诱导性多功能干细胞——产生,发展,应用及展望
诱导性多功能干细胞
——产生，发展，应用及展望
张博文，杨星九，李玖一，白末*
摘要：在胚胎干细胞研究因伦理道德和免疫排斥问题而受阻的时候，诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，以下简称iPS细胞)的横空出世为干细胞研究指明了一条新的方向。近几年来iPS细胞研究取得了许多突破性的进展，其广泛的应用前景更向人们昭示着一个新的时代的到来。本文主要从iPS细胞的发展历程入手，综述了iPS细胞的理论及应用研究的关键进展，并对之后的研究进行了展望。
关键词：诱导性多功能干细胞，胚胎干细胞，病毒，癌变，细胞治疗
Abstract:When the embryonic stem cell research was blocked by ethical issues and immune rejection, induced pluripotent stem cell (hereinafter referred to as iPS cells), turned out for stem cell research indicated a new direction. iPS cells’ research in recent years has made many breakthroughs, prospects for its wide application to remind people of a new era. This article summarizes the theory and application of iPS cells, and the key to progress in the study, from the iPS cells to start the development process, and discussed the study in the future.
Key words：induced pluripotent stem cell, embryonic stem cell, virus, Canceration, cell therapy
IPS细胞是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。iPS细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。近几年，iPS细胞的研究突飞猛进，本文中结合最新的研究结果，综述了iPS细胞的产生背景、发展历程及其应用前景，并对今后iPS的研究发展进行了客观的展望。
1产生背景
干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)更是具有全部的全能性，能够分化成人体内的所有细胞，具有非常广阔的应用前景。
早在上个世纪，人类就已经开始针对干细胞进行研究，试图通过各种不同的方法得到多能干细胞，其中突出的方法有胚胎干细胞（ES细胞）直接植入法；体细胞核转移
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*张博文，杨星九，李玖一：资料查阅与论文编写白末：资料查阅与论文整合
法（即通常所说的克隆）；细胞杂交法，利用多能干细胞与体细胞融合的方法，但这些方法的广泛应用在技术、细胞来源、免疫排斥，尤其是伦理宗教和法律等方面存在诸多限制。[24]。于是，在2006年，一种新的方法诞生了，这便是诱导多能干细胞法，通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞直接重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。
4种不同方法获得多能干细胞图（自Joanna Hanley）
2 大事件表：
3诱导性多能干细胞的应用新进展
诱导性多能干细胞（iPS cells）与胚胎干细胞（ES）具有相似的多能性，且能够克服ES细胞在来源和伦理方面所遇到的巨大挑战，绕过了宗教、法律、伦理的禁区。同时，由于iPS细胞可来自患者自身，能解决免疫排斥问题。所以iPS细胞在组织工程学，再生医学，细胞替代治疗及药物研发方面有着广阔的应用前景。
3.1糖尿病治疗
糖尿病是最为严重的现代病之一，全球有近三亿患者，中国有4320万，它严重危害着人类的健康，目前尚无根治办法。不过，在2008年，日本Keisuke教授等人利用iPS 细胞诱导产生了能分泌胰岛素的细胞。[31]这证明了iPS细胞有分化为胰岛β细胞的能力。将这种细胞移植到患者体内，可能为Ⅰ型糖尿病的治疗提供了一种可能的途径。
3.2在心血管疾病治疗方面的应用
Nelson和Almudena、Martinez将人皮肤成纤维细胞通过oct4 、sox2、klf4和c-Myc 四个基因诱导为iPS细胞并植入小鼠子宫，发现其可分化为心脏实质细胞。将其嵌入重新构建的心脏、血管平滑肌和内皮组织后使心脏细胞收缩性恢复，电位稳定性增强。[32]他们的研究证明了iPS细胞有想心脏分化的潜能。因此iPS细胞可用于修复心肌梗塞对心脏造成的损伤。而心血管疾病是全球致死人数最多的疾病。该项研究为心血管疾病患者带来了一丝曙光。
3.3 治疗遗传病
在治疗遗传病方面，iPS技术的诞生开辟了一条不同于以往基因疗法的道路。例如，2007年，Hanna率先用iPS细胞治疗了小鼠的镰刀型红细胞贫血症。他们将小鼠的成纤维细胞重编程为iPS细胞后，再用同源重组的方法用人野生型βa-珠蛋白基因代替βs-珠蛋白基因，最后诱导遗传修饰后的iPS细胞定向分化为造血祖细胞（HPS），并将其移植入模型雄鼠体内。结果显示，HPS 可有效抑制镰刀性红细胞贫血症症状。[33]用病毒介导得到的iPS细胞应用于临床治疗有一定的危险性，但若将iPS细胞诱导为无核的成熟红细胞，这自然去除了病毒DNA 带来的安全隐患。
3.4治疗视网膜病变
