电泳操作方法
XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法
文件编号XXXX-02
制定部门研发部
版本A/0
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生效日期2014/4/9
一、目的
建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。
二、范围与权责
适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。
品控主管负责审核。
三、原理
SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
四、实验仪器及试剂
1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪
2.DYY-8C 电泳仪电源
3.STS-2A 脱色摇床（水平）
4.标准蛋白Marker
5.平皿：直径150mm
6.TEMED:四甲基乙二胺
7.DTT:二硫苏糖醇
8.储存液
①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8，
待室温，加蒸馏水至100ml。
②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8，
待室温，加蒸馏水至100ml。
③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。
④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。
⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚
合的染料。
9. 工作液
①A液：30%丙烯酰胺储存液，丙烯酰胺是一种神经毒素，可通过皮肤被人体吸收并富集。操
作时要避免皮肤接触，并带合适的口罩于通风橱中进行。
②B液—分离胶缓冲液：取75ml 2M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸馏水，混
合均匀，4℃保存数月。
③C液—浓缩胶缓冲液：取50ml 1M Tris-HCl缓冲液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸馏水，混
合均匀，4℃保存数月。
④10%APS：称取1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解后，水相针式过滤器过滤分装到EP管中，
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⑤上样缓冲液：称取0.154g DTT，于10ml容量瓶中，加少量水溶解后，加 0.6ml 1 M Tris-HCl
缓冲液，5ml 50%的甘油，1ml 1%溴酚蓝，混合均匀后定容至刻度线。
可分装至EP管保存，4℃保存一个月，-20摄氏度保存一年。
⑥电极缓冲液：称取3g Tris，14.4g Gly，1g SDS至1L烧杯中，加1L蒸馏水溶解，搅拌均
匀，室温保存。
10. 染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，加450ml乙醇，加100ml乙酸，加水450ml，混合均匀，
室温保存。
11. 脱色液：100ml乙醇，加100ml冰醋酸，加水800ml，混合均匀，室温保存。
五、操作步骤
1、电泳仪的组装
①将平板玻璃和凹板玻璃重叠，用手将两块玻璃板在桌面上或是玻璃板上竖起，使两玻璃底面
平齐，从而形成胶室。
②将胶室放入主体，是凹玻璃的一面向内。若做单面胶，另一侧用单胶堵板（δ=5mm）代替。
③插入楔形插板，用力向下按，挤紧玻璃板。
④将主体放入原位制胶器内，手柄起立位与底座箭头对齐，两手同时把手柄向主体推动，直到
推不动为止，然后开始旋转手柄，听到咔、咔两声，底座箭头指向手柄1.0mm标志处，此时楔形插板已压紧胶室，可以开始灌胶了。
2、分离胶的配制
12%分离胶（10ml）
A液B液蒸馏水10%APS TEMED
4ml 2.5ml 3.5ml 50μl 5μl
按上表，将A液，B液，蒸馏水先加到小烧杯中，混合均匀，再添加10%APS,TEMED后，混合均匀，迅速连续地灌到两玻板间隙中去，留出灌注浓缩胶的空间（齿长再加0.5cm），用移液枪小心加蒸馏水覆盖，直至有蒸馏水溢出，在室温或恒温箱内垂直放置30min，使其完全聚合凝固，在凝胶面与水封层之间可见清晰的分界线。
倾出蒸馏水，用滤纸条小心地吸取分离胶顶部残留的水。
3、浓缩胶的配制
5%分离胶
A液C液蒸馏水10%APS TEMED
