微生物限度方法学验证

WOIRD格式

微生物限度检测方法学验证方案&D.|[0w#j!Q+{/w

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文件编号：P-AMV002-1101

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9`'j5[+y9c&C)D!O*O

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(L1L-n3{/J;K

执行前批准签字页2N+}8E8x%C!M1b2~1o'}

方案起草姓名公司/岗位签字日期

:c"s'R:u"l1q#l'o)}8h (@.}&N#s;[2E)H&U!R

1G5Q-h5N)|+I2p

方案审核姓名公司/岗位签字日期

+N:w0{4j"`"}

-x4r(Z#P;a3Z/|0U

1\2P&v6j*`2h

方案批准姓名公司/岗位签字日期$p1h:X#G"u.}

)B;d.V7R!@7t5v&D

9a0l!i,W4p4o6f+Z4V

7s*X3F8A7B3q"`1g

6T9y;U,k+k9b

目录

,t,n2w&_4mT

1.目的4

2.范围4,V*l"_%Q5f,K#k

3.责任者及职责43^X*Q$x(E3g:B)E

4.验证简介4

5．验证过程7

6．结果判断76c9[/O1U&R

7．结论和建议7%{)x.{$f%I

8．异常情况报告7*E.Q.`;?!k#q

9．再验证7

10．附件8/O0@.@8O!`:c5c1n!k

1L)N.^2w+d3Y%V

1.目的$M;j2K6p'|:y3F'K+K

按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。;x'?8a'^6C5@!^

2.范围&J+b'o7r7m6Z5t

龙加通络胶囊成品8A,S/U]3h1J

3.责任者及职责

部门职责

QC起草并审核验证方案

进行验证试验的具体操作

完成验证记录中相关操作记录的填写

根据验证结果起草和审核验证报告6q5D5e1|(h,f3C

QA审核并批准验证方案和验证报告(S&h:^!z#k,K:B1Q!j)?&^

监督验证方案的实施7?4y(`6P(r

4.验证简介

4.1定义

CFU：菌落数

供试液3].N/E/p"O8}6C7R4d

取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。

供试品对照组

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。'S#h$n1U:X's/J)e"C 试验组

取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。

菌液组

测定所加的试验菌数。%I8Y$G*Q4f;u.C*|%l+N

样品组样品溶液菌悬液

（50-100CFU）稀释液平均菌落数

(CFU/皿)

供试液对照组+-+C供试液对照组3G#_,O-A'P#P;H

试验组+++C试验组

菌液组-+-C菌液组'z5n%U:j2A(~"}N

4.2菌悬液

4.2.1菌种及来源(y)W#A2Q$p.I8y4M4m"z.|#p

本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下：

培养基名称名称及代号编号批号代次有效期至来源

营养琼脂;{#X!e5G$K.I

培养基金黄色葡萄球菌5A"m%R/H!`4[+s3@

CMCC(B)26003注释1注释2中国生物制品检定所"x7i8@#~+

k1j"L2c

大肠埃希氏杆菌!C+G)S,c-NH+p

CMCC(B)44102"`;X#m%_8R,`

枯草芽胞杆菌5s,C2Q%{Sy.{#Q

CMCC(B)63501;A1n#H6t"?.X&O6{3J

玫瑰红钠5\$K6K+D9["~3G)g$a#s)t1r7O

琼脂培养基白色念珠菌6|!x+?&N*Rs9i;k%a

CMCC(F)98001,G]:s"h0A!p(D

黑曲霉

CMCC(F)98003+Rf(L/N:h5[+A8|2J

备注$D'_2t'\#O

检查人：复核人：检查日期：

4.2.2菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，20~25℃培养24~48h。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml

含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的

方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶

液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。

4.3培养基及稀释液4V)Z!~!g%z%U0l

4.3.1培养基和稀释液的名称:U*_*Z6d5M9x0z:E6f

培养基：营养琼脂培养基（121℃15分钟）、玫瑰红钠琼脂培养基（121℃15分钟）

稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液（121℃30分钟）

4.3.2培养基灵敏度复核!V&g5[D)u;W${9B

培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》，结果见附件1。-J7d9o+a)D9YC8 C

4.4供试液的制备

4.4.1样品名称及数量9v:m&Z7S.F&P$B

.}*?(X+e:k)|-j:[

样品名称批号取样量#e6u&X*|+M$a"n

龙加通络胶囊（成品）10g0o9m;o'^/a1v'q

10g"R'S!H.Q6y.{6_1q

10g

4.4.2样品预处理方法

取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。'k8i3^4Y9e&t.^

4.5实验用品2i4r(D"\+t-@

实验设备

名称型号规格厂家有效期t0a,y:`/z$r;E(X

低温培养箱注释3(y(O*J!{9S6r'S.y9h

生化培养箱注释3)b5m4p#O7T8X

洁净工作台——+m"Y#b3N#v"B-C0u6?

