生物化学专题

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共价修饰酶

共价调节是利用蛋白质的共价变化来调节酶的活性的，有些共价变化是可逆的，如蛋白质的磷酸化；有些则是不可逆的，如酶原激活

（一）可逆共价修饰的调控（共价调节酶）

共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。有多种类型： 1 ser thr tyr 残基的磷酸化

2 thr 残基的腺苷酰化

3 arg cys 残基的ADP-核糖基化

其中磷酸化是最普遍，发生最多的，真核细胞的1/2~1/3的蛋白质被磷酸化，在这个过程中，有两种酶参与反应，一种是蛋白激酶，催化蛋白质发生磷酸化反应；另一种是蛋白质磷酸酶，催化蛋白质的去磷酸化反应。

共价调节与别构调节的区别:

1 共价修饰系统能把调节物的效应放大，即级联放大效应

2 共价修饰系统有较大的能力进行生物学整合，能把胞内代谢和胞外刺激（包括电刺激）联系起来，别构调节作用于胞内，特点在于灵敏、迅速；共价调节也作用于胞内但是涉及整体，在数分钟或者更长时间内起作用。

（二）不可逆的共价调节（酶原的激活）

有些蛋白质合成时不具有活性，经蛋白酶专一性作用后，构象发生变化，变成有活性的蛋白。这种不具生物活性的蛋白质称为前体。如果活性蛋白质是酶，这个前体就称为酶原。特点是不可逆。属于此类的有

*消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）

*血液凝固系统中的酶

*某些蛋白质激素，如胰岛素由胰岛素原激活而成

*存在于皮肤和骨骼中的纤维蛋白——胶原，由前胶原激活而成。

例如：

胰蛋白酶原

肠激酶

胰凝乳蛋白酶原弹性蛋白酶原

胰蛋白酶

胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶

羧肽酶原羧肽酶

RNA转录调控（主要为原核生物转录调控）

⑴转录水平

⑵翻泽水平

⑶加工水平转录后加工、翻译后加工

⑷蛋白质活性调节

其中最关键的是⑴，基因表达的控制主要发生在转录水平,原核生物尤其如此。所以RNA转录调控专门列出

（一）几个重要概念

操纵子：在细菌基因组中，编码一组在功能上相关的蛋白质的几个结构基因，与共同的控制位点组成的一个基因表达的协同单位，称为操纵子。

结构基因（S structural gene）：表达一种或功能相关的几种蛋白的基因

控制位点：操纵基因（O operator）

启动子（P promotor）位于操纵基因上游，为RNA聚合酶结合位点。

调节基因(R regulator gene)：可转录翻译出诱导（或阻遏蛋白），控制操纵基因的开与关。

调节基因启动子操纵基因结构基因结构基因结构基因......结构基因R P O S1 S2 S3 ....... Sn

正调控和负调控

在没有调节蛋白存在时，基因是关闭的，加入调节蛋白后,基因表达被开启，此为正调控。

在没有调节蛋白存在时，基因是表达的，加入调节蛋白后,基因表达被关闭，此为负调控。

在正调控中，调节蛋白称诱导蛋白。

在负调控中，调节蛋白称阻遏蛋白。

(二)大肠杆菌乳糖操纵子（Lac操纵子）

1 乳糖操纵子负调控

LacZ、LacY、LacA为结构基因，上游依

次为

操纵基因、启动子和调节基因LacI。

当细胞内无诱导物（乳糖或IPTG）存在

时，阻遏蛋白与操纵基因结合。由于操纵基

因与启动子有一定程度重叠，妨碍了RNA聚

合酶在-10序列上形成开放性启动子复合物。

当细胞内有诱导物（乳糖或IPTG）存在

时，诱导物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白

构象，使之迅速从操纵基因上解离下来。这

样RNA聚合酶就能与启动子结合，并形成开

放性启动子复合物，从而开始转录LacZYA

结构基因。

2 乳糖操纵子正调控

在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。

3调节机制

大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。

倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP 与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。

在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。

DNA一级结构分析及PCR技术

DNA测序的生物学意义

DNA是遗传信息的储存者和传递者，遗传信息是由碱基序列体现的，碱基序列略有改变，即可引起遗传信息的显著改变。所以DNA测序是研究DNA功能的基础。

DNA测序的实验方法

双脱氧终止法（Sanger法）

[原理]DNA 测序

DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddNTP 可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；

②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的

放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

[操作]

1．单链模板与引物退火

(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。

2．链延伸/终止反应

(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，臵冰浴中待用。

(2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5μl分别加入这4只微量离心管中，臵37℃预温1分钟以上 (说明：4种mix液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于<500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。一般应用short即可)。

(3)标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14μl(已有)；标记用混合物(1abellingmix)3μ1；已标记混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀释液2μ1。总体积20μ1。

轻轻混匀，简短离心，臵室温5分钟，立即接下步反应。

(4)从“标记反应”混合物中，分别取4.5μl加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。简短离心，37℃保温5分钟。