680μl 1ml 2ml 30μl 6μl
按上表，将A液，C液，蒸馏水先加到小烧杯中，混合均匀，再添加10%APS,TEMED后，混合均匀，迅速连续灌到分离胶顶部，直至有胶溢出，随即插入试样格，在室温或恒温箱内垂直放置10min，静置直至完全聚合。
4、样品的处理
将样品与上样缓冲液以4：1混合均匀，在金属浴上100℃，10min，如有沉淀，可适当离心备用。
5、加样
①在凝胶聚合后，向相反的方向拧手柄，手柄弹出。
②将电泳仪主体从原位制胶器上取出放入电泳仪下槽中。
③将约140ml的电泳缓冲液倒入由胶室和主体形成的上槽中，使缓冲液没过凹玻璃板。
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④将约200ml的电泳缓冲液倒入下槽中
⑤慢慢地将试样格垂直拔出。
⑥将处理好的标准蛋白和待测蛋白样品，按预定顺序通过缓冲液小心的添加5~10μl到每个样
品孔中。
6、电泳
盖好电泳槽盖，接通电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线，设定电压为60V，电泳时间约为30min，直至溴酚蓝指示带经过浓缩胶与分离胶的分界线后，设定电压100v，电泳时间150min，直至溴酚蓝指示带接近分离胶底部，切断电源，电泳完毕。
7、剥胶
卸下电泳胶板，用刮刀小心撬开玻璃板，使两者分离，切除凝胶左下角以示标记。
8、染色
从玻璃板上，将凝胶小心的整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上染色45r/min，1h。
9、脱色
从染色液中小心取出凝胶，注意不要弄破，用蒸馏水清洗几次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上脱色45r/min，根据脱色情况更换脱色液，脱色过夜。
脱色后，可将凝胶拍照保存，或是将凝胶浸于水中保存一段时间。
10、绘制标准曲线
测量染料和蛋白质区带移动的距离，即从分离胶电泳起始至染料区带孔洞及蛋白质区带中心位置的距离。
11、标准曲线的制作
纵轴为标准蛋白质相对分子质量的对数，横轴为对应的迁移率，可得标准工作曲线，即可根据迁移率测出未知蛋白的分子量。
六、问题分析与解决办法
1、“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
主要是凝胶中部凝固不均匀导致，多见于比较后的凝胶中。可以使其充分混合均匀后制胶，待其凝固完全后，再做后续实验。
2、拖尾、纹理现象的产生？
只要是样品的溶解效果不好，有颗粒存在，可以加样前离心一下；电泳缓冲液时间过长，重新配制。
双向电泳笔记
1.当你在首次对未知样品进实验时，建议你使用以下的样品溶液： 将蛋白溶解在： ·8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 3-10, 0.002%溴酚蓝。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更难溶的蛋白可以使用以下方法： ·7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 3-10, 0.002%溴酚 蓝。 2.为了从蛋白含量很低并且含有大量干扰物质的组织（如植物组织）中制备样品，你可以使用以下推荐方法。该方法产生的蛋白溶液中不包含盐，核酸及其它污染物。 ·将组织在研钵中用液氮研碎。将粉末悬浮在含有10%TCA，0.3%DTT的丙酮中。 在-18?C 条件下过夜并离心。用丙酮清洗沉淀，干燥沉淀并将沉淀溶于9M尿素， 2%CHAPS,1%DTT,2% Pharmalyte 3-10(52,63)中。 3.等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。 尿素（Urea）:使蛋白质溶解和变性，通常使用浓度为8mol/L，但为了使蛋白质完全溶解的需要，尿素的浓度往往增加到9或9.8mol/L。 CHAPS :促使疏水蛋白质溶解并减少蛋白质间的结合 还原剂：打断二硫键使蛋白质完全展开，往往使用DTT或DTE 载体两性电解质混合物：载体两性电解质的混合物在等电聚焦过程中不影响梯度，还能促进样品的溶解度，并且等电聚焦过程中在整个梯度范围内能产生更一致性的导电性。 经典的再水化液组成：8 M urea, 0.5% (w/v)CHAPS, 0.2%(w/v)DTT, 0.5% IPG缓冲液或Pharmalyte, 0.002%溴酚蓝。 ***不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟，胶条会从空气中吸收水分，将IPG 胶条密封好在-20℃以下温度保存。再水化至少需要十个小时。 矿物油加入：利用微量移液器从槽的一端逐滴加入，直至一半条胶被覆盖，然后从另一端逐滴加入，直至整条胶被覆盖。 ****聚焦时间过长会发生过聚焦，导致产生水平的条纹,可以在双向电泳的最后结果中见到。 4.可选操作：加入分子量标准蛋白。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