生物安全柜——,P.@+B#x!l4_"h#h*Z7h

水浴锅——0g7z/~8m.d-c

备注

检查人：复核人：检查日期：(Y,b;E.`8|

实验中使用培养基2y0O,F3B5e$p

名称规格厂家8g$t#a0k:z(q5U8I

营养琼脂培养基,o)@8`$h'n1X%O

玫瑰红钠琼脂培养基8Q;h7z+f7D

硫乙醇酸盐流体培养基

改良马丁培养基

营养肉汤培养基

改良马丁琼脂培养基

4.6参考文件1}"f$Z+uz.]+f

中国药典2010版第一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法

《验证管理规程》8Z)P!l;L!a+{

《超标数据调查及处理管理规程》

《异常情况管理规程》#W)\"V:r$m)k)D

《取样管理规程》

《培养基管理规程》"C9\4B6[/_.t-q-t1h

《培养基的灵敏度检查操作规程》*K6X)H*f'm#R&T.Q5X4[/sb!w

《菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程》8[7m#I9_9h5[

《微生物限度检查操作规程》

5．验证过程

5.1试验次数：验证试验应进行3次独立平行实验4k$R,F!n0c5_&S1~(c

5.2试验器具准备0p"t$o9~0V0b+T8k

试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和无菌的玻璃平皿（Φ90mm）一同放入无菌室的传递厨内，打开送风和灭菌按钮。;e4O1j1x*Z0x

用当月使用的消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。5T'L"l0c8m@

5.3测定4M:~1x$m!J1a7@,S:|*k'B

5.3.1按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。-^:Y"p2\5t1v%W8K

5.3.2用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。

5.3.3在无菌环境下，取4.2.2项下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立即将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基倾倒入内，每个平皿约20ml，每株试验菌平行制备2个平皿。待培养基混匀、凝固后准备培养计数；

取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注保温在水

浴锅中（45℃）无菌玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待培养基混匀、

凝固后准备培养计数；以上作为菌液组。

5.3.4无菌操作取4.4.2制备的预处理后的样品，加入至4个无菌平皿中，每个加入1.0ml。

将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基分别倒入

2个无菌平皿中，每个约20ml。作为供试液对照组。

5.3.5无菌操作取4.4.2制备的预处理后样品，加入至10个无菌平皿中，每个加入1.0ml，

同时将4.2.2项下配制的5种菌液每种加入到2个已加入样品的平皿中，每个平皿加入1.0ml。将保温在水浴锅中（45℃）无菌营养琼脂培养基和无菌玫瑰红钠琼脂培养基培养基按4.2.1

项下规定，加入到平皿中，每个约20ml。作为对照组。

5.3.9将5.3.3-5.3.5制得的平皿按下表进行培养，结果记录在附件2上。

培养基培养温度培养时间菌种名称

营养琼脂培养基30-35℃3天金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌

玫瑰红钠琼脂培养基23-28℃5天白色念珠菌、黑曲霉"W*?+h5i6E

6．结果判断;`+Z1P$`"b2Z:O

在三次独立的平行试验中，试验组的菌落数回收率K(试验组的平均菌落数减去供试品对

照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。若三次独立试验中

任何一次K低于70%，应改进试验方法以消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。+l/ |(M.Z-c&U/W

试验组的菌落数回收率K=×100%

7．结论和建议

此项中将根据实际测试的结果给出结论，有异议的将给出建议。

8．异常情况报告

对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照《异常情况管理规程》执行。0H.a8c*f:b'I 9．再验证

如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。

10．附件3D;F~.Z/g.f$r/g2L1}

10.1附件1培养基灵敏度检查记录

10.2附件2微生物方法学验证记录

10.3附件3培养基厂家报告

10.4附件4菌种报告

5U$@5V3f)U:O+C

执行后批准签字页

记录起草姓名公司/岗位签字日期

;h,l1@!K0D!D

记录审核姓名公司/岗位签字日期

-G9nO'j!h"?

