下： GB/T16886.4-2003《医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》 ISO10993-4:2017《医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》 2.试验原理 血栓一般发生在体内或半体内，当医疗器械/材料与人血接触后，材料表面如引起血浆蛋白如白蛋白粘附，粘附的蛋白层会激活凝血通路和引起血小板的粘
人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
纤维蛋白原(含临床意义)知识交流
纤维蛋白原(含临床意 义)
纤维蛋白原 纤维蛋白原一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质。纤维蛋白是在凝血过程中，凝血酶切除血纤蛋白原中的血纤肽A和B而生成的单体蛋白质。简单地说，就是一种与凝血有关的蛋白质，即凝血因子。 适应症用于先天性低纤维蛋白原血症、原发性和继发性纤溶引起的低纤缩蛋白原血症。用量用法静滴，60滴/分钟，视病情而定。 注意事项 偶有过敏反应。仅供静脉输注，速度宜慢，快速过量输入可发生血管内凝血。反复多次输注可产生抗纤维蛋白原抗体，少数人可形成血栓。可成为传播传染性肝炎的媒介。本品一旦被溶解后，应立即使用。溶解后应为澄清并略带乳光的溶液，允许有微量细小的蛋白颗粒存在，输注时应使用带有过滤网的输血器。血栓静脉炎、动脉血栓形成、心肌梗死、心功能不全者忌用。 规格 1．0/瓶，1．5/瓶。 纤维蛋白原（xianweidanbaiyuan）一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体。分子量340，000，半衰期4～6日。血浆中参考值2～4克/升。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。在此过程中，由于释放了酸性多肽，负电性降低，单体易于聚合成纤维蛋白多聚体。但此时单体之间借氢键与疏水键相连，尚可溶于稀酸和尿素溶液中。进一步在Ca+2与活化的ⅩⅢ因子作用下，单体之间以共价键相
连，则变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块，完成凝血过程。肝功能严重障碍或先天性缺乏，均可使血浆纤维蛋白原浓度下降，严重时可有出血倾向 进一步研究显示，纤维蛋白原与一种叫β3黏合素的受体结合，启动神经细胞上的表皮生长因子受体，后者会抑制神经轴突的生长。 这项研究显示脊髓受伤后血液的渗透会妨碍神经再生，揭示了血液与中枢神经系统损伤在分子水平上的联系。如果能找到方法阻止纤维蛋白原启动神经细胞受体，可望促进脊髓的修复，缓解脊髓受伤导致的瘫痪症状。纤维蛋白原发挥凝血功能时，结合的受体蛋白质与此不同，因此有关疗法并不会妨碍它发挥正常凝血作用。 临床意义 1．纤维蛋白原与肝脏疾病纤维蛋白原系肝脏合成,主要分布在血浆,亦存在于血小板和巨核细胞。正常血浆浓度为1.5～3.5g/L,因此当肝脏严重受损,使肝脏合成纤维蛋白原功能发生障碍,则血浆中纤维蛋白原浓度降低。纤维蛋白原是肝脏合成的一种血浆糖蛋白.可参与血栓及冠状动脉的形成和发展，是反映血栓状态一个指标，也是急性冠状动脉事件的独立预报因子之一。纤维蛋白原升高提示机体纤溶活性降低，促血栓形成。 2．纤维蛋白原与肾病综合征 ( NS) NS患者的凝血因子改变,以纤维蛋白原水平增高最为明显。纤维蛋白原水平增高可达10g/L,这是由于合成增加的结果,这种增高与其从尿中丢失的量成比例,但纤维蛋白原的分解代谢率则正常。