电泳原理.pdf
电泳原理 阳极电泳用水溶性树脂是一种高酸值的羧酸盐，在水中溶解后以分子和离子平衡 状态存在于直流电场中，通电后，由于两极的电位差，离子定向移动，阴离子沉积在阳极表面，而阳离子在阴极表面获得电子还原成胺，它是一个电化学反应，包括电泳、电解、电沉 积和电渗四个同时进行的过程。 1.电泳：在直流电压作用下，分散在介质中的带电胶体粒子在电场作用下向与其所 带电荷相反的电极方面移动，叫电泳。 2.电沉积：阴离子树脂放出电子沉积在阳极表面，形成不溶水的漆膜，此过程叫电 沉积。 3.电渗：电泳逆过程，当阴离子树脂在阳极上，吸附在阳极上的介质在内渗力的作 用下，从阳极穿过沉积的漆膜进入漆液，称电渗。 4.电解：电流通过漆液时水便发生电解阴极放出氢气，阳极放出氧气，此过程 即为电解。 电泳涂料 有人说，电泳涂料可划分为三代，第一代为环氧树脂涂料，第二代为丙烯酸树脂涂料， 第三代为聚氨酯涂料。由于环氧涂料主要应用于汽车底盘，第三代主要用于阴极电泳漆，涂覆于首饰表面，故目前主要介绍第二代，即丙烯酸树脂涂料。此树脂如一团乱麻，羧基藏于里，胺基接于外,其中最先的羧基有70%被胺基取代，因其树脂中存在-COONHR，使树脂成为水溶性。铝型材表面涂覆的丙烯酸树脂多采用胺基树脂为固化剂进行交联固化，同时， 涂料分子均匀性对工艺操作有很大影响，一般说，乳化越好，分子越均匀。 涂装工艺流程 1 .除油：如有酸回收装置，推荐采用碱性除油，因碱性除油后，铝型材表面比较光亮，且 不会与后面的碱蚀发生副作用，如用碱性除油，其主要成份是 Na 2 CO 3 和NaOH。 2 .水洗：自来水洗去前道工序的酸或碱。 3 .蚀：加入碱蚀剂的碱蚀工序，会降低型材表面光亮度，但效果并不十分明显,主要应注意不可使槽中Al 3 含量过大，温度过高，否则易产生洗不去的花斑，涂漆烘干后呈黄色。 二道水洗：最好有喷淋或加大溢流，以保证清洗彻底。 除灰：用HNO 3 效果较好，但要注意加强水洗（最少二道+喷淋）。 水洗：自来水用H 2 SO 4 除灰，一道水洗即可，用HNO 3 除灰，需二道水洗 氧化：H 2 SO 4 氧化一般为20min，使氧化膜达到9ｕ，某些公司推销的所谓的 高温氧化剂，其主要成份是一种混酸，建议不要使用，对氧化膜的色泽、硬度、可着色性均 无好处。 水洗：自来水二道加大溢流。 着色：用单锡盐、单镍盐、锡镍复合盐均可，注意不要有色差，因为色差会在 电泳涂漆后加大。 水洗：最好加喷淋，以期尽量减少对后道工序酸的带入量。 热纯水洗：要求电导率＜100ｕs/cm，温度70-80℃，PH=4-6，尤其是银白涂漆型材或氧化中电压较大的型材应在此槽中处理较长的时间，PH值可用三乙胺进行调整。
轿车阴极电泳中的阳极系统
轿车阴极电泳中的阳极系统 阴极电泳是轿车车身制造普遍采用的涂装工艺，是提高车身使用寿命（耐腐蚀性）的主要手段。在阴极电泳中，所采用的电泳涂料是阳离子型（带正电荷）的树脂和颜料浆，被涂物（车身）作为阴极。 在阴极上的最初反应是水电解形成氢气和氢氧根离子（OH-），这一反应致使在阴极表面产生高碱性界面层，使带正电荷的粒子在阴极上凝集，阳离子（树脂和颜料）与氢氧根离子反应变成不溶性时就产生涂膜的沉积。 在阳极区不断产生有机酸（见下式）：H ++CH3COO-或HCOO-→CH3COOH或HCOOH 这些酸如不及时除去，会进入槽液使pH值下降，影响工艺参数pH值的稳定，影响泳透力及涂膜性能，再溶解性增大。除去槽液中游离酸的办法有，添加未中和或部分中和的阴极电泳涂料和采用阳极隔膜系统。一般常用阳极隔膜系统法，尤其是在大型的阴极电泳涂装线上。 1．阳极系统组成 阳极系统包含阳极液系统和阳极电源两部分。阳极液系统是阳极系统的主要组成部分，由阳极隔膜系统、极液往返循环管路、泵、极液槽、电导率和混浊度控制仪、去离子水供给管路等组成。 1.1阳极液系统 1.1.1阳极隔膜系统 阳极隔膜系统是将阳极封闭在可冲洗的阳极罩上，极罩由不导电材料制成，敞开面（板式电极罩朝向被涂物的一面，管式电极四周都可算敞开面）装有离子选择性隔膜。阳极有板式、管式和弧形等形式，其中管式阳极目前应用最为普遍。 1.1.1.1管式阳极 单元由阳极罩（含离子交换膜）和阳极两部分构成，是过去板式阳极的替代产品。其结构紧凑，膜电阻小，耗电量低，泳透力高，单位膜面积大，使用寿命长，检修和管理方便。由于其体积小、质量轻，可安装于电泳槽的侧面、底部或上部，以满足不同涂装工艺的要求。阳极电极材料一般采用316 L不锈钢，厚度最好不小于3.2 mm。在正常情况下，阳极缓慢溶解，其寿命取决于通过电泳槽的生产率。 不锈钢阳极依靠钝化状态工作，但是不锈钢的活化溶解和钝化膜的形成受脉冲电流影响很大，实际生产中很难控制。阳极的概率寿命可达到若干年，为延长阳极的使用寿命，可选用氧化钉或Ti基氧化物的电极。 试验表明，涂覆有氧化钉成分的阳极寿命是不锈钢阳极的数倍，但初期投资也比不锈钢要多。由于氯含量对不锈钢阳极腐蚀非常明显，而氯含量多少对Ti基氧化物阳极毫无影响，因此也可选用Ti基氧化物
胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤
蛋白质肽谱制备 1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。 ★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色 ★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒 2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。 ★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。 ★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤： ①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min ②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机） 3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min. 4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。 ★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。 6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。 7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。（冻干的肽段放-20度冰箱保存） 8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。） 9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。待干，再点0.5ul基质，上质谱。 溶液配制 1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中 2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:1 3. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中 4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中 5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug -20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。) 6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul） 7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液 8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1
最新流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
电泳阳极保养
电泳涂装阳极系统的维护及保养 阳极系统是阴极电泳涂装不可或缺的部分，阳极的性能、价格对涂装工艺质量及涂装成本有很大影响，阳极的 维护与保养也成为最受行业关注的重要问题之一。 电泳涂装阳极系统应用注意事项 1.生产过程中的注意事项 阳极液维持正常的流量是至关重要的，需每天进行巡检。 阳极液必须是清洁且透明的，特别是在新槽投槽的前几周，尤其要注意阳极液的颜色，很快变色则表明阳极系统有问题；若阳极液变得模糊不清，可能是阳极膜破损或细菌污染；若阳极液变得颜色和槽液接近，可能是阳极膜破损；若阳极液颜色变成棕色或黑色，但仍然透明，则说明不锈钢阳极板腐蚀过快，或流量低，或电导率过高等。若有阳极单元渗漏或破损时应立即停止阳极泵，必要时需关闭整流器，及时更换渗漏的阳极单元。在更换阳极之前，必须关掉电源。具体操作如下：关闭阳极液系统的循环泵，关闭整流器；检查所有的阳极单元，查出渗漏的阳极单元；将渗漏的阳极单元与电泳系统隔离开来；更换渗漏的阳极单元。 2.电泳倒槽时的注意事项 在电泳槽倒槽后要对阳极单元及阳极膜进行冲洗，在倒槽后并不断给阳极膜喷洒去离子水，以免造成电泳漆干结在阳极膜上和阳极膜干透。 电泳涂装阳极系统的维护与保养