6g*w1Y#vs9q2P

记录批准姓名(E0s+V*}{4V$|

公司/岗位签字日期%M,V)E4g&h.X/R)u

&\#w-a#j;I!u)M)C$P6y

"['k,h6g#k%K9u7k

'p+a4x&s.|

控制菌检测方法验证方案

(N;M+M(~!@

&e;p2F:_*R3U$c%k

*h%e$n#t5W5q!b2m&T

文件编号：P-AMV003-1101

9i:p,G8R5s2\)Q6K/A

1~&i-S#O5\6v6c$F!_*Z8u

#E2A5O(c7F+Du:I

执行前批准签字页1m8@1J'}+[3s+[

方案起草(L.~7R9P-m#t1P

姓名

公司/岗位3\k)F4u)E2j)q0M._)f6y

签字

日期$f7X%A*`4u;^.C7H

'A9_5X5M5C9|:k&z4h6~

3v;T4U3}l0s

9i*U4k)^6q#\8u-L4v

方案审核"v-s0t)L8p3]

姓名

公司/岗位p+U4v)B&x2{1\1_'^4m/s:_

签字+S(A;RR5j!x&j6Q"^

日期8C5L8J(w1I7P#`&d

1z4R4q!m4|/e;_#K

1x2Le&d,m;|:|*G

1F6W+O#C6M#Z;S.J6E$H!O &Z#]-B6D8J"\(Y0X&L0s

方案批准

姓名

公司/岗位3H6q(K'S-F

签字9[&P0t8`;h(\6i

日期

.c.S9`1f-j:N(E

(P(B$@:S1[9X:X"L

!z$W/},i,H(H$Q)Q

R-L6w:K:a

'c(|:Z'h9E(E

*g1{-U+E7d!k7@

5Q5X;o9I0R5D3n8q&E

)?"n6M:V"r+L;a

目录

:G*o9v6X2`%G4T/e1?6F

1目的4

2验证简介4

3环境设备及物料44V-t&L5M)n-}

4参考文件5

5验证过程及可接受标准52q8t,n%i.I

6结果评估85_+p7c:S.E(e2l!J!x

7异常情况及变更：8-\$f1\~0?){7^-z

8结论和建议8

9再验证周期8$@1c&\5r(h8E%O3F

10附件清单8%J.m+U!Y:F+H+M7d5p

11变更历史9-U+N-k3](W*M!^;n

1目的+^+|-d*p%h*B

本验证的目的是根据中国药典2010版第一部，对进行大肠埃希菌和沙门菌检测的样品的进

行方法验证。8^4F:^#s(@8r5b"F!D

2验证简介

2.1本验证是对控制菌检测方法进行验证。其中----胶囊(成品)检测的控制菌为大肠埃希菌，

空心胶囊检测的控制菌为沙门菌。0A3};t)D;G:_"T#\6u4c

2.2本验证所采用的方法依据2010版中国药典一部中控制菌验证检验方法。:y._0p,J$k5P*u2C: U2C

3设备和物料7{9_%|)K2}

3.1验证设备1S(y&S/F%\:M7\8]

名称型号设备编号有效期厂家

生化培养箱（30-35℃）7P%S%\.v,\7L

生化培养箱（23-28℃）8],J9Y#r2Q$H

洁净工作台——7p,W0\&Cp

备注3a7u%s%a-m-P4I

检查人：复核人：检查日期：.

3.2验证所用物料

名称厂家批号f:_(N:O%UR

胆盐乳糖培养基0r*O5?#y3Z#s

4-甲基伞形酮葡糖甘酸培养基（MUG）%D9W:z2U3{)w.s/z.z

营养肉汤培养基"@6M4l/I)WY:a5x2f8a(B!f

四硫磺酸钠亮绿培养基

胆盐硫乳琼脂培养基0~7C6_%|:y-l;u:m+j(x

曙红亚甲蓝琼脂培养基

三糖铁琼脂培养基

KH2PO4

Na2HPO4

NaCl7M&vw#L#M'L

蛋白胨

对二甲氨基苯甲醛

95％乙醇

浓盐酸

备注

检查人：复核人：检查日期：

3.3样品!l0N1F,r:K;_3H(i.V&V

样品包括-------络胶囊(成品)和空心胶囊；按照下表中所列样品名称进行3次独立平行试验，进行3次独立取样，取样方法参见QC004《取样管理规程》。

样品编号样品名称取样量/批取样批号

01****胶囊(成品)

8?!Q%K4E:v)h

2e:|._8c*D"v

02空心胶囊-NI,u4e2D:\-rv

备注

检查人：复核人：检查日期：.&f$G9{0T2P

4参考文件

序号文件编号文件名称版本号

1试剂管理规程.y.f:a/P1{(`1w/V

2质检区洁净室管理规程2[6G!a0x6^%F

3培养基管理规程

4培养基的灵敏度检查操作规程

5微生物限度检查操作规程$y$].Oz+g7K&z+?(w

6实验室物品灭菌操作规程2{*[5@,V3|6J,V$Y

7菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程

8变更控制管理规程8z*k(C)D3~#@

9异常情况管理规程

10工艺验证管理规程

11超标数据调查及处理管理规程

12验证管理规程

13分析方法的验证管理规程*]!f/P"?$[:f

备注(Y9E.F,^1?3@.X

检查人：复核人：检查日期：.

