流式细胞仪入门
流式细胞仪入门
----- 秦华 译
目录
前言
第1章综述
第2章液流系统
第3章散射光信号及荧光信号
3.1 散射光信号
3.2 荧光信号
第4章光电系统
4.1 光平台
4.2 光学滤片
4.3 信号探测器
4.4 阀值
第5章数据分析
5.1 数据采集及显示
5.2 设门
5.3 细胞亚群的数据分析
5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选
6.1 分选
第7章激光器及光路校正
7.1 激光器的工作原理
7.2 光路校正
第8章习题答案
序论
学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述
流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。
流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：
z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。
z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。
在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。
单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲
习题：综述
1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？
2 大多数流式细胞仪使用何种光源？
3 流式细胞仪的三大系统是什么？
4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？
5 液流包绕细胞形成？
6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？
7 由粒子激发的光由收集。
8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对错）
9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对错）
第二章液流系统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。
因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。
流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：
图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦
图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦
样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。
z台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交（图2-1）。除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。
z大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交（图2-2）。且样本压力连续可调。
增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。
z高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距
离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。
z低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。
习题：液流系统
1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？
2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？
3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？
4 单个细胞悬液在内注入。
5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为效应。
6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？
7 对于台式机，样本的固定压力是多少。
8 增加样本压力，也就是样本流速和液柱。
9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。
10 加大流速会降低检测分辨率。（对错）
11 定性检测时可使用高流速。（对错）
第三章散射光信号和荧光信号的检测
上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。
3.1 散射光信号
粒子折射激光产生散射光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。
前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号（见图3-1）。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。
侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见图3-1）。SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。
图3-1 细胞的光散射特性
上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数
组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。
图3-2 FSC、SSC二维散点图
习题：散射光信号
1 什么时候会发生光散射现象。
2 光散射信号与细胞的哪些特性有关。
3 与激光束方向相同的光散射称为散射。
4 FSC与细胞的哪些特性相关？
5 与激光束方向呈90度角的光散射称为散射。
6 SSC与细胞的和相关。
7 和双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。
3.2 荧光信号
荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。
能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。
目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光（详见第7章）。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。