目前已有研究机构提出有望利用iPS细胞治疗因感光细胞病变引起的视网膜变性疾病。他们利用逆转录病毒感染DsRed／1鼠细胞，分别表达Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc 4个基因。经过dkk-1、noggin IGFI、bFGF和DAPT等物质的干预，使DsRed—iPS细胞分化成为视网膜的前驱细胞，并进行免疫印迹检测。[34]结果表明，与普通老鼠的Es细胞相比，DsRed—iPS细胞表达了多能基因。将其移植到经过免疫处理的视网膜变性的小鼠体性内，这些细胞形成了包含3个胚层组织的畸胎瘤，其中也有神经视网膜，在随后的一系列分化诱导后产生视网膜类型的细胞，大部分分化细胞均可形成视网膜先祖细胞(GF3P、GS) 和感光细胞(CRX)，且采用影像学手段检测时这些细胞均显示了正常视网膜细胞的生理特性。
3．5在改善脑神经方面的应用
Wemig等将iPS细胞诱导分化为神经前体细胞和多巴胺能神经元。在动物试验中，他们将GFp标记的iPS细胞注入胚胎小鼠的侧脑室，发现细胞可迁移至脑膜、纹状体、下丘脑、中脑等区域，分化成神经胶质细胞和神经元，并参与电生理活动，而在帕金森氏病小鼠模型中，iPS来源的多巴胺能神经元可显著改善小鼠的运动功能。[35]
3．6在修复耳蜗神经方面的应用Nishimura等采用移植方法，利用iPS细胞修复耳蜗神经元，他们采用离体试验检测了从iPS起源的细胞向耳蜗神经细胞发展的情况、生存率同时进行体内试验并检测。[36]移植7 d后便可观察到形成神经元的基因开始表达。说明iPS细胞可作为一种再生资源用来修复和移植受损的耳蜗神经。
3.7研究发病机制
近10 年来研究干细胞的生物学家一直在寻找一种方法∶用患有难以研究的疾病的患者身上的细胞制造长期生存的细胞系（大多数成熟细胞在培养皿中不能成活，所以直接从患者身上提取用于研究的细胞无法成活）今年有两个研究小组实现了这个目标。其中一组从一位82 岁的肌萎缩性脊髓侧索硬化症（一种退化性疾病，袭击运动神经元，造成逐渐瘫痪）女患者身上提取了皮肤细胞，然后制造出了细胞系。科学家们然后引导iPS 细胞形成了两种最受这种疾病影响的细胞：神经元和神经胶质细胞。仅一周后，另一组报告说他们为10 种疾病的患者量身培养了iPS细胞系，包括肌肉萎缩症、I 型糖尿病、唐氏综合症等。这10 种病中很多都很难甚至不可能用动物模型进行研究，而诱导性多能干细胞为科学家们研究疾病的分子基础提供了新工具。这些细胞也许还将对候选药物的筛选有所帮助，最终这些技术也许可以让科学家们在培养皿中修正基因缺陷，然后用修复了的自身细胞为患者治疗。[37]
4.展望
在过去四年里iPS细胞的研究取得了一个有一个振奋人心的突破，人们对它在解决疑难杂症方面的前景抱着美好的希望。然而，iPS技术并不像人们想象的那样完美。目前，iPS技术的发展似乎遭遇了瓶颈，实验室内的研究成果没有一项能应用到临床
上去。种种困难限制着iPS技术进一步发展。第一，诱导体细胞重编程的分子机制至今仍不清楚，人们只知道会这样而不知道为什么会这样。第二，iPS细胞的制备效率很低，一般只有0.05%，因此，在应用上很困难。第三，iPS细胞存在极大的风险，由于载体使用的一般是逆转录病毒和慢病毒，而且oct、c-Myc、klf4、sox2基因都可认为是原癌基因，所以iPS细胞有极大的致癌性，有人甚至悲观的说iPS细胞是一种人造肿瘤细胞。[38]要想使iPS细胞真正应用到临床上去，就必须解决上述以至于更多的问题。目前，研究者们正在孜孜不倦地努力着。比如，美裔华人科学家丁盛博士找出了用蛋白质
诱导的方法，在一定程度上解决了致癌性的问题。[39]今年7月，巴西科学家用两个匿名基因替代了在致癌方面起关键作用的
c-Myc、klf4基因，向iPS细胞的应用又迈出了一步。总之iPS技术依然任重道远，科学家还要付出巨大的努力。但是，一旦iPS技术成熟，他必将给世界带来福音。
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诱导性多潜能干细胞_iPS cells_的研究进展
诱导性多潜能干细胞(iPS cells)的研究进展 学生：吴淑可元培学院学号：00646145 摘要：诱导性多能干细胞被誉为生命科学领域新的里程碑, 本文将通过iPS细胞的由来、研究概况、制备方法以及应用前景四个方面来简述iPS细胞的发展历程和应用前景。 关键词：iPS细胞、转录因子、小分子化合物 1.iPS细胞的由来 2007年11月，日本和美国科学家分别宣布独立发现将普通皮肤成纤维细胞转化为多潜能干细胞的方法，得到的干细胞称为诱导多能干细胞iPS（induced pluripotent stem cells）细胞。这项发现一方面解决了利用胚胎进行干细胞研究在伦理、宗教和法律等诸多限制，另一方面也使得干细胞的研究来源更方便且制备相对简单易行，故iPS细胞一经问世，即在生命科学领域引起了一次轰动，被誉为生命科学领域新的里程碑。简单来说，iPS细胞就是借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞，这类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(embryoidbodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合体(chimeras)形成(针对小鼠)等方面与ES 细胞非常相似[1]。 2. iPS 细胞的研究概况 2006年8月，Yamanaka小组确定最少有4 种转录因子组合——Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将成纤维细胞重编程为iPS细胞[2]。次年11～12月，该小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞[3.4]。 2007年12月，Jaenisch小组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗镰状红细胞贫血，从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定基础，次年4月，该小组证实鼠iPS细胞来源的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠脑内，可有效缓解其症状和改善其行为, 说明iPS对复杂疾病治疗的可能性[5]。 2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的iPS细胞培育出鼠角膜上皮细胞。