疟原虫镜检技术操作规范

疟原虫镜检技术操作规范

疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范

一、血片制作

（一）所需器材

载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）

采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤

1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。如图1

2、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜

厚血膜：用推片的一角，取血一小滴（约4微升），置于平置的载玻片上，由里向外一个方向旋转约4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

薄血膜：以推片一端的中部取血一小滴（约1微升），使血滴与载玻片接触，血液沿推片边缘向两侧展开，将推片与载玻片保持25-30度，均匀而迅速适当地用力向前推成舌形薄血膜。薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）。

二、固定

（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管

（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

三、染色

〈一〉吉氏染染色法

（一）所需器材

1、吉氏染液（原液）

2、器具染色用的盘子、染色缸、烧杯、吸管若干。

染色及冲洗用水蒸馏水、冷开水、自来水、pH7.2缓冲液。

（二）操作步骤

1、单片染色单张血膜染色可取蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水或pH7.2的缓冲液1ml加入吉氏染液原液1-2滴，混合均匀后浓度约为2～5％的吉氏稀释液，均匀滴在厚、薄血膜上，染色20～30分钟。

注意：

（1）浓度约为2～5％的吉氏稀释液现配现用；

（2）新鲜厚血膜充分干燥后才能染色；

（3）厚、薄血膜一起染色。

2、多片染色用吉氏染液成批血膜染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2～5％吉氏染液(2ml吉氏原液与98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入pH7.2缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2～3次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。

4、冲洗染色后不要将玻片上残余染液直接迅速倒掉，应将玻片连同玻片上的染液一起放在水中轻轻漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒

沾污血膜。

〈二〉珠海贝索瑞氏—姬姆萨快速染色方法（本实验室使用）

1，瑞氏—姬姆萨A溶液：瑞氏染料，姬姆萨染料

2，瑞氏—姬姆萨B 溶液：磷酸盐缓冲液

3，方法：厚血膜先滴加蒸馏水溶血数分钟，倾去水滴，再加A溶液1-2滴，均匀滴在厚、薄血膜上，染色1分钟，然后加

B 溶液1-2滴，染色3—10分钟后冲洗，冲洗方法同上。

5、镜检

（一）器材

1、显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）。

2、镜油

3、擦镜纸

4、二甲苯或酒精乙醚。

（二）操作步骤

1、血膜上滴加镜油滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。

2、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。

3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，

自左而右，逐个视野顺序查看。发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。

4、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。

四、注意事项

1、染色前血膜的保存新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。

2、患者资料应登记详细，确保能追踪随访，个案调查、登记、统计等资料应有专人负责保管。

3、镜检人员应加强自身防护，操作戴手套、穿工作服。

4、镜检室应保持环境及器具的整洁，试剂和染色用具要顺序放置在固定的操作台上。

5、显微镜用毕，取擦镜纸沾取二甲苯或酒精乙醚擦拭油镜头清除镜油，并清洁载物台及目镜。显微镜保存做到防尘、防潮、防霉。

6、医疗垃圾按医院废物管理相关规范进行处置。