内毒素法

细菌内毒素检查法标准操作规程

1 目的

建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。

2 范围

适用于细菌内毒素的检验操作。

3 职责

3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责；

3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。

4 定义

无

5 内容

5.1 概述与原理

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。

基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。

细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。

5.2 仪器与用具

5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。

5.2.2 细菌内毒素标准品

细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。

5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。

5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。

5.2.5 试验器具

5.2.5.1 试管，称量瓶、取样勺等内毒素检查所使用的器具洗净后，需经250℃干热灭菌30分钟以上，以去除可能存在的外源性内毒素。

5.2.5.2 微量移液器或移液关等需使用量程的，需经过校验，符合试验要求。5.2.5.3 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用表明应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

5.2.5.4 恒温水浴锅：试验开始前应先把恒温水浴锅温度调到37℃，进行预热。

5.2.5.5 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在

6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用适宜的酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子

5.3 鲎试剂灵敏度复核试验

5.3.1 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

5.3.2按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。

5.3.3 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。

5.3.4将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

5.3.5将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min±2min。

5.3.6将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（十）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。保温和拿取试管过程应避免受到振动,造成假阴性结果。

5.3.7 试验结果计算

当最大浓度2λ的4管均为阳性，最低浓度0.25λ的4管均为阴性，阴性对照为阴性时试验认为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。

λC=lg-1(∑X/4)

注：式中X为反应终点浓度的对数值（1g），反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

5.3.8 结果判断

当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。

5.4 干扰试验

药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时用以验证供试品是否存在干扰作用。

5.4.1 干扰试验预试验

预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰试验提供依据。

5.4.1.1 将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD＝cL∕λ。

5.4.1.2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。保温（60±2）min后，观察并记录结果。

5.4.1.3 结果判断

5.4.1.3.1当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，试验为有效。

5.4.1.3.2当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。

5.4.1.3.3当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在于扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD＝CL∕λ），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或U/ml表示。5.4.2 正式干扰试验

检验某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

5.4.2.1 制备内毒素标准对照溶液：取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（方法同5.3.2）。

5.4.2.2 制备含内毒素的供试品溶液

5.4.2.2.1 将供试品稀释至预试验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.

6.2.1中的同一支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。

5.4.2.2.2简化法制备含内毒素的供试品溶液，如0.5ml浓度为4.0λ的内毒素标准溶液＋0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液，即得到1ml的含2λ内毒素的浓度为5mg/ml的供试品溶液。

5.4.2.2.3 鲎试剂的准备：取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂28支。

5.4.2.3 将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），l列2支（管）。其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外10支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列2支（管）。其中的4列2支每列每支分别加入0.1ml含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。

5.4.2.4 加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，保温（60±2）min后，观察并记录结果。5.4.2.5 试验结果计算

如两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（E t）。

E t=lg-1(∑X t/4)

注：X t为供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。

5.4.2.6 结果判断

5.4.2.

6.1 当Et在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。

5.4.2.

6.2 当Et不在0.5λ～2λ时，则认为供试品在该浓度下干扰试验。应使用适宜方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数的稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。

5.4.2.

6.3 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环

境中性生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

5.5 供试品细菌内毒素检查

在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次试验须做2支阳性对照和2支阴性对照。

5.5.1 确定最大有效稀释倍数（MVD）

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MV D=cL/λ

注：L为供试品的细菌内毒素限值；

c为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L。

λ为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

5.5.2阳性对照溶液的制备

用供试液将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同5.3.2）。

5.5.3 阴性对照液，即细菌内毒素检查用水。

5.5.4 取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解。轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装8管备用。

5.5.5 取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。

5.5.6将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架垂直放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2min。

5.5.7 结果判断

当阳性对照、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照为阴性时，试验方为有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，认为不符合规定；如2管中一管为阳性，1管为阴性，需进行复试。复试时按上述方法另取4支供试品管复试，若所有供试品管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。若供试品的稀释倍数小于MVD而供试液出现不符合规定时，需将供试品稀释至MVD重新试验，再对结果进行判断。

5.7注意事项

5.7.1 试验前，须用肥皂洗手，用75%酒精棉球消毒。

5.7.2 溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。

5.7.3 由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。

5.7.4 进行干扰试验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行。

5.7.5 在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时，各个试验中要求的对照应同时进行，并在试验有效的情况才能进行计算和判断。

5.7.6 试验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止微生物的污染。

5.7.7 本试验操作过程应防止内毒素的污染。

5.7.8 可溶于水的供试品，除另有规定外，要使用细菌内毒素检查用水溶解、稀释，不能用其他溶剂替代。