同年3月，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则宣布，他们可以将iPS细胞中因iPS转化需要而植入的有害基因移除，保证获得的神经元细胞的基本功能不受影响。同时美国研究人员宣布，他们可以通过蛋白质，而非任何核酸材料，将普通皮肤细胞转化为iPS细胞。紧接着，2009年4月，美国科学家首次对遗传疾病Fanconi 贫血症患者皮肤细胞中的基因缺陷进行了修补，进而将这些组织转化成了能扭转疾患病情的干细胞，从而在基因重组过程中，制造出了无遗传缺陷、功能强大的诱导多功能干细胞（iPS细胞），并再次定向诱导分化出纠正患者遗传性贫血所需的健康血液细胞。 2009年6月，日本iPS之父证明了不同细胞来源的iPS具有不同的致瘤性。同时鉴于目前iPS诱导效率太低，提出了iPS诱导的种质模型和随机模型加以探讨。 2009年7月，iPS细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据《自然》和《细胞：干细胞》杂志报道，中国上海和北京两个科学团队分别利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。 (https://www.360docs.net/doc/056274903.html,/society/2009-07/24/content_11766251.htm) 3. iPS 细胞的制备方法 目前，iPS细胞制备流程如下。简言之：a．分离和培养宿主细胞；b．通过病毒(逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将外源基因导入宿主细胞；c．将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES 细胞专用培养体系中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分子物质( 如Wnt3a、5-AZA、BIX-01294、VPA、TSA等)以促进
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读班级：生物技术基地姓名：林立梅学号：0131122635 【摘要】John B. Gurdon和Shinya Yamanaka获得2012年诺贝尔生理学或医学奖，他们的相继研究成果证明，成熟、分化的细胞可以被重新组装或诱导重新编程，变成未成熟的干细胞，能够发育成机体内所有种类的组织。 【关键字】重新编程干细胞诱导定向分化临床医学 【内容】 （一）两位科学家的实验概述 （1）约翰.格登：用“细胞核重编程”克隆出新动物 所谓“细胞核重编程”，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗一点讲，就是在细胞层面实现“返老还童”。 1962年，格登做了一个划时代的实验：他假设：这些细胞的基因组仍然包含着驱动它发育成机体所有不同类型的细胞所需的信息。并进行相关实验，将非洲爪蟾（Xenopus，一种蛙）卵细胞内不成熟的细胞核移除，然后把非洲爪蟾的成熟肠细胞的细胞核注入其中。在此过程中，他采用核标记技术（Elsdale et al，1960），将标记的供体细胞核移植到未标记的受体卵。在实验中，控制由囊胚或原肠胚（简称胚胎细胞核）穿插与转让肠细胞核。移植的胚胎中，所有那些超出了囊胚期的细胞中包含明显的被标记的核，可以证明它们来源于核移植而不是从卵核。核标记只出现在渡过了囊胚期胚胎中。整个实验的目的很简单，就是想看看这个卵子最终会变成什么。结果发现，一部分卵依然可以发育成蝌蚪；其中的一部分蝌蚪，可以继续发育成为爪蟾。 (2)山中伸弥：用基因技术制造出“诱导多能干细胞” 2006年Shinya Yamanaka教授从数据库中筛选出大约100个有可能在ES细胞中特别活跃的基因。再经过近4年的紧张工作，从这100个基因中筛选出24个活跃
诱导多能干细胞技术-朱晨煜
诱导多能干细胞技术 吴晶晶张颖朱晨煜 1116092015 1116092016 1116092017 【多能干细胞】 多能干细胞(Pluripotent stem cell，Ps)，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。但是过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。 【诱导多能干细胞】 【简介】 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）细胞样的多潜能细胞。 最初是日本人山中伸弥于2006年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。 现在应用iPs已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。但是，过去诱导多能干细胞必须应用逆转录病毒载体才能进行基因组整合。由于基因组整合的随机性，可发生突变，甚至可以引起癌症和遗传疾病。哈佛干细胞研究中心和麻省医院肿瘤中心的科学家，成功应用无害基因组整合病毒载体
诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用
文献综述 诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用 摘要：通过特定转录因子的过表达使体细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPS 细胞），这一成果引起了整个生命科学领域的广泛关注. 由于 iPS 细胞不仅具有与人类胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES 细胞）相似的基本特征，而且与 ES 细胞相比，不存在免疫排斥和伦理道德问题，因此，具有重要的临床应用潜能. 目前， iPS 细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法. 从 iPS 细胞的产生、诱导方法、生物学特征和在再生医学中的应用作以研究！ 关键词：诱导性多能干细胞；胚胎干细胞；重编程；再生医学 正文 1iPS 细胞的产生 主要经历了 3 个大的阶段. 