此处应注意车间使用的纯水系统细菌等级的检测、细菌的控制方法和杀菌的操作方法。细菌易附在槽壁、管道内表面等处，尤其是对于极管的进、出液管和调节阀等处，由于变径影响，极易受到细菌污物堵塞。重要的是细菌对于阳极液电导及涂装质量也有潜在的影响。 阳极系统的杀菌控制方案：阳极系统生菌后进行了多次分析，除阳极液盒内细菌，若其他的样品细菌指数均小于1×102，细菌指数都是符合要求的。若阳极液盒内细菌指数超标，高达 8.0×105接近106，易生长的细菌为Molds（霉菌）等。对此结果我们可以采取以下措施进行控制： 1.阳极系统细菌控制方案 阳极杀菌步骤应根据细菌生长状况确定清洁方案，大致步骤方案为：周期性使用杀菌剂；定期清理管道、阀门以及阳极罐槽壁、槽底等处的细菌污物；注入纯水循环清洗；清洁完毕后用醋酸配制阳极液。具体投放杀菌剂频次及人工清洁频次根据阳极液细菌检测报告确定。 2.常规性杀菌剂杀菌方案 在使用电泳漆厂家常规的杀菌剂时杀菌效果不能彻底的情况下，建议采用专用杀菌剂卡松（Kathon LXE），它是一种广谱、非氧剂系杀生剂，在低浓度下使用能有效杀灭较宽范围内的微生物，其含有的活性分子可被降解，降低了排放问题。按以下详细方案实施： （1）对管道、阀门进行拆卸，并使用专用工具对管道、阀门等处的细菌污物进行重点清理；
附双向电泳完整的操作步骤第一向等电聚焦1从冰箱中取-20
附：双向电泳完整的操作步骤 （一）第一向等电聚焦 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解。 2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。 3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。 4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。 5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。 7. 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。 8. 在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。 （二）第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水（没有milliq的话ddh2o也行，注，水云深浪按）、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。 3. 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。 4. 配制胶条平衡缓冲液I。 5．在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 6. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 7. 配制胶条平衡缓冲液II。 8. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 9. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。 14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。 16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。 17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。 18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）（20-30mA/gel/17cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
FACAria流式细胞仪操作程序
