细菌标本片的制备及染色培训资料

细菌标本片的制备及

染色

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一、细菌标本片的制备

1.抹片

（1）固体培养物：取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，取1-2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需要灭菌。（2）液体培养物：可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环，在玻片上作直径1cm涂面。

（3）液体病料（血液，渗出液，腹水）：取一张边缘整齐的载玻片，用一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，一45°角均匀推成一薄层的涂面。

（4）组织病料：以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察

2.干燥

涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂片涂面向上，置于火焰高处微加热干燥。

3.固定

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核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择_张富军

第31卷第2期2010年3月西安交通大学学报(医学版) J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Scie nces )V ol.31No.2Mar.2010 ◇技术方法◇ 核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择张富军,任　娟,王飞苗,吕社民,李冬民 (西安交通大学医学院遗传学与分子生物学系,陕西西安　710061) 摘要:目的　探讨不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体检测结果的影响。方法　应用微波修复法、高压修复法、酶修复法和高压加酶修复法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复,然后进行免疫组化染色。结果　DA.1U 大鼠肝组织内核受体L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 经高压抗原修复后,染色阳性强度较其他修复方法明显增强,而且定位较佳。结论　在核受体免疫组化染色中高压抗原修复法染色效果优于其他抗原修复法。关键词:核受体;免疫组织化学;抗原修复中图分类号:R329233 文献标志码:A 文章编号:167128259(2010)022******* Selection of antigen retrieval methods in immunohistochemical staining of nuclear receptors ZHAN G Fu 2jun ,REN J uan ,WAN G Fei 2miao ,L ΒShe 2min ,L I Dong 2min (Depart ment of Genetics and Molecular Biology ,Medical School of Xi πan Jiaotong University ,Xi πan 710061,China ) ABSTRACT :Objective To explore t he eff ects of diff ere nt met hods of antige n ret rieval on t he results of immunohist ochemical staining of nuclear recep t ors. Methods A ntige ns were ret rieved by using microwave oven , aut oclave ,e nzyme and aut oclave plus e nzyme ,respectively ,in liver sections f rom DA.1U rats ,f ollowed by immunohist ochemical staining. Results Af ter a ntige n ret rieval wit h aut oclave ,t he p ositive staining inte nsity of nuclear recep t ors L XR 2 α,L XR 2β,PPAR 2γa nd F XR in t he liver sections f rom DA.1U rats was enhanced obviously ,a nd t he location of nuclear recep t ors was better by using t his met hod t han t he ot hers. Conclusion In t he immunohist ochemical staining of nuclear recep t ors ,using aut oclave t o ret rieve a ntige ns is t he best met hod. KE Y WOR DS :nuclear recep t or ;immunohist oche mical staining ;a ntige n ret rieval 收稿日期:2009202224 修回日期:2009203229 基金项目:国家自然科学基金(No.30400249,30571725,30630058); 陕西省国际合作项目(No.20072kw 206);陕西省自然科学基金项目(No.2004C256) Supported by t he National Natural Science Foundation of China (No.30400249,30571725,and 30630058),Interna 2tional Cooperation Foundation of Shaanxi Province (No.20072kw 206)and t he Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2004C256). 通讯作者:李冬民.E 2mail :lidongm @https://www.360docs.net/doc/078067785.html, 作者简介:张富军(19632),男(汉族),实验师. E 2mail :zfj @https://www.360docs.net/doc/078067785.html, 核受体在生物体内广泛分布,与配体结合后活化,调控基因的表达,在机体生长发育、新陈代谢等生理过程中发挥重要作用。核受体L XR 2α、L XR 2 β、PPAR 2γ和FXR 在糖、脂代谢调控中起重要的作用,参与2型糖尿病的发生发展。免疫组织化学染色是根据抗原与抗体特异性结合的原理,用标记的特异抗体对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量研究。甲醛溶液固定导致许多抗原决定簇被掩盖,不能与抗体很好结合。核受体位于核内,镜下观察染色结果时,若隐若现,抗原表达不均匀。为了解决该问题,使抗原决定簇能很好的暴露出来,我们采取了微波修复法、高压热修复法和酶修复法等。抗原修复方法对DA.1U 大鼠肝组织切片进行修复;比较分析不同抗原修复法对DA.1U 大鼠肝组织内核受体免疫组化染色结果的影响。1　材料与方法 1.1　仪器与试剂　Olymp us DP71图像分析仪。 L XR 2α、L XR 2β、PPAR 2γ和FXR 抗体购自Abcam 公司;免疫组化(SP 法)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2　组织材料　病理切片来自DA.1U 大鼠糖尿病模型肝组织,经40g/L 多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,5μm 厚,每个蜡块各切5片。 1.3　抗原修复　组织切片常规脱蜡至水,3%(体积分数)H 2O 2灭活内源性过氧化物酶,0.02mol/L