1981 年，小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）建系干细胞是近 30 年来生物学发展最快的领域（Evans 和 Kaufman），这些具有全能性的细胞在体外可以诱导分化为不同类型的细胞，为组织修复开辟了新途径. 尽管这些细胞来源于囊胚内细胞团，基本不存在去分化和重编程的问题，但自诞生之日起，就一直深受伦理道德和异体排斥等问题的困扰. 随着克隆羊“多利”的诞生，开创了体细胞在卵母细胞中去分化和重编程的先河. 2000 年，Munsie等从小鼠体细胞核移植囊胚中分离得到了小鼠 ES 细胞，从而拉开了治疗性克隆研究的序幕，使利用病人的健康体细胞对自身的病变组织进行修复成为了可能，尽管这一技术可以避免异体移植所造成的排斥反应，但仍然深陷伦理道德争论的漩涡之中.2006 年，Yamanaka 等将 4 个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于 ES 细胞的多能性干细胞，即“诱导性多能干细胞”（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）. 2007 年，Yu 等和 Takahashi 等又分别采用相同的基因改造的方法将人的体细胞逆转为类 ES 细胞，这些划时代的成果不仅解决了利用干细胞进行组织修复所面临的免疫排斥和伦理学问题，在利用病人正常细胞进行组织自我修复方面具有巨大的应用前景，而且是用来研究细胞去分化和基因组重编程的重要途径（不需要胚胎或卵母细胞）. 这个具有里程碑意义的发现揭开了再生医学领域的新篇章. 2iPS 细胞的诱导方法 迄今为止，短短几年的时间内 iPS 细胞的研究取得了突飞猛进的发展，仅诱导方式而言，从病毒方法如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的转座子载体和蛋白质均能介导外源转录因子诱导产生 iPS 细胞. 利用逆转录病毒和慢病毒载体诱导生成 iPS 细胞时，可能会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变，如果将这些 iPS 细胞应用于临床治疗，会存在安全隐患. 因此，Aoi 等利用不与宿主细胞整合的腺病毒、质粒为表达载体瞬时转染靶细胞可以获得 iPS
诱导多潜能干细胞
医学分子生物学杂志,2008,5(5):4452448 J Med Mol B i ol,2008,5(5):4452448 DO I 11013870/j 1issn 1167228009120081051015 资助项目:广东省重点实验室建设基金(No 12004B60144)通讯作者:马文丽(E 2mail:wenli@fi m mu 1com ) This work was supported by a grant fr om Key Laborat ory Constructi on Foundati on of Guangdong Pr ovince (No 12004B60144)Corres ponding author:MA W enli (E 2mail:wenli@fi m mu 1com ) 诱导多潜能干细胞 左长清1,马文丽1,郑文岭 1,2 1南方医科大学基因工程研究所 广州市,5105152 华南基因组研究中心 广州市,510800 【摘要】 通过病毒载体导入4个外源转录因子Oct4、Sox2、c 2M yc 、Klf 或者Oct4、Sox2、Nanog 、L in28入体细胞,可以诱导产生具有胚胎干细胞特性相似的诱导多潜能干细胞(induced p luri potent ste m cells,iPS )。 iPS 在疾病治疗和药物研究等领域具有非常重要的应用前景,但是目前存在诱导效率低以及致肿瘤性等缺 点,采用改良方法诱导产生iPS 是将来研究的重点。【关键词】 诱导多潜能干细胞;胚胎干细胞;转录因子【中图分类号】 Q813 Perspecti ves :I nduced Plur i poten t Ste m Cells Z UO Changqing 1,MA W enli 1,Z HE NG W enling 1,2 1Institute of Genetic Engineering,Southern M ed ical U niversity,Guangzhou,510515,China 2 Southern China Geno m ics R esea rch Center ,Guangzhou,510800,Ch ina 【Abstract 】 Transducti on of f our fact ors,for instance,Oct4,Sox2,c 2Myc and Klf,or Oct4, Sox2,Nanog and L in28,int o s omatic cells thr ough viral vect or,is sufficient t o rep r ogra m human s o 2matic cells int o induced p luri potent ste m cells (iPS )that exhibit the essential characteristics of e m 2bry onic ste m (ES )cells 1iPS cells possess significant app licati on pers pective in disease treat m ent and drug devel opment,A t p resent,however,there still exist s o me shortcom ings t o be conquered,for instance,l ow inducti on efficiency and high tu morigenicity 1Therefore,i m p r ove ment of iPS induc 2ti on strategy would be of great i m portance in the near future 1 【Key words 】 induced p luri potent ste m cells;e mbryonic ste m cells;transcri p ti on fact or 尽管人胚胎干细胞(e mbryonic ste m cell ,ES )有着巨大的医学应用潜力,但围绕该研究的伦理道德问题一直争论不休。