食品毒理学实验bk

食品毒理学实验指导

食品毒理学实验

（一）毒理学实验的目的和要求

食品毒理学实验的目的是通过实验掌握有关的毒理学实验技术和方法，培养分析问题和解决问题的能力。

为了提高实验效率，特作如下要求：

１．课前预习实验指导，对实验目的、方法、步骤应有充分了解，明确本次实验的目的和理论根据，作到心中有数，避免实验中出现忙乱和差错。

２．进入实验室后，首先检查实验桌面上的仪器、器皿、药品等实验器材是否齐全及有无损坏。

３．实验时务必安静，不能喧哗，作到整齐整洁，有条有理。严格按照实验指导的步骤进行操作，准确计算用药量，注意爱护实验动物，节约实验材料和药品。

４．仔细阅读实验指导，根据实验指导进行小组分工，尽可能每人都有操作机会。

５．及时地、准确地将观察到的数据和反应如实记录。实验完毕，根据实验结果写出实验报告。

６．实验后整理实验器材，作好实验室的清洁卫生工作。

实验室规则

１．实验室须保持安静、整齐和清洁。

２．实验完毕将实验台、桌、仪器、用具等擦洗干净。仪器、用具如有损坏，应报告老师，各组轮流打扫实验室。关好门窗，切断水源及电源。

３．节约实验用品，爱护器材及动物。

４．随时注意安全操作。

实验一、食品毒理学实验基础

常用实验动物的捉取方法

小鼠：用右手提起尾部，放在鼠笼盖上或其他粗糙面上，向后上方轻拉，此时小鼠前肢紧紧抓住粗糙表面，迅速用左手拇指和食指捏住小鼠颈部皮肤并以小指和手掌尺侧夹持其尾根部固定手中。

兔：捉拿时一手抓其颈背部皮肤，轻轻将兔提起，另手托其臀部。

二、实验动物的选择毒理学中研究外源化学物的基础毒性主要是进行体内试验，常选用大白鼠和小白鼠、家兔。根据不同实验目的，可选用不同实验动物。例如，皮肤刺激实验，可选用家兔，因为家兔为皮肤刺激实验的敏感动物。

动物应注明来源及品系。除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者：大白鼠、小白鼠为出生后2～3个月左右，体重分别为180～240g和18～24g；家兔为2～2.5kg，猫为1.5～2kg；狗为出生后一年左右。实验中一般均应采用两种性别动物进行试验。所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。

三、染毒途径和方式

1、经口染毒

①灌胃灌胃体积依所用实验动物而定，小鼠一次灌胃体积在0.1～0.5ml/kg体重，大鼠在1.0ml/100g体重之内，家兔在5ml/kg体重。

②喂饲喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行

摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水在推算动物实际摄入化学物的剂量。由于摄入的化学物量不准确，仅适用于动物数量较大的毒理学实验。此种方法更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。

2、经呼吸道染毒

凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，经呼吸道染毒有两种类型，一是动物自行吸收，一是人工动物气管注入。动物自行吸入呼吸道染毒又分静式吸入染毒与动式吸入染毒两种方法。

静式吸入染毒，即在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物造成含一定浓度受试物的空气环境，使受试动物在规定时间内,经吸入而达到染毒，故适用于短时间染毒的试验使用。

动式吸入染毒，即采用机械通风为动力，连续不断地将含有已知浓度受试物的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气体，使染毒浓度保持相对稳定，这样可使染毒时间不受染毒柜(室)容积的限制，也可避免动物缺氧、二氧化碳积聚、温度增加等对试验结果的可能影响，故适用于较长时间以及反复染毒的试验使用。

气管注入，将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究。

3、经皮肤染毒

经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，所以角质层薄的皮肤部位更易吸收。面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。如，家兔可取5cm×6cm、豚鼠取3cm×4cm、大鼠取1.5cm～2.0cm直径的面积，小鼠取1.0cm～1.5cm直径的面积。实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象，剔除不合格动物。

4、其它途径染毒

注射途径包括静脉注射(大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉)、肌肉注射、皮下注射及小动物腹腔注射染毒。但注射时应控制注射体积。

四．几种常用实验动物的染毒途径的操作方法

小鼠

１．灌胃法

左手拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤，无名指和小指将尾部紧压在手掌上，使小鼠腹部朝上。右手持灌胃管（注射针头稍加弯曲制成）经口角插入口腔，用灌胃管向后上方压迫小鼠头部，使口腔与食道成一直线，再将胃管沿上颚壁轻轻推进食道，推注药液。

２．皮下注射

注射部位可选背部皮下，操作时轻轻拉起背部皮肤，将注射针头刺入皮下，稍稍摆动针头，若容易摆动则表明针尖的位置确定在皮下，此时注射药物。拔针时，轻捏针刺部位片刻，以防药液逸出。