细菌的常用染色技术

细菌的常用染色技术简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。例如番红。 1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。 3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。 4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6．干燥 7．镜检复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。例如革兰氏染色法。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。 1.载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。 2.草酸铵结晶紫染1分钟。 3.自来水冲洗，去掉浮色。 4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。 5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。 6.用番红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

做好免疫组化染色必须注意的问题

做好免疫组化染色必须注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，

免疫组织化学及HE染色实验步骤复习过程

免疫组织化学及H E 染色实验步骤

免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片（1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月；（2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—二甲苯浸泡30min—二甲苯浸泡30min；（3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜；（4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块；（5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色（1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯浸泡10min—二甲苯浸泡10min—无水乙醇浸泡5min—无水乙醇浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min；（2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热

GUS 组织化学染色-拟南芥

幼苗GUS染色实验 GUS洗液配方： 0.1 M PBS, pH 7.0 10mM EDTA 2mM 亚铁氰化钾potassium ferrocyanide 2mM 六氰合铁酸钾potassium ferricyanide 300mL中加0.254 g亚铁氰化钾，0.198 g六氰合铁酸钾，EDTA 6 mL（10 mM） GUS染色液(1mM)就是把5 mg X-Glus（5 mg加100μL DMSO助溶，X-Glus用前离心3min）加到5 mL洗液里即成染色液。一次配5 mL染色液，1.5 mL离心管每管分装200 μL，锡纸包住-20℃保存。步骤：一般5d幼苗可进行试验，早上做以方便白天随时观察幼苗着色情况。 1.90%丙酮固定20min； (丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好，因此可用于GUS染色前的固定，可防止GUS信号的扩散。缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。一般4℃下20分钟为宜) 2. 加1 mL GUS洗液洗去丙酮，洗2遍； 3. 加GUS染色液，冰上抽真空15-20 min； 4. 37℃放置，隔一阵观察一下，染上色了就进行下面步骤； 5. 吸出染色液，加入1 mL 70%乙醇，停止染色反应及脱色； 6. 更换几次乙醇直到脱色完全； 7. 解剖镜及显微镜拍照观察载玻片上加适量HCG透明液，用镊子取出幼苗在透明液中铺平，盖上盖玻片，解剖镜观察整株，显微镜观察细节并拍照。实验原理： GUS基因编码β-葡萄糖苷酸酶，相当稳定而不易降解。根据GUS基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）。其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

免疫组织化学实验之常用染色方法百度文库

免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书

细菌标本片的制备及染色

一、细菌标本片的制备 1.抹片（1）固体培养物：取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，取1-2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需要灭菌。（2）液体培养物：可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环，在玻片上作直径1cm涂面。（3）液体病料（血液，渗出液，腹水）：取一张边缘整齐的载玻片，用一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，一45°角均匀推成一薄层的涂面。（4）组织病料：以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察 2.干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂片涂面向上，置于火焰高处微加热干燥。 3.固定（1）火焰固定。是常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（4-6次），以手背触及玻片微烫手为宜。（2）化学固定。有的血片，组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定3-5min 二、常用的细菌染色法 1.美蓝染色法：在经火焰固定的涂片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2-3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干镜检，结果，菌体呈蓝色 2.革兰氏染色法。