因此,长期以来,科学家一直探索是否可以不通过人胚,获得具有和胚胎干细胞特性相同或相似的多潜能干细胞(induced p luri 2potent ste m cells,iPS )。近年,通过采用病毒转导少数基因进入小鼠和人类体细胞,并成功诱导产生具有与胚胎干细胞特性相似的多潜能干细胞,将干细胞研究推向了一个全新的领域。1 i PS 的研究策略及命名 2006年8月,日本京都大学Takahashi 等 [1] 在 《Cell 》上宣布:将外源基因导入完全分化的体细胞,可以诱导产生iPS,首次证明了外源因子可以 使体细胞重编程(rep r ogra mm ing )。他们将此诱导细胞命名为诱导多潜能干细胞,即iPS 。具体研究策略如下:首先,将双选择标记βgeo (neo 用于G418筛选,βGal 用于显影)基因盒同源重组到小 鼠Fbx 15基因位点,使βgeo 受内源性Fbx 15启动子控制,由于Fbx 15只在ESC 中表达,所以来源于Fbx15 βgeo /βgeo 小鼠的体细胞由于缺乏ES 特性,不 能在G418中生长。采用逆转录病毒将24个候选基因单个导入Fbx15βgeo /βgeo 小鼠胚胎成纤维细胞(mouse e mbryonic fibr oblast,MEFs ),无G418抵抗克隆。将24个基因全部导入以上MEFs 时,可以筛选到22个G418抵抗克隆,其中5个克隆与ES 细胞形状相似。重复实验同样获得ES 形状相似细胞,同时发现ES 细胞标记基因表达。采用逐一淘
人类诱导性多能干细胞技术指导手册
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞） 技术指导手册 目录： 1. 前言 (1) 2. 人类胚胎成纤维细胞培养 (2) 3. 重编程载体构建 (3) 4.病毒包装 (4) 5.人类iPS细胞的诱导 (6) 6. iPS细胞鉴定 (8) 6.1碱性磷酸酶活性检测 (8) 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9) 6.3干性因子的去甲基化程度分析 (10) 6.4干细胞内源基因的表达分析 (13) 6.5端粒酶活性检测 (14) 6.6核型检测 (15) 6.7拟胚体形成 (15) 6.8畸胎瘤形成实验 (15) 7．干细胞技术培训及服务一览表 (15) 8．附录 (16) 1. 前言 iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Y amanaka 和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和Klf4，Y amanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
诱导多能干细胞
诱导多能干细胞：过去，现在和未来 介绍 在2006年，我们发现，干细胞与胚胎干细胞相似的属性，可以同时引入四种基因（高桥和Yamanaka，2006年）从小鼠成纤维细胞产生。我们指定了这些细胞的iPS细胞。在2007年，我们报道了类似的方法适用于人类成纤维细胞，并通过因素引入了一把，人类iPS细胞可以生成（Takahashi等，2007）。就在同一天，詹姆斯·汤姆森的研究小组还报告了人类iPS细胞的生成，使用不同组合的因素（Yu等人，2007）。 合并三个科学流LED iPSCs的生产 像任何其他科学的进步，过去和现在的科学家在相关领域众多研究结果的基础上，建立了IPSC的技术。有三个主要的数据流的研究导致我们生产的iPS细胞（图1）。第一个数据流进行重新编程核移植。1962年，约翰·格登报道，他的实验室已经收到了成年青蛙肠细胞的细胞核（格登，1962）的未受精的卵子产生的蝌蚪。超过三十年后，伊恩·威尔莫特及其同事报道多莉诞生的第一只哺乳动物体细胞克隆产生的乳腺上皮细胞（威尔莫特等人，1997）。在这些成功的体细胞克隆显示出，即使是分化的细胞中含有的所有的发展所需要的整个生物体的遗传信息，而卵母细胞包含体细胞核重新编程的因素，可以。2001年，田田隆的研究小组发现，胚胎干细胞也含有因素，可以重编程体细胞（田田等人，2001）。第二个流是“大师”的转录因子的发现。在1987年，果蝇的转录因子，触角，异位表达时（Schneuwly等人，1987）表明，诱导形成的腿代替触角。在同一年，哺乳动物转录因子，调节因子MyoD ，显示转换成纤维细胞，成肌细胞（Davis等人，1987）。这些结果导致“主调节器，”一个给定的血统的命运决定和诱导的转录因子的概念。许多研究人员开始寻找各种谱系单主监管。尝试失败，也有少数例外（Yamanaka和布劳，2010）。 第三，同样重要的是，流是涉及胚胎干细胞的研究。自第一代在1981年小鼠胚胎干细胞（埃文斯和考夫曼，1981年，1981年，马丁），奥斯汀·史密斯和其他人已经建立了培养条件，使长期维持多能性（史密斯等人，1988）。维持小鼠胚胎干细胞的一个关键因素是白血病抑制因子（LIF ）。同样地，由于第一代的人胚胎干细胞（Thomson等人，1998年），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）的最佳培养条件已经成立。 组合第一两个流的研究使我们假设，这是在卵母细胞或胚胎干细胞，体细胞重新编程到胚胎状态，设计实验，以确定该组合的多个因素的组合。使用信息所需要的文化多能干细胞的培养条件，我们就能够识别四个因素可以产生iPS细胞。 IPSC的技术成熟和理解 后不久，其他各组小鼠iPSCs的初次报告，概括了基于因子重编程的小鼠（Maherali等，2007年，Wernig等人，2007）和人类（Lowry等，2008年，公园等。2008B ）。iPS细胞技术的优点之一是它的简单性和重现性。许多实验室开始探索相关机制和修改程序。 尽管iPSCs的重复性，可以生成过程中的效率仍然很低，通常小于1 ％转成纤维细胞成为iPS细胞。最初这种低效率的提高iPS细胞的可能性，来自罕见的干或者未分化的细胞，成纤维细胞培养共存（山，2009A ）。然而，随后的研究表明，iPS细胞可以是来自于终末分化的淋巴细胞（罗等人，2009）和有丝分裂后的神经元（Kim等人，2011a的）。因此，大部分的，如果不是全部，体细胞有可能成为iPS细胞，尽管有不同的效率。 怎能只是一小部分因素诱导体细胞重编程？这是超出了本文的范围，提供一个概述的许多研究已经解决了这个重要的问题。从我的角度来看，许多科学家的共识似乎是重编程因子的启动重编程过程中有更多的不到1％的转染细胞，但该过程没有完成在大多数细胞中。知之甚少的随机事件似乎需要完全重新编程的地方（Hanna等人，2009年，山中伸弥，2009年a）。正如我在下面的讨论，培养条件似乎为动力，可以帮助促进全重编程功能。 最初的iPSCs可以使用逆转录病毒或慢病毒，这可能会造成插入突变，从而会带来风险转化