NS患者的纤维蛋白原和胆固醇水平有显著相关性,而且两者与血清白蛋白水平呈负相关 3．纤维蛋白原与粥样硬化纤维蛋白原和纤维素与粥样斑块形成的关系极为密切。 已知纤维蛋白溶解机制受到多种因素影响,例如吸烟、糖尿病,尤其是高血清甘油三酯都能引起血浆纤维酶原激活物抑制剂升高,从而降低了纤溶酶原的合成。血液粘稠度比较高,这些均有利于纤维素的形成。纤维蛋白原是一种急性时相蛋白，作为凝血因子I由血液进入动脉壁内，在凝血酶作用下转变为纤维蛋白单体继发交联为纤维蛋白，可直接破坏内皮细胞吸附在红细胞表面，使动脉血栓发生率增加，并促进粥样斑快进展。另外血浆纤维蛋白原可沉积于血管壁，加速动脉粥样硬化，人们已发现动脉粥样硬化的斑块中纤维蛋白凝聚物的量组疾病纤维蛋白原含量均增高，并都具有血液粘度增高．动脉粥样硬化甚者阻塞的特征． 4．纤维蛋白原与心脑血管疾病对急性缺血综合征中血栓的研究表明,血浆纤维蛋白原水平是独立的危险因素,有冠状动脉阻塞病的患者血浆中纤维蛋白原水平较高,心肌梗死的范围也与纤维蛋白原增加程度密切相关。有不稳定心绞痛的病人,在其发生心肌梗死之前,
纤维蛋白原与冠心病(一)
纤维蛋白原与冠心病(一) 纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)是血浆中含量较高的大分子蛋白质，它主要通过以下途径参与血液调节：(1)受凝血酶等因子的作用形成不可溶解的纤维蛋白多聚体。(2)与血小板膜上受体结合导致血小板聚集。(3)以其本身或其降解产物影响纤溶系统。近来，大量研究证明，血浆Fg水平与冠心病之间存在密切的联系，现综述如下。1Fg的结构与功能 1.1Fg的结构正常血浆中Fg的含量为2～4g/L，其组成是不均一的，但绝大部分为分子量34万的分子，它是一种糖基化的蛋白质，其一般结构早在70年代末至80年代初就已清楚，分子由3对多肽链组成，由二硫键连结，形成对称的二体结构，通常用（Aα2、Bβ2、γ2）表示，一般将Fg的结构划分为中心区（E区）和外围区（D区），6条肽链的N端组成E区，纤维蛋白肽A（FPA）和纤维蛋白肽B（FPB）即位于该区。 1.2Fg的功能Fg可以参与凝血、血小板聚集及纤溶过程，从多个侧面调节血液循环。 1.2.1与凝血酶结合Fg是凝血酶的底物，X射线衍射报告，凝血酶的活性位点分为独立的两部分，其一是包含催化性结构Asp—His—Ser的催化活性中心，其二是与催化活性不相关联的纤原识别位点〔1〕，凝血酶作用于Fg的N端AαArg16和BβArg14处，分别释放出FPA和FPB，其中前者的速度快于后者，被切去FPA和FPB的Fg成为纤维蛋白单体，它可以进一步聚合以形成多聚体，在单体聚合过程中，α链C端的空间取向起着关键作用〔2〕。FPA和FPB 既是凝血酶作用于Fg的产物，又是凝血酶的底物，其中AαGly6—Arg16是凝血酶的结合位点〔3，4〕。Phe8和Gly12是不可替换的功能残基，这些氨基酸突变将导致异常Fg血症。凝血酶上与Fg非酶切位点结合部位被称为Fg识别位点(FRS)，由于水蛭素C端的电荷特性与纤维蛋白原上某段肽链相似，所以水蛭素与凝血酶上的FRS结合，这样就可灭活凝血酶块上被固化的凝血酶，使得溶栓治疗时可以有力地防止再次形成血栓，这就是为什么水蛭素较肝素更好地防止溶栓后血栓再形成的原因。 1.2.2与血小板上膜受体结合大量实验已证明，血小板膜上的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是包括Fg在内的许多粘附蛋白所共有小肽Arg-Gly-Asp(RGD)的受体，目前普遍认为，在Fg处于可溶解状态时，它通过RGD及γ链C端10～12肽（HHLGGAKQAGDV）来与血小板结合，有结果证明RGD与GPⅢa上217～231段的结合对血小板活化是极为重要的。 