、准备工作 1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。 1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2）5ml 注射器吸超纯水，清洗缝隙。用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。 2，鞘液桶加液 3, 喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。用滤纸吸干水分，晾干。 二、开机启动 1, 启动电脑，密码BDIS,点开软件，无密码 2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。 3, 液流启动：Cytometer --- FiuidSetup 1 ）气路（透明管）、液路（蓝色管） ,从乙醇桶上拔下,插到鞘 液桶 2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向 3）取下闭合喷嘴 4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4, 喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um （选择当前使用的喷嘴大小） 5, 液流调整：
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态：1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。 2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方 3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。 4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流：通过调整振幅来实现。 1）振幅Ampl,数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。 2）频率Freg ，一般不动。 3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。100um时，为10, 、11 、12。 4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。 5）点击StreamSpot ，锁死数值，保持液流稳定。 Dropl :实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。 Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿： 样品：Negative （双阴管），FITC（单阳），PE（单阳）
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤 水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出IPG 胶条，室温放置10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化11~15h。 第一向等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向SDS-PAGE电泳 1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶。 2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml(17cmIPG)平衡缓冲液I ，在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 6. 配制胶条平衡缓冲液II 。 7. 第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 分钟。 8. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。 9. 将琼脂糖封胶液加热溶解。 10. 在100ml 量筒中加入TGS 电泳缓冲液。 11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中漂洗数次。 13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。 14. 用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到面胶。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
阴极电泳涂装系统中的阳极系统