诱导多能干细胞的免疫原性
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2011年，第19卷，第3期2011,Vol.19,No.3 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 诱导多能干细胞的免疫原性 Immunogenicity of Induced Pluripotent Stem Cells 诱导多能干细胞(iPSCs)是由体细胞经过特定的因子诱导重编程而来，它作为细胞更新的来源在再生医学上有着很大的应用前景。人们普遍认为产生iPSCs 的个体不会排斥这种自体同源的细胞，但是它们的免疫原性没有被真正的检测过。美国加州圣地亚哥分校的研究人员对此进行了一系列的实验。他们利用ESCs 和iPSCs 可以在小鼠中形成畸胎瘤的特点来同时检测这两种干细胞所产生的不同类型细胞的免疫原性。实验发现来自同系交配的C57BL/6(B6)小鼠中的胚胎干细胞(ESCs)在B6小鼠中能有效地形成畸胎瘤，但是没有明显的免疫排斥反应。来源于同种异体129/SvJ 小鼠的ESCs 在同样的B6受体小鼠中会产 生迅速的排斥反应而不形成畸胎瘤。 B6小鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)可以通过逆转录病毒的方法(ViPSCs)诱导生成iPSCs 。大部分移植的B6ViPSCs 没有检测到畸胎瘤，而是出现T 细胞渗透和大块性坏死。此外研究人员使用一种新的不会引起基因组 整合的附加体的方法将B6MEFs 重编程为EiPSCs ， 这种干细胞有正常的核型，可以在B6小鼠中形成畸胎瘤，并有明显的T 细胞渗透现象，但是它产生的免疫原性要比ViPSCs 低。 为了了解这种排斥反应产生的机制，研究人员对B6ESCs 和EiPSCs 形成的畸胎瘤进行基因表达谱分析，发现来自EiPSCs 的畸胎瘤中23个被检测基因中有9个基因过表达，其中包括Hormad1和Spt1， 这两个基因的产物分别是肿瘤抗原和组织特异性抗原。CD4和CD8的敲除试验证明CD4阳性的T 辅助细胞和CD8阳性的细胞毒性T 细胞在这种免疫排斥中起重要作用。这项研究说明与ESCs 来源的细胞相比，由iPSCs 分化产生的细胞中异常的基因表达会在同基因系的受体中产生T 细胞依赖的免疫排斥反应。因此目前的重编程技术还需要优化来缩小iPSCs 和ESCs 之间的遗传差异，以适应于iPSCs 的临床应用。这项研究结果发表在2011年5月的《自然》杂志上。 编者：黄甜(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室),本刊通讯员 本文引用格式：黄甜,2011,新生小鼠心脏具有短暂的再生潜能,农业生物技术学报,19(3):目录后 信息来源：Nature (2011)doi:10.1038/nature10135最新研究结果证明水稻起源于中国 Molecular Evidence for a Single Evolutionary Origin of Domesticated Rice 物种的驯化是一个长期而复杂的过程，它受到物种自身遗传变异和人为选择等多方面因素的影响。亚洲水稻(Oryza sativa )作为目前世界上最重要的粮食作物之一，其起源问题在学术界一直备受争论。最近，来自纽约大学基因组学和系统生物学中心和生物系、华盛顿大学圣路易斯分校生物系、斯坦福大学大学遗传学系和珀德尤大学农学系的研究人员对水稻进行了大规模的重测序，其研究结果表明：水稻起源于中国。该研究结果发表在2011年5月的PNAS 上。 亚洲水稻大约于8000~9000年前被人类驯化，存在着两个主要的亚种：粳稻(Oryza sativa ssp.japonica )和籼稻(O.sativa ssp.indica )。目前对于水稻起源存在着两种理论模型：单一起源模型认为，水稻的两个亚种都起源于野生稻，在驯化过程中发生了亚种的分离；而另一种多渠道独立驯化理论模型认为，籼稻与粳稻是分别由不同的野生稻品种独立驯化而来，其起源可能分别来自于中国和印度。研究人员选取了20个籼稻品种，16个粳稻品种和20个野生稻品种作为实验材料，对水稻第8、10和12这三条染色体上约630个基因片段进行了重测序，从大于250kb 的序列中鉴定出大量的单碱基(SNP)差异。利用这些测序数 据，研究人员用两种方法推断了水稻的起源模式。一种是基于群体统计学的程序，可以用来估算等位基因的频率，并且用方 程描述了等位基因的突变、漂移和迁移所能造成的影响；另一种方法是用贝叶斯法对测序得到的序列、SNPs 和已发表的亲缘系谱数据进行统计。两种方法得到的结果都支持了单一起源学说。研究人员还利用水稻基因的分子钟推断水稻的起源约为8200至13500年前，这也与考古学上对水稻起源时间的结果相符，在这段时期水稻开始种植于中国的长江流域。编者：霍兴(中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室),本刊通讯员 本文引用格式：霍兴,2011,最新研究结果证明水稻起源于中国,农业生物技术学报,19(3):目录后 信息来源： https://www.360docs.net/doc/056274903.html,/cgi/doi/10.1073/pnas.1104686108
诱导多功能干细胞研究涉及的技术