1.2.3与t—PA的结合Fg受凝血酶作用形成纤维蛋白，这对于生理止血很重要，同时也是病理过程血栓形成时的一个环节。纤维蛋白可被纤溶酶降解，而纤溶酶是由体内酶原形式经t—PA等激活物激活形成的，Fg不仅是纤溶酶的底物，同时它还能加强t—PA的活性，以前认为纤维蛋白是通过与t—PA上K2区及指环区结合而发挥功效的，近来的研究表明t—PA 的K1区也能参与同纤维蛋白的结合。 2Fg升高与冠心病关系的相关临床研究 Meade等对1511例40～60岁的对象进行了3年前瞻性研究〔5〕，观察凝血因子Ⅶ和Ⅷ，Fg，平均10年（7.3～13.5年）随诊，发现患缺血性心脏病（IHD）109例，其中5年内发病者59例，5年以上发病者50例，其Fg值为：3.15±0.71g/L（109例），5年内者为3.28±0.7g/L （59/109），5年以上者3.00±0.69g/L（50/109），而对照组为2.90±0.59g/L；Fg，Ⅶ与胆固醇值升高时，5年内IHD发病危险性分别增加为84%、62%及43%。说明Fg升高是IHD的危险因素之一。同时，研究也表明，当Fg值升高时，IHD危险性增加在较低年龄组比较高年龄组更具危险性。Ernst等也进行了大量的关于Fg与心血管病（CVD）的研究〔6～9〕，所有结果均表明Fg与CVD相关（见表1），调查发现，血浆Fg在上三分之一高限的含量组2～5年内IHD或冠心病〔8〕发生率是下三分之一Fg低含量组的3倍，若血浆Fg水平高出健康对照组平均值1～2g/L，5年内其发生IHD的概率是84%，而血浆胆固醇含量相应高出一个标准差时，其IHD发生率仅增加43%。 表1血浆Fg与心血管病（CVD）的关系(略)
富血小板纤维蛋白-PRF在口腔种植中的应用
富血小板纤维蛋白-PRF在口腔种植中的应用 发表时间：2016-02-01T15:18:50.177Z 来源：《健康世界》2015年11期供稿作者：王少华董卫华[导读] 山东青岛开发区第一人民医院口腔科 PRF可促进牙槽骨缺损修复，增高牙槽骨，促进种植体周围软组织愈合，治疗种植体周围炎。 山东青岛开发区第一人民医院口腔科 摘要：组织再生需要生长因子、成骨相关细胞、支架材料和良好的血供。其中富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）富含血小板及各种细胞因子，具有良好的促进软、硬组织再生的能力。临床口腔种植患者中有很多牙槽骨缺损或不足的情况，PRF可促进牙槽骨缺损修复，增高牙槽骨，促进种植体周围软组织愈合，治疗种植体周围炎。关键词：富血小板纤维蛋白；口腔种植；骨组织再生；牙槽骨缺损 对于很多牙槽骨骨量缺损或不足的患者，临床口腔种植时往往需要植入骨材料才能达到理想的种植修复效果。植骨材料可分为自身骨和异体骨。在植骨过程中，自身骨移植是移植骨材料中的最佳方法，因为其可提供骨移植所需的必要条件。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是继富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）之后的第二代血小板浓缩制品。其完全取自自体血，且制备简单，并富含血小板及各种细胞因子，具有良好的促进软、硬组织再生的能力。同时，PRF所含有的免疫细胞具有良好的调节炎症反应和抗感染能力。本文主要对PRF的制备方法、生物学特性及其在口腔种植医学研究中的应用作一综述。 1、富血小板纤维蛋白的制备方法 ①采血：取静脉血10ml置于试管内。