阴极电泳涂装系统中的阳极系统 对阴极电泳涂装工艺而言，若要在生产过程中获得优质的电泳漆膜，必须确保槽液pH值和电导率的稳定。而在阴极电泳涂装工艺中，阳极系统正是扮演稳定槽液pH值和电导率的角色。 阴极电泳的阳极反应 通常电泳阳极系统的要素有：阳极单元、阳极液槽、阳极泵、电导仪、流量计、压力表、阳极液供应及返回管路、阳极液溢流及排放管路等等。阴极电泳涂装的阳极系统如图1。 在阴极电泳涂装过程中，当带正电荷的树酯阳离子在工件上沉积时，在电泳槽液中会不断有有机酸根离子（醋酸根离子、甲酸根离子）和氯离子生成（有机酸根离子来源于电泳漆，氯离子来源于固化剂），并相应在槽液中积聚。当有机酸根离子在槽液中聚积过多时将直接导致pH 值降低和电导率的增高，从而影响电泳漆膜的质量和外观（例如在电泳漆表面产生条印，漆膜粗糙）。为了确保最佳的涂装效果和电泳漆液的稳定，必须在涂装过程中通过阳极系统将这些酸根离子持续不断地除去。 这些有机酸根离子会与在阳极上富集的带正电荷的氢离子发生反应，我们称其为“阳极反应”。 阳极单元 电泳阳极主要有管式、卷式、板式、中空纤维等四种，其中又以管式和板式用得最多。管式和板式阳极通常封闭在可冲洗的阳极罩中，极罩由不导电的材料制成。
阳极单元一般由阳极棒（电极）、阳极隔膜、绝缘的阳极罩、阳极液输入管、阳极液输出管等构成。阳极单元结构如图2。 1. 阴极电泳阳极棒 阴极电泳的阳极棒正是和工件阴极一起形成电场的阳极，可见其在电泳工艺中的重要性。阴极电泳的阳极棒、螺栓及垫片通常使用不锈钢（例如316L不锈钢）或钛合金板，阳极棒的厚度最好不小于3.2mm。阳极单元的阳极棒直接参与了电泳涂装的电化学反应，所以会逐渐损耗。阳极棒都有一定的生命周期，其消耗速率取决于通过电泳槽的产品及生产率。如果操作正确，通常阳极单元有3～5年的生命周期，经过特殊处理的阳极棒的生命周期会相对长一些。在实际生产中每年都应该对10～20％的阳极单元进行拆开检查。通常每个极罩应配备一个便于观察的安培计，以便连续监测每个阳极的工作情况。 2. 阴极电泳阳极隔膜 阳极膜是阳极单元的主要构件之一，其作用正是通过电渗析除去电泳过程中产生的酸积聚，这样就可以除去多余的酸，维持槽液的正常pH值。 阳极膜是一种半透膜，它能够在电场的作用下选择性地允许带有相应电荷（负电荷）的离子通过，这种半透膜只有水分子、小的酸根离子等小分子能够通过，树脂、颜料等大分子则不能透过。阳极液和电泳槽液就是借助于这种选择性透过的半透膜隔离开来的。酸根离子只有在电场的作用下才能从电泳槽液向阳极系
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22μm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g
CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22μm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装 考马斯亮蓝G-250： 考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。
电泳漆阳极系统杀菌操作指导
电泳漆阳极系统杀菌操作指导 一、阳极系统孳生细菌问题 含铅阴极电泳漆槽液一般不会长菌，但对于阳极系统，由于一般使用乳酸等富营养性酸中和，在潮湿、高温季节易孳生细菌。细菌的种类有真菌、霉菌等，现象主要为在极液中出现絮状、粘稠物，易附在槽壁，管道内表面等处，尤其是对于极管的进、出液管、调节阀等处，由于变径影响，极易受到细菌污物堵塞。重要的是细菌对于极液电导及涂装质量也有潜在的影响。细菌具有繁殖迅速的特点，细菌的数量必须控制在一定的范围内，正常情况下细菌个数应低于500 个/ mL 样品。 如果阳极系统开始有细菌孳生，请送样到电泳漆厂家检测。根据细菌含量情况及现场实际情况，可以采取以下阶段的处理措施。 二、初步杀菌方案 对于细菌开始孳生，或者长菌现象不严重，或者作为预防措施来进行初步杀菌可以采取以下方案来进行处理 1.人工清理管道、阀门等处的细菌污物，保证管路循环畅通。 2.排空极液槽内的极液，对槽壁、槽底等进行人工清理。 3.先打入部分纯水，循环极管内的极液，把极液带出，并全部排空。 4.极液箱注满纯水，加入约3～5%重量的助剂Ⅱ。 5.循环清洗24小时以上，必要时人工对循环管路、槽壁等进行清理。 6.循环清洗结束后，排空循环液，人工清理极液槽底内的污物。 7.注满纯水，循环清洗1小时后排空。 8.再次注满纯水，用醋酸配制阳极液，正常生产。需要说明的是，应每周排空 阳极液（即使不用溶剂杀菌），用醋酸重新配制阳极液一次。 9.以上清洗建议每周进行一次，并且送样检测细菌含量，制定实施周期。如果 生产紧张，也可以在生产过程中实施溶剂清洗，不会影响生产。 三、常规杀菌剂杀菌方案 在使用助剂Ⅱ杀菌效果不能彻底的情况下，建议采用专用杀菌剂卡松（Kathon