综述 诱导多功能干细胞研究涉及的技术 作者李建雄09级七年制二系093335 摘要 诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是体细胞在外源因子作用下，经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞．iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值．在过去几年中，科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破．本文就iPS细胞研究关键环节—一诱导系统涉及的技术进行综述与展望。 关键词 体细胞重编程，诱导多潜能干细胞, 整合型载体,非整合型载体，新型载体，蛋白质转染, 细胞膜的通透性观察，DNA甲基化, RNA干扰实验，信号通路 引言 干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制能力、高度增殖及多向分化潜能，从发现之日起一直倍受学者关注。20世纪末以来，胚胎干细胞成为各国研究的重点。然而，胚胎干细胞的获取主要还是来自早期发育的囊胚，而这一阶段涉及许多对生命的界定问题，各国因信仰、民俗及文化背景的不同引起胚胎干细胞研究激烈而敏感的伦理之争；同时，胚胎干细胞的获取和保存也受现实条件的限制。因此，怎样采用非胚胎材料直接产生多能性干细胞成为生命科学研究发展的重要瓶颈。作为细胞重编程研究的里程碑，2006年，Yamanaka小组“将Oct4、Sox2、c．Myc和KH4等4个转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblasts，MEFs)中，成功获得与小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在表型、生长特性、基因表达和分化潜能等方面高度相似的小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell) 【1】，从此，iPS细胞的研究日趋火热。美国Thomson 小组报道了通过转染Oct-4、Sox2、Nanog及Lin284个基因可将人的成纤维母细胞重编程为iPS细胞【2】。iPS细胞在其形态学、增殖特性、干细胞标志物的表达、表观遗传修饰上都与ESCs无显著差别【3-4】，研究表明：鼠iPS细胞能有效分化为造血和神经祖细胞，并能在体内和体外分化为血液及神经系统的各种细胞【5-6】。亦有研究证明，人体iPS细胞和小鼠iPS 细胞均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞【7-9】；同时，iPS细胞孕育而成的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的“全能性”【10】。但到目前为止，iPS细胞的研究才刚刚起步，一些重要的科学问题与关键技术问题还没有完全解决，iPS细胞走向临床应用为时尚早。本文就近几年iPS 细胞研究所涉及的技术作一回顾，从具体操作上把握iPS 研究和应用方向，加深对ips的认识，以期对有志于此的医学生未来的学习研究工作有所帮助． 1、基因导入技术 把已知基因转移到真核细胞,并且整合到基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入。基因导入技术是制备ips细胞的主要技术，而基因载体又是推动无遗传修饰ips细胞的建立的关键。载体主要有整合型载体、非整合型载体以及新型载体。 1.1.整合型载体介导的基因导入技术 早期使用的病毒载体，如逆转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单一慢病毒载体及piggyBac转座子都属于整合型载体【11】。反转录病毒载体的结构包括已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，以及两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。逆转录病毒载体制备首先要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，另外还具有适当的结构。如：ψ2(第一代包装细胞)，
诱导性多功能干细胞ips的研究进展与应用前景
诱导性多潜能干细胞的研究进展和 应用前景 Abstract Rece nt rep ort s d emo nst rat e t hat mo use so ma tic cel ls can be di rec tly repr ogr amm ed int o p lur ipo ten tem bry oni c s te m (ES) ce ll-lik e c ell s b yin vitr o int rod uct ion o f fou r t ran sc rip tio n f act ors, Oct4, So x2, c-My c and Klf4. The se ce lls a red esi gna ted a s ind uce d pl uri pot ent s tem(iPS) cel ls. Simi lar ly, th e t ran sfe cti on wit h t hes e f ou rtr ans cri pti on fac tor s o r a cock tai l of Oc t4,S ox2, Nan og an d LIN28ha s bee n sho wn to b e suf fic ien tto repr ogr am hu man som ati c cel ls to i PS cel ls th at ar e i nd ist ing ui sha ble f rom huma n ESc ell s.S inc e rea cti vat ion o f th e c-M yc tr ans gen eha s be en re por ted to i ncr eas e t umo rig eni cit yin th e c him era s and pr oge ny mic e, amod ifi edp rot oco l wit h onl y thr ee fa cto rs (Oc t4, S ox2 a ndK lf4) has b een rece ntl y u sed to ma ke mou se and hum an iPS ce lls fr oma