图3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱
如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就
符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。虽然PE 的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。被检测到的荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
图3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱
图3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合
对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记确
认细胞类型（见图3-5）。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。
习题：荧光信号
1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射。
2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为。
3 由荧光染料发射的波长称为。
4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。
5 能够激发FITC和PE的波长是多少。
6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是和。
7 荧光素标记抗体用于检测。
第四章 光学系统
光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。
4.1 光平台
流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。图4-1和图4-2分别为台式机 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平台系统。
图4-1 台式机 FACS Calibur 光平台系统
图4-2 台式机 BD LSR光平台系统
在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。大型机的光平台系统见图4-3。
图4-3 大型机 FACS Vantage SE 光平台系统
习题：光平台
1 光平台为 的激光器提供了一个固定平面。
2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。
3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对 错）。
4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置
是不变的。
4.2 光学滤片
当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。光电倍增管（PMTs）检测到的荧光信号常常是很微弱的。在光电倍增管（PMTs）前设置滤片可以使相当窄的一波长范围内光通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的发射峰值。这种滤片称为带通（BP）滤片。如：FITC检测器前的滤片标志为530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者说允许通过的波长范围在515nm和545nm之间。BP 500/50则表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。
流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片（LP）和短通滤片（SP），长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。（见图4-4）。
分光器的主要作用是完成光的收发。二色性反射镜就是其中一种。560短通二色性反射镜如图4-1所示发射560nm或小于560nm的波长（如图4-1所示）。大于560nm的波长被反射。
图 4-4 光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围
习题：光学滤片
1 检测器前放置滤片作用是什么。
2 带通滤片530/30发射的波长范围是到。
3 用于光的收发。
4 滤片允许特定波长及以下的光通过，而滤片
允许特定波长及以上的光通过。
4.3 光电探测器
处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压），然后到相应的通道。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。光电倍增管（PMTs）对光信号比光电二极管敏感，所以前者用于检测较弱的SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强的FSC信号。
粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先光信号或光子由光电倍增管（PMTs）或光电二极管转换成相应的电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。当粒子位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。当粒子偏离激光束时，脉冲回到基线（如图4-5所示）。
图4-5 充电脉冲的产生
充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子数量，放大器可设置为线性放大或者对数放大（Lin或Log）。对
数放大（Log）常常用于把阴性信号从微弱的阳性信号中分离出来；而线性放大（Lin）通常用于放大散射光信号和荧光信号。
充电脉冲通过模数转换器把0-1000mV的脉冲转换成为代表0-1,000mV通道的数值。通道数值经由输入输出（GPIO）数据线传送到计算机进行处理显示（见图4-6）。
图4-6 模拟信号到数字信号的转换过程
习题：光电探测器
1 收集FSC光信号。
2 敏感度高的收集SSC光信号和荧光信号。
3 探测器产生电流，经由放大器转换成电压。（对错）
4 模数转换器（ADC）的作用。
流式细胞仪技术参数
