小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定

小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定

摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。

关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE

前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。

在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3]

近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4]

1实验器材

1.1实验动物

昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。

1.2主要仪器

5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一）

2实验方法

2.1过氧化氢酶的分离提取

颈椎脱臼法处死小鼠(6只），取肝脏；加入51mL预冷匀浆缓冲液(0.05mol/L,pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇），用组织捣碎机匀浆3min。缓慢滴加3mL的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min；匀浆液4℃ 6000rpm离心30min，收获上清液。留样：取匀浆后上清液120μL，加入40μL 4×电泳上样Buffer，沸水浴5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。另取200μL匀浆后上清液-20℃冰箱保存备用。

2.2盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加36ml 0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h；将盐析溶液离心（4℃，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；用24ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（4℃5000rpm , 10min），弃去沉淀，保留上清液；留样:取盐析后上清样品120μL，用40 μL4×电泳上样Buffer制样，煮5min，备用于SDS-PAGE检测。-20℃冰箱保存。将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；将上清液放入透析袋内，置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液）中一周，（中途更换一次透析液）；一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃，7500rpm，10min）后，收集沉淀，用2ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min （用手动玻璃匀浆器助溶），离心（4℃，5000rpm，10min）后，收获上清液。取上清样品120μL，加40 μL 4×电泳上样Buffer沸煮5min，放置-20℃冰箱保存备用。将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩2天，待样品浓缩至1.2mL收样，放置-20℃冰箱保存。

2.3凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶[5]

实验室老师准备凝胶。实验时取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层棉花。将层析柱垂直夹于铁架上，夹紧层析柱下端的止水夹，向柱中加入约7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60mL）时为止，关闭止水夹子。凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液，最后放入略小于层析柱内径的滤纸片；打开层析柱出口，控制流速为0.5mL/min (10滴/min)，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L ，pH7.8)流洗平衡20min；浓缩样品；加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液500μL，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L ，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L ，pH7.8)洗脱，保持0.5mL/min（约10滴/min）的流速；当样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。收集管依次在407nm和280nm波长下，以磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线；合并收集OD407nm和OD280 nm 重叠峰值管，再次测定即为最终纯化得到的产物；留样取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，再取纯化样品60μL，用20μL4×电泳上样Buffer制样沸煮5min备用SDS-PAGE检测,

样品放入放置-20℃冰箱保存。 2.4 Lorry 法测定纯化蛋白含量

取标准蛋白按表1示，绘制标准曲线；匀浆样品稀释50倍，100倍，层析样品稀释5倍，10倍，按照表2示进行操作,测定在650nm 下吸光度值，在标准曲线下得出蛋白含量。以H 2O 2为底物,用过氧化氢酶催化其分解1min,加入硫酸终止催化反应,并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H 2O 2 , 换算出减少的H 2O 2 的量,进而计算出酶的活力。在Km 值测定中采用此法测定酶活力。过氧化氢酶活力单位定义为:以每分钟催化1μmol H 2O 2 减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位(U) 。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。

1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（0.1mg/mL ）

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 生理盐水（mL ） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂AB(9:1) 混合液（mL ）

1

1

1

1

1

1

混匀后置于50℃水浴10min ，冷却

试剂c （mL ）

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

立即混匀，置于50℃水箱保温20min ，冷却后测定650nm 吸光度

值

7（匀浆稀释50倍） 8（匀浆稀释100倍）

9（层析稀释5倍） 10（层析稀释10倍） 稀释的待测样品（mL ） 20μL 10μL

200μL

100μL

试剂AB （9:1）1

1

1

1

表1 不同浓度标准蛋白组配置

表2待测样品试剂配制

混合液（mL）

混合后50℃水浴保温10分钟，冷却

试剂C（mL） 3.0 3.0 3.0 3.0

立即混匀，置于50℃水箱保温20min，冷却后测定650nm吸光度值，查标准曲线，以g/L为单位

2.5 双倒数作图法测定纯化过氧化氢酶米氏常数[6]

取未知浓度的H2O2溶液2mL和25%H2SO4 2.0mL,用0.002mol/LKMnO4滴定至微红，记录滴定毫升数，重复实验，取平均值，计算H2O2 浓度；将层析样品稀释2000倍，匀浆样品稀释3000倍（置于6号瓶中）；取6只干燥的50mL锥形瓶，编号，按表3示进行操作；反应10min，立即加入25% H2SO4 2.0mL终止反应；用标准0.002mol/L KMnO4进行滴定，记录消耗KMnO4的体积。

表3 过氧化氢酶的稀释

瓶号 1 2 3 4 5 6

H2O2mL 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 1.00

蒸馏水mL0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 1.50

酶液mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 2.6 SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量

实验室老师安装夹心式垂直板电泳槽和配胶及凝胶板的制备; 加样，预电泳采用30mA 90min。待样品进入分离胶后，改为30mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记；将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜；考马斯亮蓝染色1h，用蒸馏水漂洗数次，再用脱

色液脱色，直到蛋白质区带清晰；将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距蓝色条带间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），计算相对迁移率，绘制标准曲线。

表4 分子量标准蛋白

Marker 分子量分子量log值

磷酸化酶b 91400 4.96

牛血清白蛋白66200 4.82

卵清蛋白42700 4.63

碳酸酐酶31000 4.49

溶菌酶14400 4.16

3 实验结果

3.1分离纯化的结果

实验采用sephadexG-200葡萄糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过检测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特异吸波长）和280nm波长下的吸光度值变化，合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，只可获得纯化的过氧化氢酶。如表5和图1所示可知纯化的过氧化氢酶在7号和8号管中[6]。