(5)向每只离心管中加入5μl反应终止液，混匀，简短离心。

(6)变性反应：在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4℃。

另取4只微量离心管，标好“A”、“G”、“C”和“T”。从上述每一链延长/终止反应的试管中取3

电泳。

3．制备电泳凝胶及电泳

(1)制备胶模：取双块制胶玻板，先用泡沫海绵沾“洗洁净”液仔细擦洗，用水彻底淋洗，干燥后继用酒精清洗，晾干，再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的—面擦一遍，蒸馏水淋洗，干燥 (注意：清洗时应戴一次性手套操作)。

将其中一块玻板平臵台上(硅烷处理过的—面朝上)，两侧各放臵一条隔离条(最好选用上方厚为0.2mm，下方厚0.4mm的楔形条)，另取—块玻板(硅烷化处理过的—面朝下)，对准放臵在上述玻板上，两侧及—面边缘用胶带封严，并用文具夹夹紧，制成胶模。

(2)配制电泳凝胶：向1只100ml烧杯中加入下列试剂；20%丙烯酰胺溶液20ml；10×TBE缓冲液5ml；46.7%尿素溶液25ml。总体积50ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。混匀，过滤除去不溶物，臵100ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟，加入250μl 10%过硫酸铵，50μlTEMED混匀。

(3)注胶：立即将配好的凝胶用50ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右)，注意防止气泡，如有气泡产生，可敲击该部位玻璃，使气泡上升排除。从上面插入梳齿背，深入胶面约10-12mm。将胶模水平放臵45-60分钟，待凝胶聚合。

(4)电泳：凝胶聚合后，拨掉梳齿，撕去玻板下缘胶带，用蒸馏水淋洗凝胶表面，以除去未聚合物质。将胶板装臵在电泳槽上，上下槽加入缓冲液，注意排除凝胶下缘气泡。接通电源，40W预电泳45-60分钟。预电泳结束后，断电。插入样品梳，梳齿向下插入凝胶中3mm左右。用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔)，用记号笔标明A、G、C和T4个小槽，每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2μl。接通电源，40W恒压，电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。如待测片段较长而需继续点样，则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5cm时切断电源，用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽)，重复上样操作，然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电，停止电泳。

4．放射自显影及结果分析

将凝胶板自电泳槽取下后水平放臵，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。

可将凝胶切下一小角以示方向。

在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下臵凝胶干燥器中干燥。

于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，臵70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。

PCR技术PCR 原理动画

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

PCR技术基本原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或

经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应

作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应

原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链

互补的半保留复制链

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul

PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。

②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

5’3’

3’5’

94℃变性1min

3’5’5’3’

50℃退火1min

循环35~40次

3’53’

72℃延伸2min

5’3’

3’5’

PCR产物的分析

可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR 产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法

分离纯化实验（蛋白质、核酸、酶）

?蛋白质的抽提材料预处理及细胞破碎（机械、渗透、反复冻融、超声波、酶法）

粗分离（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、超滤、吸附）

细分离（见下分离纯化方法）

电泳法SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

等电聚焦

双向电泳

脉冲电泳

?蛋白质分离

纯化主要方法层析法凝胶过滤层析

离子交换层析

亲和层析

离心法差速离心

速率区带离心

电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳：RNA和小于1kb的DNA片段

琼脂糖凝胶电泳：DNA,迁移率：超螺旋DNA> 线形DNA >环形DNA

脉冲电泳：可达104kb的DNA

?核酸分离纯化

主要方法层析法羟基磷灰石柱层析：除去核酸混合物中的RNA和蛋白质、

结合温度改变，可按碱基组成分离DNA

亲和层析: 分离带有特定序列的核酸，如poly(A)mRNA

离心法---氯化铯密度梯度超离心：分子密度梯度：

RNA >超螺旋DNA>环形DNA >线形DNA >蛋白质

紫外吸收法：280nm处有最大吸收

280nm-260nm吸收差法：蛋白质浓度（g/ml）=1.45OD280-0.74OD260凯氏定氮：

（）

?蛋白质含量G-250(红棕色)

测定考马斯亮蓝染料结合法：Pr(10-100μg/ml) 蓝色复合物（正比）595nm比色

Cu2+

双缩脲法：双缩脲OH- 紫色复合物（正比）灵敏度差可用来快速鉴定

紫外吸收法：RNA(μg/ml):A

260

/(0.024*L)*稀释倍数

DNA(μg/ml):A

260

/(0.020*L)*稀释倍数

C

U SO

4

、K

2

SO

4

钼酸根还原剂

定磷法：H

3PO

4

+H

2

SO

4

△H

2

O

2

P(无机) H+磷钼酸复离子鉬蓝

660nm比色

?核酸含量浓HCl 3，5-二羟基甲苯（地衣酚）

测定定糖法：RNA △核糖糠醛绿色复合物670nm比色

FeCl

3,CuCl

2

H+ H+ H+

二苯胺法：DNA △脱氧核糖β，ω-羟基-1-酮基戊醛二苯胺蓝色物质595nm比色

?酶的分离纯化（见蛋白质部分）要注意：

为保持酶活力不受损失，操作应在（０℃～５℃）低温下进行，如用有机溶剂分离，温度应

更低（－２０℃～－１５℃）

为防止重金属离子使酶失活，需向抽提液中加入少量（ＥＤＴＡ）

为防止酶分子-SH被氧化，需加少量（巯基乙醇）

分离纯化的酶如需长期保存，需用（冰冻法）干燥除去水分，制成酶干粉，在低温下保存