5验证过程及可接受标准

5.1验证准备

3t)h(s(_$u-J$}$z

1\/c#P2|.^+O+W9s

5.1.1试验用菌种及培养基%h%d5j.q.t4S2B-x

名称及代号编号来源批号&f/Z'l.K$l#V3m-R'a!|

大肠埃希菌CMCC(B)44102中国生物制品检定所*B1X2O(Q:G']*I7]

金黄葡萄球菌CMCC(B)260033l(?6g.t:d

乙型副伤寒沙门菌CMCC500946^0F.q1g;@1Y/[

备注

检查人：复核人：检查日期：

5.1.2试验器具准备：试验前，将准备好的培养基、样品放入无菌室的传递窗内，打开送风和灭菌按钮。对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌至少

30分钟。

5.1.3所需试液：0.9％无菌氯化钠溶液，无菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，靛基质试液。配制过程见《试剂管理规程》。.])X1u'}1Z

5.1.4菌悬液配制：按照《菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程》，接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h，

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成

每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。9a'W/z.S0v"{4v/

`4]

查

5.2培养基适应性检

2B3EW!Q8o4j/z4W*s$A-v(g

检查

培养基适应性

胆盐乳糖

培养基待测管4管

对照管2管

每管9ml促生长能力：待测培养基和对照培养基各2管，分别接种大肠埃希菌（菌量

＜100CFU），30-35℃培养18-19小时；待测培养基管及对照培养基管大肠埃希菌生长良好抑制能力：待测培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌（菌量≥100CF）U，30-35℃培养47-48小时，金黄色葡萄球菌不生长

MUG待测管2管

对照管2管

每管5ml促生长能力、指示能力：分别接种大肠埃希菌（菌量＜100CFU），30-35℃培

养5-6小时；待测培养基管及对照培养基管大肠埃希菌生长良好，指示剂反应与对照培养基

一致

甲蓝7J/[*E'a.u

曙红亚

琼脂培养基待测及对照各2个平板促生长能力、指示能力：分别接种大肠埃希

菌（50CFU＜菌量＜100CFU），30-35℃培养18-19h；待测培养基管及对照培养基管大肠埃希

菌生长良好，指示剂反应与对照培养基一致

汤

营养肉

培养基待测管2管

对照管2管;w!i)N#K$U,b,A:}1y4G

每管9ml促生长能力：分别接种乙型副伤寒沙门

菌（菌量＜100CFU），30-35℃培养18-19

小时。待测培养基管及对照培养基管乙型副伤寒沙门菌生长良好

四硫磺酸钠1{7U!C)ZGK

亮绿培养基待测管4管

对照管2管D)LK*g3u&_

菌

每管9ml促生长能力：待测培养基和对照培养基各2管，分别接种乙型副伤寒沙门

（菌量＜100CFU），30-35℃培养18-19小时；待测培养基管及对照培养基管乙型副伤寒沙门

菌生长良好

抑制能力：取待测培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌（菌量≥100CF）U，30-35℃培养23-24小时，金黄色葡萄球菌不生长5z;{$H"e+F4p$d*v

胆盐硫乳

琼脂培养基待测及对照各2个平板促生长能力、指示能力：取乙型副伤寒沙门

菌（50CFU＜菌量＜100CFU）接种于待测及对照培养基的平板上，30-35℃培养18-19h，待

测培养基平板及对照培养基平板乙型副伤寒沙门菌生长良好，指示剂反应与对照培养基一致

曙红亚甲蓝

琼脂培养基待测及对照各2个平板促生长能力、指示能力：取乙型副伤寒沙门

菌（50CFU＜菌量＜100CFU）接种于待测及对照培养基的平板上，30-35℃培养18-19h，待

测培养基平板及对照培养基平板乙型副伤寒沙门菌生长良好，指示剂反应与对照培养基一致

三糖铁琼

脂培养基待测及对照各2个试管斜面指示能力：取乙型副伤寒沙门菌2-3个菌

落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18-24h，指示剂反

应与对照培养基一致

5.3大肠埃希菌检测程序!s,N#_,B"h7C:n'H

5.3.1按照《质检区洁净室管理规程》规定程序更衣，进入无菌室。

5.3.2用70%酒精棉球擦拭工作台面、培养基、样品表面后放入超净台内。

5.3.3样品的供试液的处理：取供试品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。

5.3.4样品试验：

Ⅰ取供试液10ml接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，30~35℃培养18~24h。/w6V3U:\$^9g'H; A