一、流式细胞仪技术参数 1 工作条件： 1.1 电源要求: 220V (±10%)、50-60HZ 1.2 环境温度:16-30℃ 1.3 湿度：20-80% 2 用途：免疫分析、淋巴细胞亚群分析；细胞周期分析、凋亡分析；感染分析、肿瘤细胞分析；多重细胞因子分析等。 3 技术规格和参数 3.1 激发系统： 3.1.1 激发光源：405nm紫色固态激光器、488nm蓝色固态激光器和640nm红色固态激光器，固定光路，空间立体激发。 3.1.2 激光塑形：自动的多棱镜塑形系统，光斑大小：9x65um椭圆形光斑 3.1.3 流动室规格：180x430μm 3.2 荧光收集和检测 3.2.1 光胶耦合物镜，数值孔径1.2，大面积收集发射荧光。 3.2.2 每一激发激光对应一个独立检测单元，光胶耦合物镜自动分开汇集每一激光激发的发射荧光进入相对应检测单元，避免光谱交叉。 *3.2.3 配备1个独立八角型全反射检测系统、2个独立三角型全反射检测系统 3.2.4 光学检测系统内部采用全反射检测光路系统，荧光信号到达检测器只经过一个长通滤光片，信号能量损失最小。 3.2.5 检测系统依次优先检测易衰减的长波长信号，保证弱信号灵敏度。 *3.2.6 共计12个信号检测器，包括10个光电倍增和和2个散射光探测器。
3.2.7 荧光通道组合：405nm紫色激光器对应3个检测通道，滤光片包括450/50nm、 525/50nm、 605/40 nm；488nm蓝色激光器对应4个检测通道滤光片包括530/30nm、 575/25nm、695/40nm、780/60 nm； 640nm 红色激光器对应3个检测通道，检测滤光片包括：670/30nm、712/21nm、780/60 nm。通道之间最低光谱交叉，滤光片带有智能芯片，直接插拔，自动识别。 *3.2.8 荧光检测灵敏: FITC<100MESF，PE<50MESF(提供英文原版参数)；CFDA检测结果FITC<5MESF，PE<5MESF（提供检测报告）。 *3.3 样本分析速率：>32,000个细胞/秒(提供英文原版参数)。 3.4 变异系数：全峰宽CV<3% *3.5 采用正压上样系统，非注射泵或蠕动泵。样本残留量<0.2%。 3.6 最小样本量：≤30ul 3.7 检测颗粒大小：0.5-50μm 3.8 数字信号处理：18bit动态范围，符合IEEE 32bit浮点分辨率。3.9 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,可区分多倍体细胞、粘连细胞。 3.10 可溶性蛋白分析：具备多重可溶性蛋白分析功能，包括：细胞因子、炎症因子、趋化因子等；可达单管数十重分析，包括：多重定量及动力学分析。 *3.11 液流车：独立液流车，避免振动影响仪器主机光路和液流；自动控制所有压力、鞘液、清洗液等，大体积液体储备保证长时间、稳定工作；鞘液桶20L，废液桶10L，清洗液桶5L，关机液桶5L。开关机自动清洗液路，正常状态鞘液消耗<1.10 L/h，待机状态鞘液消耗<1 mL/h。 3.12 配置淋巴细胞亚群自动分析软件，无需手动设置，实现淋巴细胞亚群分型的全自动化。 3.13 主软件：Windows系统，原版专业化流式数据收集及处理软件, 可按用户需求设置条件进行数据分析和报告。
流式细胞仪入门
流式细胞仪入门 ----- 秦华 译
目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章习题答案
序论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
【基础科学】BD FACSCALIBUR流式细胞仪操作手册(共27页)
BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。 一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 ?FSC Diode 只收488 nm波长散射光 ?SSC PMT 只收488 nm波长散射光 ?FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） ?FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） ?FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）
3. 仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12 μl /min MED：样品流速：35 μl /min HI: 样品流速：60 μl /min 功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪(FloｗCytometｒｙ) 1 流式细胞仪得概念及其发展历史 1。1 流式细胞仪得基本概念流式细胞仪（flｏw cｙtｏnleｔｒy,FＣM)就是对高速直线流动得细胞或生物微粒进行快速定量测定与分析得仪器，主要包括样品得液流技术、细胞得计数与分选技术,计算机对数据得采集与分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，就是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学与计算机等学科知识综合运用得结晶。流式细胞术就是一种自动分析与分选细胞或亚细胞得技术。其特点就是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性得多参数测量,且在统计学上有效。 １。2 流式细胞仪得发展简史最早得流式细胞仪雏形诞生于19３４年，Moｌｄavan提出使悬浮得单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量得设想。1953年Crosｌand-Tayｌor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Ｃｏulteｒ、Parｋer ＆ Hoｒst、Kａmentsky、Ｇohde、Fulｗyｌeｒ、Herｚｅｎberｇ等人得不断改进,设计了光电检测设备与细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪得物理连接及多参数数据得记录与分析、开创了细胞得免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上得应用。近２0年来,随着流式细胞仪及其检测技术得日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面得工作,以扩大FＣＭ得应用领域与使用效果。 宋平根得《流式细胞术得原理与应用》就是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述得最为详尽与透彻得中文著作.这本书非常详细地介绍了流式细胞术得历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学与生物工程中得应用,非常适合从事此方面专业研究得人。由于这本书就是13年前出版得，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识得人士来说,这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中得应用。杨蕊概括了流式细胞仪得工作原理,简单提及了流式细胞仪得应用。本文在分析这三篇论著或文章得优缺点后，用比较通俗得语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解得一些原理,并对目前市场上得主流型号进行了客观得性能概括。 2 流式细胞仪得工作原理与技术指标 2。1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室与液流系统:激光源与光学系统;光电管与检测系统;计算机与分析系统,其中流动室就是仪器得核心部件。这四大部件共同完成了信号得产生、转换与传输得任务. 流动室与液流系统