②离心：以2500～3000r/min离心10～12min。③制备PRF膜：静脉血经离心后分三层，上层淡黄色澄清物为去血小板血浆，下层红色疏松物为红细胞碎片，其中间层为PRF凝胶。静置离心物3min后弃上清，取出中间层PRF凝胶，并用无菌纱布挤压成膜状，即可得到具有一定形态、弹性及韧性的PRF膜。④取PRF凝胶，盛于无菌种植器械工具内，剪碎加入人工骨粉，搅拌均匀呈粘稠凝胶状待用。 2、富血小板纤维蛋白的生物学特性 PRF产生的纤维蛋白为三分子立体网状结构，其凝胶组织较为疏松，孔隙大，弹性高。组织细胞及循环血中的干细胞能更快的长入其中，细胞因子也被大量的滞纳，并与纤维蛋白发生化学键结合。PRF 的作用机制归纳如下：①引导损伤部位组织的血管新生。②促进上皮增殖，封闭损伤部位。③网络免疫细胞，进行炎症调节。④引导循环血中干细胞的迁移、增殖和分化[1]。PRF 特殊的纤维蛋白网状结构使其具有多种作用：①可以机械性滞纳血小板、细胞因子、免疫细胞和循环血中的干细胞，并使这些物质在这样一个三维网状的空间内协同发挥作用。②细胞因子通过化学键与 PRF 内的纤维蛋白结合，从而相对稳定的存留于 PRF 凝胶内。③循环血中有较多的黏多糖，它与细胞因子之间具有很强的亲和力，PRF 中的纤维蛋白通过捕获黏多糖进一步加强了对细胞因子的滞纳能力。 3、临床应用 3.1 PRF在牙槽骨骨缺损修复中的应用 国内有学者对拔牙窝颊侧壁缺损进行的骨组织再生临床随机对照试验中，试验组使用PRF，对照组为阴性空白对照。在拔牙窝内，PRF 的纤维蛋白所搭建的三维网络空间内促进血小板、细胞因子和循环分子等不断的向拔牙窝中心迁移，并且彼此间相互协作，调节拔牙窝内的成骨机制，从而有效的保存了牙槽嵴的高度[2]。对比拔牙窝的愈合情况和组织学切片后发现，试验组拔牙窝愈合最好，牙槽骨丰满，且呈凸状；对照组呈凹陷状，丰满度差。试验组在新骨成骨量上有明显的优势，获得了良好的颌骨丰满度，成功进行了种植修复。 3.2 PRF对牙周软组织再生的作用 附着于种植体周围的牙龈组织对于种植体最终的修复美学效果有着很大的影响，同时也是种植体周围牙槽骨与外部口腔环境的重要屏障，对防止牙龈萎缩和提高种植体寿命有重要的作用。临床中对因严重牙周病失牙且要求种植修复的患者同时进行软硬组织增量术。术中使用PRF与人工骨粉混合而成的凝胶增加骨量，同时应用PRF膜弥补缺损的软组织，在种植后期获得良好的软组织美学效果. 4.PRF的应用展望 PRF 作为新一代血小板浓缩制品，它由纤维蛋白网、血小板及粒细胞等组成，利用骨组织再生原理实现颌骨的再生，同时加速牙周软组织的再生与附着，在临床应用中显示了很好的促进组织愈合能力，对于口腔种植修复治疗拥有重要意义.因其具有制备过程操作简单、不需要添加其他制剂的特点，且其成本低廉、取材方便，PRF在今后的口腔种植领域将得到越来越多的关注。参考文献： [1]Choukroun J，Diss A，Simonpieri A，et al.Platelet-rich fibrin（PRF）：asecond-generation platelet concentrate.Part IV：clinical effects on tissue healing.Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology Oral Radiol Endod.2006；101（3）：e56-60. [2]许丰伟，柳忠豪.中国组织工程研究，2012.16（4）
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