Ⅱ取Ⅰ中培养物0.2ml接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时在366nm

紫外光下观察，同时以未接种的MUG培养基管作本底对照，若供试液的MUG管呈现荧光，

则为MUG阳性；若无荧光，即为MUG阴性。

Ⅲ沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色

为靛基质阴性。

5.3.5阳性对照：取配制好的大肠埃希菌菌液1m（l含菌数50~100CFU），代替供试液按照5.4.4 操作，作为阳性对照。#f4n8x6W2}

5.3.6验证试验：取供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基中，同时加入配制好的大肠

埃希菌菌液1ml（含菌数50~100CFU）按照5.4.4重复操作。结果应与阳性对照的实验结果

相一致。z+m1c!K5a(e6p+D&O!s

5.3.7阴性对照：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，代替供试液按照5.4.4操作，作为阴性对照。

5.3.8判定条件：依据培养基指示能力判定结果m-x&T)?#z0y7_;f

MUG靛基质结果"O&j1Tu2J$S6^

阳性阳性检出大肠埃希菌

阴性阴性未检出大肠埃希菌$XG2`7I:_%b+[

阳性阴性取胆盐乳糖培养基的培养物接种曙红亚甲蓝琼脂培养基，30-35℃培

养18~24h

阴性阳性取胆盐乳糖培养基的培养物接种曙红亚甲蓝琼脂培养基，30-35℃培

养18~24h

大肠埃希菌在曙红亚甲蓝琼脂上菌落形态：呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，

菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。

曙红亚甲蓝琼脂培养基平板上无菌落生长或生长的菌落不同于上述特征，供试品未

检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与上述特征相符或疑似，确认为大肠埃希菌。0v#j"U# y;I

5.4.9可接受标准：(a6h%j7}-B,J4k

阴性对照组应为阴性，应无菌生长。

阳性对照组应为阳性，应能检出控制菌。

验证试验组应为阳性，应能检出控制菌。

5.5沙门菌检测程序-i(|x+g8](i*B&E

5.5.1按照《质检区洁净室管理规程》规定程序更衣，进入无菌室。+N(q2i+ao/T$}

5.5.2用70%酒精棉球擦拭工作台面、培养基、样品表面后放入超净台内。

5.5.3样品试验：

Ⅰ取供试品10g接种至200ml的营养肉汤培养基中混匀，30~35℃培养18~24h。

Ⅱ取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中30~35℃培养18~24h。+W;n3]$]) O$~$?,Y;n0I

Ⅲ取Ⅱ中培养物分别划线于胆盐硫乳琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上30~35℃培养18~24h。5S;K!F,O8v

5.5.4阳性对照：取配制好的乙型副伤寒沙门菌菌液1ml（含菌数50~100CFU），代替供试液按照5.5.3操作，作为阳性对照。

5.5.5验证试验：取供试品10g接种至200ml的营养肉汤培养基同时加入配制好的乙型副伤

寒沙门菌菌液1ml（含菌数50~100CFU）按照5.5.3重复操作。结果应与阳性对照的实验结

果相一致。

5.5.6阴性对照：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，代替供试液按照5.5.3操作，作为阴性对照。%X5ma%u'L&}3I

5.5.7判定条件：平板上无菌落生长或生长的菌落不同于下表所列的特征，判供试品未检出

沙门菌。平板上生长的菌落与下表所列的特征相符或疑似，用接种针挑选2-3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，如斜面未见红色、底层未见黄色，或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌，否则确认检出沙门菌。%U#@0b%K3S

沙门菌菌落形态特征

培养基菌落形态

胆盐硫乳琼脂培养基无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。

曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。(N6\(U8F#a$K9c-

E

5.5.8可接受标准：3X%r6s2d+E*{"h

阴性对照组应为阴性，应无菌生长。&|:I0E4~-l3q9|"k,S

阳性对照组应为阳性，应能检出控制菌。

验证试验组应为阳性，应能检出控制菌。"O7D$_8c.`%[2i

6结果评估

6.1在三次独立的平行试验中，实验结果可以达到三次结果一致。

6.2若验证试验组均应能检出试验菌，则可以依照此供试液制备法和控制菌检查法进行供试

品的该控制菌的检查。

6.3若验证试组验未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中

和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。6\8z7d*P7P(} 7异常情况及变更：5i4~8o&X4x