表5 层析后蛋白吸光度变化曲线

3.2 Lorry法测蛋白质含量[7]

测的匀浆样品的蛋白浓度为17.6mg/ml,层析纯化后蛋白浓度

表6 标准蛋白质纯品

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1mg/mL标准蛋

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

白液/mL

待测蛋白/mL 0.1 0.2 0.01 生理盐水（mL）１0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.9 0.8 0.99 试剂A（mL）0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 试剂B 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 试剂C 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 每管中蛋白质

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

含量/mg

吸光度值/A650nm0 0.12 0.19 0.30 0.39 0.46 0.33 0.51 1.47

图2 标准蛋白曲线

3.3小鼠过氧化氢酶Km 值测定

经K 2MnO 4标定计算得H 2O 2浓度为0.039mol/L , 由图2可得出Km 值为0.133mol/L

图3 过氧化氢酶Km 值测定

表7 过氧化氢酶Km 值测定

3.4 SDS-PAGE测定蛋白相对分子质量

蛋白质相对分子质量中溴酚蓝相对迁移距离为41mm，待测样品相对迁移7.5mm，结果如表8所示.由图4标准曲线可知，待测

蛋白相对分子质量为60.25KD

表8 标准蛋白质纯品Array

图4 SDS-PAGE标准曲线

3.5 蛋白质酶活测定

4 讨论

本次实验采用一般生物化学实验方法从小鼠肝脏中提取、纯化过氧化氢酶，之后对其蛋白质相关性质进行检测，测的Km值为0.191mol/L，蛋白相对分子质量为60.25KD,与所查的酶分子量相近

[8]。通过这次大实验加深了我们对课本理论知识的理解，对于生化

基本实验方法以及简单分子生物学操作有了一些了解。

此次实验过程中暴露出一些自身的不足，现总结如下：

1、实验过程中由于操作不当导致粗提液部分丢失存在误差。比如，在第一次实验匀浆制备过氧化氢酶粗提液时，加入缓冲液及匀浆时都会造成误差。在对匀浆液进行搅拌时，由于速度过快致使出现了一些泡沫，可能破坏了蛋白质的结构，使部分酶失活。

2.在盐析和透析过程中有几乎每一个步骤都涉及到溶液的量取。在量取过程中，溶液的量不好把握，有可能加多或者加少，由此造成一定的实验误差。盐析第二步离心后弃上清保留沉淀，有可能把沉淀倒出一部分，损失了一部分过氧化氢酶。第三步离心后也保留上清损失了一部分。再把上清液装入透析袋过程中，透析袋没有封闭好造成一些杂质进入或过氧化氢酶丢失。

3、在层析过程中，装柱时加入的玻璃棉过厚或者凝胶床表面不平整等都能产生误差，在层析过后所得层析液不纯，还含有一些杂蛋白或其他杂质。在第三步平衡过程中，没有控制好流速，使流速过快，或凝胶管出现了干胶或者断层。在加样时也有可能没有将样品完全加入柱床上而是残留在管壁使蛋白质损失，或在洗脱过程中流速过快，致使样品带扩散，得到的层析液不纯。

4、Lorry法测纯化的过氧化氢酶浓度时，多次使用移液管量取液体，在使用移液管时视线没有与液面最低点平行使量取的液体量或多或少，还可因为向锥型瓶中加入液体时有部分残留在移液管中，使加入的液体量不准确。取不同溶液的移液管有可能混用了，也可导致量取的溶液的量不准确。在加入试剂AB后要水浴再冷却然后再加试剂C，由于操作失误，没有冷却就直接加入试剂C，给实验造成误差。最后在测每一管溶液的吸光度时，可能没有用标准溶液先调零造成后面测量的吸光度都不准确。实验中出现

的失误导致做出的图不理想。

5、在测定过氧化氢酶米氏常数时，先开始标定过氧化氢溶液的浓度，由于没有把握好滴定终点导致测得的浓度不准确，后面的计算产生很大误差。在层析产物和匀浆产物与过氧化氢反应时没有及时加入硫酸终止酶促反应，或在滴定时没有把握好滴定终点，导致加入的高锰酸钾量或多或少，使实验结果出现误差。

6、在SDS-PAGE法测蛋白质的分子量试验中，蛋白质分子的性质不同，迁移率不同，在胶中不同位置聚集浓缩成带，电泳分离得到的蛋白质区带本应是直条状的几何形状，但实际上，在各种因素的影响下，凝胶中蛋白质区带有各种各样的形状。在测量距离时没有把握好具体的测量位置而使测得的数据存在误差，所以求出的相对迁移率存在误差。

参考文献

[1]刘灵芝,钟广蓉,熊莲等.过氧化氢酶的研究与应用新进展[J].化学与生物工程2009,03:14～16

[2]赵继学.过氧化氢酶的测定方法与临床应用价值.[J]西部医学2009,21:2164～2165

[3]王华芳，展海军.过氧化氢酶活性测定方法的研究进展. [J]科技创新导2009,19:7～9

[4] 杨道理.蛋白质纯化的方法选择[J]实用医药杂志2004,21(12)1121～1123

[5] 姜招峰,杨世杰,周翔.血清中过氧化氢酶活力的化学发光微量分析法[J]白求恩医科大学学报1989,15;94～95

[6]李仕飞, 刘世同, 周建平, 罗天雄;分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的研究;安徽农学通报2007,02:45～47

[7]朱德荣,段惠军等.现代医学实验技术[M ].北京.人民卫生出版社. 2002

[8] 周娜磊,李玥,高媛等.大鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及性质.[J]氨基酸和生物资源.2009,31(2):56～58