３．肌肉注射

小鼠固定如上述，将注射器针头刺入小鼠臀部外侧肌肉，注入药物。

４．腹腔注射

左手固定动物，使小鼠呈头低位，腹部朝上，右手持注射器，在左或右侧下腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进３～５ｍｍ，然后使针头与皮肤呈４５。角方向穿入腹腔。针尖进入腹腔可有抵抗消失感，此时可轻推药物。

５．尾静脉注射

将小鼠装入笼内，使其尾部外露．尾部用温水浸泡半分钟或用酒精棉球擦拭，使其血管充血和表皮角质软化，以拇指和食指捏住尾根部的两侧，阻断其静脉回流，使尾静脉充盈明显，

以无名指和小指夹持其尾尖，用中指托起尾巴，使之固定。选其一侧尾静脉穿刺，如针头确在血管内，则推注药液。需反复静脉注射时，易从尾端开始。

家兔

１．灌胃法

可用固定箱，将开口器固定于兔口腔中，术者将胃管经开口器中央小孔慢慢沿上颚壁插入食道，为避免插入食道，可将胃管的外口端放入水中，如有气泡逸出，说明已插入气管，应拔出从插。若无气泡逸出，则用注射器将药液灌入，并以少量清水冲洗胃管。灌胃完毕，先拔出胃管再拿出开口器。

２．腹腔注射法

参照小鼠腹腔注射法。

３．静脉注射法

兔静脉注射一般采用耳缘静脉（兔耳缘静脉为静脉，中央的血管为动脉）。先用酒精棉球涂擦耳缘静脉部皮肤。以左手食指放在耳下将兔耳垫起，并以拇指压耳缘部分，右手持带有针头的注射器，尽量从血管远端刺入血管，注射时针头先刺入皮下，沿皮下向前推进少许，然后刺入血管。针头刺入血管后再少向前推进，轻轻推动针栓，若无阻力和局部皮肤隆起发白现象，即可注药。注射完毕后，用棉球压住针眼，拔去针头。

几种动物不同注射途径注射量(ml)范围

注射途径小鼠大鼠豚鼠兔狗

静脉肌肉皮下腹腔0.2~0.5

0.1~0.2

0.1~0.5

0.2~1.0

1.0~

2.0

0.2~0.5

0.5~1.0

1.0~3.0

1.0~5.0

0.2~0.5

0.5~1.0

2.0~5.0

3.0~10

0.5~1.0

1.0~3.0

5.0~10.0

5.0~15.0

2.0~5.0

3.0~10.0

－

五、实验动物处死及生物标本采集

1．实验动物处死方法大小鼠可用颈椎脱臼法，然后股动脉放血。兔、豚鼠、狗等一般用股动脉放血处死。应尽量采用适当的处死方法，减少实验动物的痛苦。

2．血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血，如需血量较多可用眼眶静脉丛采血或处死时股动脉放血采血。

六、毒性反应的观察与检查

1、一般性指标

1）.一般综合性观察指标

①动物体重实验动物在亚慢性方式接触外来化合物过程中，有多种因素均可影响动物体重的增长，包括食欲变化、消化功能变化、代谢和能量消耗变化等。体重变化的表示方式，可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量加以比较和统计学处理。也可将接触组与对照组同期体重百分增长率(以接触化合物开始时动物体重为100%)进行统计和比较。

②实验动物在接触外来化合物过程中所出现的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间均应记录和分析。

③脏器系数是指某个脏器与单位体重之比值或称脏/体比值。单位体重通常以100g 体重计,如肝/体比，即指(全肝湿重/体重)×100。其依据是实验动物在到达成年末期或老年期之前,尤其是小动物均随着年龄的增加体重增长,且各脏器与体重之间的重量比值有一定规律。若某脏器受到受试化学物损害,此比值将发生改变。一般包括心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺等。在排除称重前的失水、年龄、性别、营养不良等因素的影响后,脏器系统增大,表示脏器充血、水肿或增生肥大性变化等；脏器系数减

小,表示脏器萎缩、退行性变化等。脏器系数的观测可依据实验要求加以选用。

2）.一般化验指标主要指血象和肝、肾功能的检测，在亚慢性试验中研究外来化合物对实验动物的毒性作用，使用这类指标，一般为筛检性和探讨性。通常血象检测包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。肝、肾功能也是一种常规指标，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣镜检等。

2、病理学检查亚慢毒性试验中应重视病理学检查。凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检。

试验的观察期限，如受试动物于接触受试物后24～48h内中毒死亡，未发现有迟发中毒作用时，一般观察7～14d即可。否则应适当延长观察期限，直到中毒症状基本恢复正常为止，延长观察需要2～4周。观察期限，特别要注意动物的饲养和管理，以防止与受试物无关的意外死亡情况发生。

实验二、化学物质半数致死量（LD50））的测定

【目的】.求出受试化合物对一种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。掌握LD50测定的意义、方法、计算过程。

【原理】LD50是指使一群体动物中半数死亡的剂量，是衡量化学物质毒性大小的指标，是评价药物优劣的重要参数。了解化学物质单次给药或短时间内多次给药后动物所产生的毒性反应及其严重程度，为安全使用及监测提供一定的参考。LD50的测定方法很多，较为常用的有改良寇氏法、简化概率单位法。