对于所有在验证过程中所出现的异常情况应按照《异常情况管理规程》执行；变更情况应按

照《变更控制管理规程》执行；不合格情况及处理措施应按照《超标数据调查及处理管理规程》执行执行。经QA评估后，确定验证结论。"{0]8[8C3i

8结论和建议!v-X-D;O8q*V&l

此项中将根据实际测试的结果给出结论，有异议的将给出建议。.d:n+L6A7q3O,h7O5t+b5h

9再验证周期7uD.W9l,_3M/D

9.1当出现某些特殊因素，如需要更换验证中所涉及物料，应进行再验证。

9.2当验证中的验证方法或验证条件需要改变时，应进行再验证。3l0l0z$]&g%_

10附件清单1d;}1`5m7V4A6K9}7z'g8M

附件1：培养基无菌性检查记录2J1`0z0T"~

附件2：液体培养基灵敏度检查记录"p"gE)B4X&i/I'D

附件3：固体培养基灵敏度检查记录

附件4：大肠埃希菌检测记录

附件5：沙门菌检测记录

附件6：菌悬液配制记录)Q/r)U)i$V5a*O

附件7：设备校准证书

11变更历史2e4H+X$U7z0MP&k

版本方案批准日期修订内容

1101——首次验证

*f)h5\:Q9r4H#v&[9Y

附件1：培养基无菌性检查记录$W:T4^(D$E

pH计编号培养箱编号20-25℃30-35℃2T,g)};M*g'W

1.胆盐乳糖培养基

批号pH标准：7.4±0.2无菌性检查（每个温度培养5个）

pH值pH是否合格培养时间：~#N8`#j4t-|#^"}

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，

不合格"p%R$e3I&^

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，

不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，

不合格

2.MUG3X%q(o+Q'@*R/g;Z:j

批号pH标准：7.3±0.1无菌性检查（每个温度培养5个）

pH值pH是否合格培养时间：~

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，

不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，

不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

3.曙红亚甲蓝琼脂培养基

批号pH标准：7.3±0.1无菌性检查（每个温度培养5个）

pH值pH是否合格培养时间：~+WV5e%}7]0Y3X6M

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格)H5F)fO5{![!z)LQ

4.营养肉汤培养基

批号pH标准：7.2±0.2无菌性检查（每个温度培养5个）

pH值pH是否合格培养时间：~1i3`*j'c8P

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

5.四硫磺酸钠亮绿培养基

批号无菌性检查（每个温度培养5个）

培养时间：~5o3R#g0\9B,l6a'i

□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

□均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格$Y&g0b(|7B!B.L □均无菌生长，合格□培养基混浊，有菌生长，不合格