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项) 2014-07-07 00:26:14来源：https://www.360docs.net/doc/0315905333.html,评论：0我要评论 [流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。[关键词:流式细胞仪注意事项]… ??一、流式细胞仪的检测范围 1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。 2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。 二、流式细胞仪的临床应用 1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡； 2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测； 3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。 三、流式细胞仪的科研应用 主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。 四、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一) 直接免疫荧光标记法 取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二) 间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 五、质量控制和注意事项 流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。
流式细胞仪上机培训手册(仅供参照)
流式细胞仪上机操作培训手册 一、样本处理 以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例 1)取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC； 2)编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管： a)1号管：相应同型对照； b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管； 3)加样。用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记 好的流式管底部； 4)洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min； 5)染色。弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流 式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。） 6)洗涤。加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min； 7)重悬。弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCanto II或BD Accuri C6)。 （注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。）8）试验结果分析。（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。参考值：
二、上机检测 BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪 1 打开流式细胞仪电源 2 启动计算机，打开软件登录 3 确保软件连接到流式细胞仪 必要时，点击Cytometer > connect 检查液体水平 1 启动流式细胞仪后，检查液体水平 低液面水平或者废液桶满都用红色指示。
2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。 3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。 检查气泡 1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。
自己总结：流式细胞仪的原理和用途
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
流式细胞仪临床应用手册
流式细胞仪临床应用手册 案场各岗位服务流程 销售大厅服务岗： 1、销售大厅服务岗岗位职责： 1)为来访客户提供全程的休息区域及饮品; 2)保持销售区域台面整洁; 3)及时补足销售大厅物资,如糖果或杂志等; 4)收集客户意见、建议及现场问题点； 2、销售大厅服务岗工作及服务流程 阶段工作及服务流程 班前阶段1）自检仪容仪表以饱满的精神面貌进入工作区域 2）检查使用工具及销售大厅物资情况，异常情况及时登记并报告上级。 班中工作程序服务 流程 行为 规范 迎接 指引 递阅 资料 上饮品 （糕点） 添加茶水工作1）眼神关注客人，当客人距3米距离侯客迎询问客户送客户
注意事项 15度鞠躬微笑问候：“您好！欢迎光临！”2）在客人前方1-2米距离领位，指引请客人向休息区，在客人入座后问客人对座位是否满意：“您好！请问坐这儿可以吗？”得到同意后为客人拉椅入座“好的，请入座！” 3）若客人无置业顾问陪同，可询问：请问您有专属的置业顾问吗？，为客人取阅项目资料，并礼貌的告知请客人稍等，置业顾问会很快过来介绍，同时请置业顾问关注该客人； 4）问候的起始语应为“先生-小姐-女士早上好，这里是XX销售中心，这边请”5）问候时间段为8:30-11:30 早上好11:30-14:30 中午好 14:30-18:00下午好 6）关注客人物品，如物品较多，则主动询问是否需要帮助（如拾到物品须两名人员在场方能打开，提示客人注意贵重物品）； 7）在满座位的情况下，须先向客人致
待； 阶段工作及服务流程 班中工作程序工作 要求 注意 事项 饮料（糕点服务） 1）在所有饮料（糕点）服务中必须使用 托盘； 2）所有饮料服务均已“对不起，打扰一 下，请问您需要什么饮品”为起始； 3）服务方向：从客人的右面服务； 4）当客人的饮料杯中只剩三分之一时， 必须询问客人是否需要再添一杯，在二 次服务中特别注意瓶口绝对不可以与 客人使用的杯子接触； 5）在客人再次需要饮料时必须更换杯 子； 下班程 序1）检查使用的工具及销售案场物资情况，异常情况及时记录并报告上级领导； 2）填写物资领用申请表并整理客户意见；3）参加班后总结会； 4）积极配合销售人员的接待工作，如果下班
BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