本试验将一定浓度和一定体积的药物，按一定比例一定方式给予小鼠，观察2-4小时，记录不同剂量小鼠的死亡情况，计算半数致死量，以确定药物急性毒性。

【器材】鼠笼、烧杯、2ml注射器等。

【药品】亚硝酸盐溶液（5个剂量）

【动物】小鼠

【方法】

1、预试验模拟实验剂量范围，找出引起0～100%的估计致死量。

2、正式试验

（1）取小鼠50只，体重20±2g，♀♂各半，随机分为5组，10只/组。

（2）剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6～0.9，设4～5个剂量组。

（3）给药亚硝酸盐溶液，ip。5个剂量组。

（4）统计按改良寇氏法公式进行计算。

LD50=log-1[Xm-i（∑P-0.5）](公式1)

Xm：最大剂量组剂量对数值

i：相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值)

P：各组动物死亡率，用小数表示（如果死亡率为80%应写成0.80）

∑P：各组动物死亡率之总和

n：每组动物数

Sx50=i×(公式2)

Sx50：logLD50的标准误

X50=logLD50

LD50的95%可信限=log-1（X50±1.96Sx50）(公式3)

LD50的平均可信限=LD50±(LD50的95%可信限的高限-低限)/2(公式4)

【结果】填入表1。

表1各组小鼠用药、死亡情况及有关计算

组别动物数剂量对数剂量死亡率P2其他数据

(n)(mg/kg)（X）（P）

1

2

3

4

5

【注意】

1、预试验要摸准药物引起0和100%死亡率剂量的所在范围。

2、正式试验时各剂量按等比级数分组，应避免最大剂量组的死亡小于80%，最小剂量组死亡率大于20%，否则改用其他方法计算。

3、室温：20℃为宜。认真观察中毒症状情况。

实验三、家兔血液、肝脏和肌肉中游离磺胺浓度的测定

［目的］

掌握磺胺药物在体内组织和血液中浓度的测定方法，了解磺胺嘧啶在体内的分布情况。［材料］

药物－－10%磺胺嘧啶钠注射液、15%三氯醋酸溶液、3%三氯醋酸溶液、0.1%亚硝酸钠溶液、0.5%氨基磺酸胺溶液、0.1%二盐酸Ｎ－（１－萘基）－乙二胺溶液、磺胺嘧啶钠标准液、95%乙醇、0.1Ｎ氢氧化钠、0.4N硫酸。

器械－－光电比色计、漏斗、滤纸、量筒、刻度吸管、试管、试管架、天平、剪刀、镊子、研钵、烧杯、吸耳球等。

动物－－家兔

［实验原理］

具有游离氨基的磺胺类药物在酸性介质中经重氮化后，可与盐酸Ｎ－（１－萘基）－乙二胺产生偶合反应生成红色的偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较，即可求得体液中、组织中磺胺类药物的含量，剩余的亚硝酸盐影响测定，以氨基磺酸胺分解除去。

［方法］

取兔一只称重，静脉注射10%磺胺嘧啶钠注射液２ml/kg体重，用药后１５分钟，心脏采血，用游离磺胺测定法测定血液、肝脏和肌肉中的药物浓度。

1、血液中药物浓度测定法：

取血液1ml,放入盛有31ml蒸馏水的烧杯中，混匀，放置１５分钟，加15%三氯醋酸溶液８ml混匀，放置２分钟过滤，滤液备用。（可取血凝块1g代替）

2、肝脏、肌肉中药物浓度测定法：

取血后将兔处死，打开腹腔，取肝组织1g，置研钵中剪碎，加少量细沙研磨，研碎后加31ml 蒸馏水混匀，放置１５分钟，加15%三氯醋酸溶液８ml混匀，放置２分钟过滤，滤液备用。另取腿部肌肉组织1g，方法同上。

3、取5只试管按下表程序加入试剂单位：ｍｌ

试剂空白管标准管血滤液

管肝滤液

管

肌肉滤液管

滤液5．05．05．0

3%三氯醋酸溶液5．0

磺胺嘧啶钠标准液5．0

0.1%亚硝酸钠0．50．50．50．50．5混匀置3分钟0.5%氨基磺酸胺0．50．50．50．50．5混匀置2分钟0.1%二盐酸Ｎ乙二胺2．52．52．52．52．5混匀置3分钟用分光光度计于550nm波长处进行比色，以空白管校正光密度到０点，读取标准管和测定管光密度，计算游离磺胺药物的含量。

样品的药物浓度＝测定管光密度／标准管光密度×标准液浓度×样品的稀释倍数。

例如：测定管光密度为0.4,标准管光密度为0.5,则

0.4/0.5×0.375mg%×40=12mg%

[记录并计算]

血药浓度＝————×0.375mg%×40＝mg%

肝药浓度＝————×0.375mg%×40＝mg%

肌肉药浓度＝————×0.375mg%×40＝mg%