6.胆盐硫乳琼脂培养基

批号pH标准：7.2±0.1无菌性检查（每个温度培养5个）0r%W'l1[0~4h4~ pH值pH是否合格培养时间：~

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格

□合格□不合格□均无菌生长，合格□至少1个有菌生长，不合格

检验人及日期复核人及日期

*})n%@;f4~-~&c

&_'G:W5u9[.v

附件2：液体培养基灵敏度检查记录（1）1p!J)~4F-B/V-h%R6B%E%v

1.胆盐乳糖培养基

培养基名称胆盐乳糖培养基:a)^)`.l"|2G9}$a%G

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基"z&s"|-m0

g;?;e(W-{

对照培养基批号培养时间

培养温度培养箱编号

评定标准加抑制能力菌的待测培养基在规定时间培养后应无菌生长；加促生长能力菌

的待测培养基在规定时间培养后，与促生长对照用培养基比较，试验菌生长情况应与对照培养基一致。$tpg/]*P8X5g7C0`!s5k4h

检查日期~

菌种名称大肠埃希菌（促生长能力）金黄葡萄球菌（抑制能力）

菌悬液批号)g+N1]G7j

菌液加入量#m)h$U!w?"Y(e${7c

培养基ⅠⅡⅢCⅠⅡⅢ6a;n0H(V:g4f*s$f'o

结

果

□合格

□不合格□合格%]8a:M.k,D-H)s

□不合格□合格9t3\)n.G"`3q

□不合格□合格*j4K4_"]5A5~&N*|;K

□不合格□合格

□不合格□合格

□不合格□合格)M#}$?-P(^-OX-N

□不合格

检验人及日期复核人及日期

&v(C&Q1G,U0~4H.z)Z9f8B

*k-J/L*p.~+],?%P)e1b%F

2.四硫磺酸钠亮绿培养基

培养基名称四硫磺酸钠亮绿培养基

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基

对照培养基批号培养时间

培养温度培养箱编号

评定标准加抑制能力菌的待测培养基在规定时间培养后应无菌生长；加促生长能力菌

的待测培养基在规定时间培养后，与促生长对照用培养基比较，试验菌生长情况应与对照培养基一致。

检查日期~

菌种名称沙门菌（促生长能力）金黄葡萄球菌（抑制能力）4y/`.V;?+q8c"Z(`2j

菌悬液批号

菌液加入量

培养基ⅠⅡⅢCⅠⅡⅢ

结

果

□合格

□不合格□合格

□不合格□合格h$P7U:OvK7L0I

□不合格□合格

□不合格□合格

□不合格□合格!Y.]%[*L5x1](E2?#KL9X

□不合格□合格

□不合格

检验人及日期复核人及日期

附件2：液体培养基灵敏度检查记录（2）

3.MUG

培养基名称MUG8o&u/y*y7`+oZ/T

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基

对照培养基批号培养时间

培养温度培养箱编号

评定标准阴性对照管在规定时间培养后应无菌生长；加菌的待测培养基在规定时间培

养后，与促生长对照用培养基比较，试验菌生长情况及指示剂反应应与对照培养基一致。3K(X* [5D8K.a-`%Q2X

检查日期~阴性对照□阴性□阳性

菌种名称大肠埃希菌菌悬液批号菌液加入量

培养基ⅠⅡⅢC

结果m(s3K$B1t#q6v6f:P

□合格

□不合格□合格#I&p+e(H7U(^!K.b"O4W:b1M

□不合格□合格

□不合格---/@'U'{7_%|4M&d+{6i

检验人及日期复核人及日期

(M({4~(\9^%y3e;b

(h.P-z;H/j*t1K,`

&W@!k"K:D0W.]

4.营养肉汤

培养基名称营养肉汤,@)\#K$FI3U*r

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基5y6P"u*s5

S0a

对照培养基批号培养时间

培养温度培养箱编号:^#W4c7z+t0u

评定标准阴性对照管在规定时间培养后应无菌生长；加菌的待测培养基在规定时间培

养后，与促生长对照用培养基比较，试验菌生长情况应与对照培养基一致。4X7A9x8Y%p(p

检查日期~阴性对照□阴性□阳性

菌种名称沙门菌菌悬液批号菌液加入量

培养基ⅠⅡⅢC1h!X_/[/W;q!_

结果

□合格

□不合格□合格

□不合格□合格

□不合格---"e-~%J9N9r#n,^'i

检验人及日期复核人及日期

3W6O.w9v-]5L

0}!E0_%]6a)k-f

附件3：固体培养基灵敏度检查记录（1）

1.曙红亚甲蓝琼脂培养基2^5V3U$V0L&j1m%Q'M9y

培养基名称曙红亚甲蓝琼脂培养基

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基:%

r8V#|,_6S

培养温度培养时间培养箱编号1a2l)M.T1Y!X

菌悬液名称大肠埃希菌沙门菌:`#j"U,v!z(A0@:d"F!^

菌悬液批号

阴性对照□阴性□阳性□阴性□阳性

评定标准阴性对照应无菌生长，待检测培养基上的微生物数量不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%，且菌落形态大小及指示剂反应与对照培养基一致。

检查日期ⅠⅡⅢCⅠⅡⅢC/t!{5t4P/O&G6j8h8X/D

培养基①①①①①①①①

2个平皿菌落数C"Z)X8^$`9J8S*F

(CFU/皿)②②②②②②②②'t1f-

O2k6g,\9x;]

平均菌落数(CFU/皿)+q1d(I)A;@.A)g$T

菌落数/C菌落数(%)------2r4C#f5lk+

Mj

结果□合格

□不合格□合格#N+t8^$q7g+\*q"X

□不合格□合格2v/o2d%n5d8m;e

□不合格---□合格3d1k+L9q&X7Z

□不合格□合格

□不合格□合格0e7O5U7P5b/Z0^

□不合格---(Q9i:\3I*e,{'c(E)G7k

检验人及日期复核人及日期:F0p4H!C%u+g7Z)F4b*X

2.胆盐硫乳琼脂培养基

培养基名称胆盐硫乳琼脂培养基

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基0m9H)s0L1

q$]:c

对照培养基批号菌种名称沙门菌

培养温度培养时间培养箱编号

评定标准阴性对照应无菌生长，待测培养基上的微生物数量不得低于对照培养基上微生物数量的70%，且菌落形态大小及指示剂反应与对照培养基一致。

检查日期~菌悬液批号阴性对照□阴性

□阳性

培养基ⅠⅡⅢC

2个平皿菌落数&X:t3O!x9L5?