蛋白质组学操作规程蛋白质组学样品制备规程01P1
第一部分蛋白质组学操作规程 一、蛋白质组学样品制备规程（01 ） P1. 双向电泳样品缓冲液选用的基本原则 P3. 细胞样品制备（分步）操作规程 P4. 细胞总蛋白提取操作规程 P5. 螺旋藻组织蛋白质提取方法 P6. 嗜热菌蛋白质提取方法 P7. TCA- 丙酮沉淀法样品制备操作规程 P9. 植物材料可溶性蛋白的双乙法制备流程 P10. 动物细胞的样品制备 P10. 动物组织的样品制备——胃 P11. 肺癌组织样品制备 P12. 食管癌样品制备 P13. 羊绒/毛蛋白提取 P13. 大鼠海马组织蛋白提取 P14. 使用Cibacron Blue 3GA Agarose 去除小鼠血浆/血清中的白蛋白P15. E.Coli 样品制备方法 P15. 微生物细胞样品制备操作规程 P16. 去除血浆/血清中的白蛋白和Ig-G P17. 植物根蛋白提取方法 P17. 2D-LC鼠肝样品shotgun消化实验路线 P18. 小鼠肝组织蛋白质提取方法 P18. 小鼠肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P25. 人肝蛋白质组织提取方法 P27. 人肝脏亚细胞器蛋白质提取方法（线粒体胞浆微粒体） P27. 丙酮丁醇菌蛋白质提取方法（选用嗜热菌蛋白质提取方法） P27. 嗜碱菌蛋白质提取方法（尚在摸索阶段） P27. 脑脊液蛋白质提取方法 二、蛋白质定量标准操作规程（02 ） P1. 改良的Bradford 法测定蛋白质含量 P3. Lowry 法（DC 试剂）测定蛋白质含量 P5. Lowry 法测定蛋白质含量（自配试剂） P7. 安玛西亚定量试剂盒使用方法 P8. 利用微板（96 孔板）定量测定蛋白质浓度 P9. BIO-RAD PROTEIN ASSAY 使用方法P10. BCA Protein Assay Kit 使用操作规程 三、蛋白质电泳及凝胶染色操作规程（03） P1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 P3. 固相pH 梯度-SDS 双向凝胶电泳实验操作程序
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
阴极电泳的阳极系统
阴极电泳的阳极反应 通常电泳阳极系统的要素有：阳极单元、阳极液槽、阳极泵、电导仪、流量计、压力表、阳极液供应及返回管路、阳极液溢流及排放管路等等。阴极电泳涂装的阳极系统如图1。 在阴极电泳涂装过程中，当带正电荷的树酯阳离子在工件上沉积时，在电泳槽液中会不断有有机酸根离子（醋酸根离子、甲酸根离子）和氯离子生成（有机酸根离子来源于电泳漆，氯离子来源于固化剂），并相应在槽液中积聚。当有机酸根离子在槽液中聚积过多时将直接导致pH 值降低和电导率的增高，从而影响电泳漆膜的质量和外观（例如在电泳漆表面产生条印，漆膜粗糙）。为了确保最佳的涂装效果和电泳漆液的稳定，必须在涂装过程中通过阳极系统将这些酸根离子持续不断地除去。 这些有机酸根离子会与在阳极上富集的带正电荷的氢离子发生反应，我们称其为“阳极反应”。热点模具网 阳极单元 电泳阳极主要有管式、卷式、板式、中空纤维等四种，其中又以管式和板式用得最多。管式和板式阳极通常封闭在可冲洗的阳极罩中，极罩由不导电的材料制成。 阳极单元一般由阳极棒（电极）、阳极隔膜、绝缘的阳极罩、阳极液输入管、阳极液输出管等构成。阳极单元结构如图2。
1. 阴极电泳阳极棒 阴极电泳的阳极棒正是和工件阴极一起形成电场的阳极，可见其在电泳工艺中的重要性。阴极电泳的阳极棒、螺栓及垫片通常使用不锈钢（例如316L不锈钢）或钛合金板，阳极棒的厚度最好不小于3.2mm。阳极单元的阳极棒直接参与了电泳涂装的电化学反应，所以会逐渐损耗。阳极棒都有一定的生命周期，其消耗速率取决于通过电泳槽的产品及生产率。如果操作正确，通常阳极单元有3～5年的生命周期，经过特殊处理的阳极棒的生命周期会相对长一些。在实际生产中每年都应该对10～20％的阳极单元进行拆开检查。通常每个极罩应配备一个便于观察的安培计，以便连续监测每个阳极的工作情况。 2. 阴极电泳阳极隔膜 阳极膜是阳极单元的主要构件之一，其作用正是通过电渗析除去电泳过程中产生的酸积聚，这样就可以除去多余的酸，维持槽液的正常pH值。热点模具网 阳极膜是一种半透膜，它能够在电场的作用下选择性地允许带有相应电荷（负电荷）的离子通过，这种半透膜只有水分子、小的酸根离子等小分子能够通过，树脂、颜料等大分子则不能透过。阳极液和电泳槽液就是借助于这种选择性透过的半透膜隔离开来的。酸根离子只有在电场的作用下才能从电泳槽液向阳极系统迁移。若没有电场的作用，酸根离子将在浓度极差的作用下在槽液及阳极液中均匀分散，其工作原理见