B D F A C S C a l i b u r流式细胞仪 FACS101Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载。 一、BDFACSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1.电源开关：在BDFACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2.光学系统：BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射 以BDFACSCalibur基本型为例 ?FSCDiode只收488nm波长散射光 ?SSCPMT只收488nm波长散射光 ?FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545nm） ?FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606nm） ?FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围（波长>650nm） 3.仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12?l/min MED：样品流速：35?l/min HI:样品流速：60?l/min
功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME结束，仪器恢 复STANDBY状态。 4.储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter，及空气滤网Airfilter。请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。 ?鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖 上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。 ?废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 ?鞘液过滤器：0.22?m过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。 ?气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。 ?空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。 5.上样品区： 上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 SampleInjectionTube，将样本输入流动室，还有就是支撑架 TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。 ?进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。 ?支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。 液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组 成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启 动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支 撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当 支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时， 让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到 STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到 流动室中。
Partec流式细胞仪
Partec流式细胞仪介绍 德国PARTEC公司成立于1967，是流式细胞仪的制造鼻祖，目前是专业生产制造流式细胞分析产品的跨国公司。 PARTEC公司早在1968年九生产出第一台商用流式细胞仪，凭借数十年的研制经验和众多流式分析的专利技术，德国PARTEC公司在流式细胞分析设备领域，成为世界上著名的、仪器型号、种类全球最齐的流式细胞仪制造商及供应商。 PARTEC公司在全球流式细胞技术领域已取得数十项关键性专利技术。Partec公司生产的CyFlow型流式细胞仪于2004年1月成为世界上首台升上太空的流式细胞仪，进入太空站进行太空领域的研究工作。这不仅表明Partec公司的产品功能强大与全面，它可以胜任任何将在太空开展的相关试验与研究，同时，也证明了其产品的优良性能及可靠的质量。这些都依赖于Partec公司雄厚的实力与先进的科技水平。 Partec 全球第一台商业化流式细胞仪诞生的公司 全球唯一一家专门流式细胞仪系列产品的生产商 CyFlow 全球唯一一台登上太空的流式细胞仪 全球第一台移动便携式流式细胞仪 产品列表
应用领域 CyFlow流式细胞技术已经应用到医疗健康研究、临床诊断，微生物和工业应用以及农业科学、动植物研究和水产研究等领域 医疗保健——免疫学，血液学，病理学，癌症研究，DNA分析 微生物——细胞计数，生物技术和细胞培养死/活细胞分析，毒理学，生物监测，病毒检测 工业应用——食品业质量控制，酵母分析，发酵控制，工艺优化，颗粒计数，粒度分布 农业——倍体分析，植物基因组大小检测，单性生殖监测 细胞计数——真核细胞培养（哺乳动物细胞培养、植物细胞培养），原核细胞培养，血制品白细胞计数，免疫亚型细胞计数，精子计数 细胞功能分析——细胞周期和细胞增殖，细胞活力、死/活细胞计数，细胞凋亡 酿酒业——快速自动化检测，死/活葡萄酒酵母分析和计数 艾滋病毒监测——艾滋病人的后续治疗诊断专用，针对成人和儿童的、准确的、低成本的CD4和CD4％检测 技术优势
流式细胞仪临床应用手册
目录
第一部分流式细胞术简介 1流式细胞术定义 流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。 流式细胞分析技术(flowcytometry，FCM)又称流式细胞术，是20世纪70年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性--在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。目前，流式细胞术已经广泛用于临床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。 2流式细胞仪工作原理 制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。 3流式细胞仪的主要结构 光学系统，液流系统，信号处理及放大系统，计算机系统。