(CFU/皿)①②①②①②①②

平均菌落数(CFU/皿)

菌落数/C菌落数(%)---

结果□合格□不合格□合格□不合格□合格□不合格---

检验人及日期复核人及日期+V2E2}4^8J'Z

附件3：固体培养基灵敏度检查记录（2）

8q;Y-P,z9VXU8Z

三糖铁琼脂培养基9c'c,p!r1x+x4I

培养基名称三糖铁琼脂培养基

加入菌株培养基批号Ⅰ：、Ⅱ：、Ⅲ：、C：对照培养基5S$c)E1N.

v1[4u

对照培养基批号菌种名称沙门菌(q7G:b/E:K%a1O0l

培养温度培养时间培养箱编号&z6?8r;Kn9j"K

评定标准阴性对照应无菌生长，指示剂反应与对照培养基一致9C#M,@7L.K(I4C4_

检查日期~菌悬液批号阴性对照□阴性

□阳性

培养基ⅠⅡⅢC

结果□合格□不合格□合格□不合格□合格□不合格---

检验人及日期复核人及日期

5M5O2s5_3f6c!z#{

$t*s+e/J.u!A

3N)d"|8s.n%D8?(D

:h)E6V9h8R)h:`

:v#k2C*T"q4f1]6W'I

,}"d$c$y+D(a9l

2Z7?3\1P9|:U8R

,N;v5C(P"y3F

}2V&G1A8D0i!k

-Ur!W/Vw9e!_

"b!C0C8X-S3v

5Q0?-O!O1u6P,N

.`)z-]$l#S:E"T

8?,O2X)n:P0q

1X.`'v8s0?/H'D)k8^'?

5X4~!HR6l;C,H

+o$O+k/B:o&z

9Z7Q.v+KB+]*x:N

0R-t8r$Me+T;_-C"d2r

附件4：大肠埃希菌检测记录

;d&S,s%M+o2P

检验日期年月日～年月日培养箱编号

样品名称批号取样量#w:y,_6n(o*e9|

试液及培养基

批号有效期

MUG

靛基质试液

胆盐乳糖培养基

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

曙红亚甲蓝琼脂培养基

结果判定

试验$Y%?)A"e$S']*i

结果样品试验验证试验阴性对照阳性对照

MUG□阴性□阳性□阴性□阳性□阴性□阳性□阴性□阳性

靛基质□阴性□阳性□阴性□阳性□阴性□阳性□阴性□阳性

判*x1D+Z,O'p:u+?:J/o*J

定结果□检出大肠埃希菌

□未检出大肠埃希菌□检出大肠埃希菌,H6w%z-R)p)u1I2`

□未检出大肠埃希菌□检出大肠埃希菌

□未检出大肠埃希菌□检出大肠埃希菌*g7I2},A$R(w#A'X6@1B4y

□未检出大肠埃希菌

继续判定□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如不符合5.4.8项下描述形态，判定未检出

大肠埃希菌。

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如与5.4.8项下描述形态相符或疑似，判定检出大肠埃希菌。0b8 Mu)O#Bt&^9g:h

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如不符合5.4.8项下描述形态，判定未检出大肠埃希菌。7DV% U2\?+~3_

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如与5.4.8项下描述形态相符或疑似，判定检出大肠埃希菌。-\/o3 s,Z8J+\7@)l:]

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如不符合5.4.8项下描述形态，判定未检出大肠埃希菌。'o" m2{5T2n&Z

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如与5.4.8项下描述形态相符或疑似，判定检出大肠埃希菌。9X'?/ ov&P/a(~

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如不符合5.4.8项下描述形态，判定未检出大肠埃希菌。

□划线曙红亚甲蓝琼脂结果如与5.4.8项下描述形态相符或疑似，判定检出大肠埃希菌。

-F!Wn7L4|

检验人及日期复核人及日期

6e4[1m:|*g

#D7N7Qh$L1O5C%{

附件5：沙门菌检测记录

*w7g(l2i*o#_

检验日期年月日～年月日培养箱编号

样品名称批号取样量2p-q4X0y;|'m'c

试液及培养基2f;D8^$X&P!\%y2@%S

批号有效期

营养肉汤

四硫磺酸钠亮绿培养基

胆盐硫乳琼脂培养基

曙红亚甲蓝琼脂

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

结果判定

试验)?;k#X,X3a9x0Y9e*B1U;x

结果样品试验验证试验阴性对照阳性对照'e+M2f,t5E0z"x

胆盐硫乳琼脂培养基□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特征

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特

征+n,o+S'[*E/Q:Z6L4~.L

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特

征

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特

征

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似)n1]1q3r:Hy3E.Y+h

曙红亚甲蓝琼脂培养基□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特征#Y$I:D*W4b*Z-

e&P0C

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落

特征r"G]7U8R3F!U({

□符合其在培养基中的菌落特征或疑似□无菌落生长或不符合其在培养基中的菌落特