dul tde rma lfi bro bla sts. Differentiated somatic cells can be directly reprogrammed into induced pluripotent stem ( iPS) cells in vitro. Similarly to embryonic stem ( ES) cells,iPS cellshavepluripotency to differentiate into allcell types and capability toself-renew themselvesindefinitely. Without immune rejection and ethical issues,patient-specific iPS cells promise to be an ideal tool for regenerative medicine,drug screening,and toxicity testing. 摘要 研究证实采用体外导入Oc t4、S ox2、c-M yc和Kl f4等4个转录因子可将小鼠体细胞 直接重构成为E S细胞样的多潜能细胞,这类细胞被命名为诱导性多潜能干细胞
诱导多能干细胞IPS及发展简述
诱导多能干细胞IPS及发展简述 1.定义：通过一定的途径将与细胞多能性有关的基因导入到已分化的体细胞中，或者同时添加一些辅助作用的小分子化合物使体细胞去分化重 编程回到胚胎干细胞状态，所获得的细胞即为IPS细胞。 IPS细胞与胚胎干细胞（ES）形态相似、核型、端粒酶活性、体外分化潜能均相同，同时也能够表达相同的表面标志分子。 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）最初是日本人山中申弥（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒载体将 四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不 同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。 2.获取原理:ES细胞和IPS细胞具有相同的基因。不同的是，ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。 （1）分离和培养宿主细胞； （2）通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞； （3）将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES细胞专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程； （4）出现ES样克隆后进行iPS细胞的鉴定（细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面）。 3.应用前景： 3.1建立疾病模型通过体外研究这些疾病特异性的iPS细胞，有助于间接推断疾病的发病机制及寻找有效的治疗措施。 3.2 研究人类发育生物学及新基因的发现而iPS细胞与Es细胞在生长条件、细胞表型、细胞的多能分化特性等许多方面有相似点，在一定程度上它可以代替ES细胞担任基础研究及临床应用角色。iPS细胞体外自发分化的拟胚体可以模拟胚胎发育过程，可以作为组织、器官发生、发育研究的模型，弥补完整人胚不能用于这方面研究的缺陷。 3.3 自体干细胞移植不依靠人工或捐献者的器官，凭借本人强大的自然治愈能力让丧失功能的器官再生是最理想的治疗方式。对于遗传性疾病，利用自体成体细胞建立iPS细胞，通过基因打靶技术纠正遗传性缺陷基因，再诱导分化为特化细胞进行移植。 3.4新药发现及筛选目前新药的药理、药代学、毒理学、药效学等细胞水平的研究及生物学模型，大都在其他种属的细胞系进行。然而异种细胞与人之间毕竟有不完全相同的药物反应。而患者及疾病特异性源性iPS细胞的建立可以实现在体外以人源细胞为对象的试验性用药，观察药物对其基因结构及表达的影响，间接判断该药物对某种疾病的疗效，这是一种全新探索及筛选药物治疗的模式。 4．问题 4.1重编程机制如上所述，目前已经可以不用病毒介导转基因技术获得iPS细胞，表明病毒插入突变不是必需的。对于转录因子，则意见不一。没有c—Myc参与或只用Oct4因子也可以获得iPS细胞111·18l，但是其采用的初始细胞是已表达高水平某些转录因子的神经祖细胞，所以也不能完全排除对转录因子的依赖性。 4.2诱导效率此前报道iPS细胞诱导效率不到0．1％，效率太低阻碍了对重编程机制的研究，也阻碍了iPS细胞进一步发挥其应用价值，因此提高诱导效率的研究势在必行。添加SV40大T抗原将转染效率提高了23—70倍；添加强力霉素提高了至少100倍。PB转座子系统的转染效率与病毒系统无差异。Sail 4(Sal．1ike 4)也是胚胎干细胞相关转录单位之一。添加转录因子Sall 4比单用Oct3／4、Sox2、l(1f4诱导效率提高了lO倍。使用基因敲除技术敲除Sail 4后诱导效率显著降低，但仍不明确Sall 4是否可被同组蛋白Sall l或其他因子取代。降低培养环境的氧气溶度可以提高诱导效率，在5％02培养下效率可达0．40％，联合使用I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ValproicAcid(VPA)效率可达0．48％，但何种氧气溶度以及在低氧环境下培养多长时间最为合适仍不明确。 4.3致瘤性iPS细胞诱导过程中使用的转录因子c-Myc和Klf4都是癌基因，病毒插入也可以导致肿瘤发生，而且，未分化iPS细胞自身尚可在体内形成畸胎瘤，因此，iPS细胞的致瘤性是其进一步推广应用的一大障碍。虽然现在已经可以在没有c—Myc、圈f4和病毒情况下获得iPS细胞，而且随着细胞的分化，iPS细胞形成畸胎瘤的能力也逐渐减弱，但关于如何在细胞移植前将混杂在其中的未分化iPS细胞去除，以及在何分化阶段移植，目前还没有这方面安全应用的研究报道。 虽然iPS细胞距离临床应用还有一段时间，但伴随细胞生物学、分子生物学、发育生物学、功能基因组学以及转基因技术的进一步发展，iPS技术必将在细胞移植治疗、药物筛选和发病机制研究中发挥重要作用。