4流式细胞仪检测信号 散射光信号：FSSS 荧光信号：FL1FL2FL3FL4… 5流式结果数据分析 6流式细胞仪检测样品 可用于流式细胞仪检测的样本种类多样，包括各种细胞（如外周血、骨髓、细针穿刺、灌洗液、实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等；血清、血浆、培养上清、细胞裂解液等。 如果检测样本为实体组织时，我们可以用物理化学（天然，机械研磨/消化）等方法将其制备成单细胞悬液5×105－1×107cells/ml ，并在上机前用300目筛网过滤。 7流式细胞仪检测范围 细胞结构 细胞功能 单参数直方图分析 双参数点图分析 双参数点图分析 双参数等高图分析 双参数密度图分析 三维图分析
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞
流式细胞仪的原理及应用
山西大学研究生学位课程论文（2013 ---- 2014 学年第一学期） 学院（中心、所）：生物技术研究所 专业名称：微生物学 课程名称： 论文题目：流式细胞仪的原理及其应用 授课教师（职称）：崔晓东 研究生姓名：常姣 年级：研一 学号：201323001003 成绩： 评阅日期： 山西大学研究生学院 年月日
流式细胞仪的原理及其应用 姓名常姣专业微生物学 摘要本文简要论述了流式细胞仪( flowcyt ometry, FCM) 的工作原理, 并对其某些科学领域研究中的应用进行阐述, 包括在生物学、免疫学、临床学中的研究应用。 关键词 FMC；生物学；免疫学；临床学 流式细胞仪( fl o w c y to me tr y, F CM) 研制、发展、革新和应用领域的扩展，都是由生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、流体力学、激光技术、分子生物学、有机化学和物理学等多个学科综合发展和应用而实现的。近代流式细胞仪，由于单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学等众多研究领域的应用愈来愈广泛和重要，尤其在生物学中对细胞周期的动力学分析、细胞因子、细胞凋亡、信号传导、R N A / D N A 的分析、细胞表面受体及特异性抗原的分析等领域发挥着独特作用，具有操作简单、分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点。 1流式细胞仪的构成及工作原理 流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞制成单细胞悬液, 经荧光染料染色后加入样品管, 在一定气体压力下待测样品被压入流动室。待测细胞在鞘液的包裹下单行排列, 依次通过检测区, 被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后, 产生散射光和荧光信号。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT) 接收。散射光分为前向角散射(forwardscatter, FSC) 和侧向角散射(sidescatter, SSC) 。前者主要反映被测细胞的大小, 后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等, 以及细胞内颗粒的性状。光信号通过波长选择通透性滤片后, 经光电倍增管接收后转为电信号, 再经数/模转换器转换为可被计算机识别的数学信号, 以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来[1,2]。 流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 便会在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器中, 从而实现细胞分选[2]。 2流式细胞仪的应用 流式细胞术的应用，简单用一句话概括就是，凡能被荧光分子标记的细胞或微粒均能用流式细胞仪检测。其中细胞生物学领域是流式细胞术在基础研究中应用范围最广泛的领域，因为最初这个技术就是为此目的而设计的。 2.1流式细胞仪在生物学中的应用 流式细胞仪在生物学中的应用越来越广泛,如在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、分子免役学、植物学等等许多生物学基础学科的应用和在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子及细胞分型等研究中的应用[3]。 2.1.1 对凋亡细胞的分析 细胞凋亡是生物体生长发育过程中出现的正常现象, 在生物体形态构成、正常细胞更替以及维持
流式细胞仪临床应用手册
目录 第一部分流式细胞术简介 (1) 第二部分流式项目检测列表 (4) 第三部分流式细胞术在各类疾病中的应用 (7) 第一章感染性疾病 (7) 第二章肿瘤、细胞治疗应用 (9) 第三章血液系统疾病 (14) 第四章器官移植检测 (15) 第五章风湿免疫性疾病 (16) 第六章呼吸系统疾病 (18) 第七章消化系统疾病 (20) 第八章泌尿系统疾病 (21) 第九章心脑血管疾病 (22) 第十章妇产科及儿科相关疾病 (24) 第十一章内分泌患者免疫功能检测 (26) 第十二章皮肤科疾病 (27)
第一部分流式细胞术简介 1 流式细胞术定义 流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。 流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)又称流式细胞术，是20世纪70 年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性--在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。目前，流式细胞术已经广泛用于临床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。 2 流式细胞仪工作原理 制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。 3 流式细胞仪的主要结构 光学系统，液流系统，信号处理及放大系统，计算机系统。
流式细胞技术原理
流式细胞术简介 一、流式细胞术发展简史 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组
BD流式细胞仪工作原理
BD流式细胞仪工作原理 流式细胞仪的工作原理是：将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。 这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。 计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。 一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。 将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。对分选出的细胞可以进行培养或其它处理，做更深的研究。 美国BD C6型流式细胞仪 首先C6流式细胞仪能避免操作新手的一个容易犯的错误;--;调整电压，同步化