（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染1- 3min，水洗（2）加革兰氏碘液媒染，作用1-2min，水洗（3）加95%酒精脱色约30s至1min，水洗（4）加稀释石碳酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检 3.瑞士染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞士染色液于涂片上以固定标本，1-3min后，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水与玻片上，轻轻摇晃使染色液混合均匀，5min左右水洗，干后镜检，菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色 4.姬姆萨染色法。血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定3-5min，干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的缸里，染色30min，或者染色数小时或24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞浆呈红色，细胞核呈蓝色

细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸染色法

一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速—流速为0.1~10.0 ml/min。高效—可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。) 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

组织化学染色

细胞组织化学染色一：性质组织化学是组织学与化学相结合而形成的一门边缘学科。它是在机体组织结构的原位上研究它的化学性质，利用已知的化学反应或物理方法，在细胞组织的原位上显示其结构的化学性质（如，蛋白质，糖类，脂类，酶等等）二：要求 1：保持组织细胞的生前结构。 2：保持细胞生前的化学成分和酶的活性。 3：所有的方法是已知的化学反应或物理变化。 4：反应产物必须是一种有色物质，可以用显微镜观察。 5：反应产物在细胞内，并保持一定的稳定性。三：对象研究细胞或组织中的化学物质，包括： 1：蛋白质：可以显示其中某些氨基酸或功能基 2：核酸：核糖核酸和脱氧核糖核酸 3：糖类：糖原 4：酶类：磷酸酶，氧化酶 5：无机盐：铁，铜，钴等四：方法：固定和显示 1：固定：将细胞的生前结构和化学物质保存下来（1），物理法：冰冻，干燥法（2），化学法：甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等 2：显示：不同物质显示法分下面几种（1），化学法：A：金属沉淀法，钙－钴法显示碱性磷酸酶 B：偶氮偶联法，蛋白质，脂酶，氨基酸 C：雪夫反应法，糖元 D：联苯胺反应，过氧化物酶 E：普鲁士蓝法，显示三价铁（2），物理法：A：脂溶染色法 B：荧光显示法 C：放射自显影法五：意义 1：研究血细胞的代谢与机能 2：血液病的诊断与鉴别 3：某些血液病的疗效与预后判断参考六：常用的几种染色法及临床意义 (一) 糖原（高碘酸－雪夫（PAS）染色） 1：血片或骨髓片于95％乙醇中固定10分钟后，水洗待干。 2：在1％的高碘酸溶液中浸10－15分钟，水洗待。 3：放入雪夫溶液中30分钟，水洗待干。 4：2％的甲基绿复染15分钟。 5：水洗凉干，油镜下检查。结果：PAS阳性反应物质呈红色颗粒或团块状定位于细胞质中，颜色因糖元的量不同而呈粉红或深红。淋巴细胞：PAS 阳性10－15%之间 ↑：慢淋淋巴肉瘤及何杰金淋巴瘤 ↓：急淋粒细胞：原粒细胞阴性，早幼粒弱阳性，分叶呈阳性 ↑：感染再障 ↓：慢粒急性白血病红细胞：有核红细胞阴性

12.形态学检查.

教学活动设计方案十二学习情境四：微生物的鉴定总学时44学时授课日期 1101班项目十二：形态学检查学时2学时1102班教学要求教学目标能力目标： 1.知道对可疑培养物进行细菌形态学检查的方法及意义。 2.会做细菌不染色标本的检查：悬滴法、压滴法。 3.会做细菌染色标本的检查：革兰染色、抗酸染色。 4.会使用暗视野、明视野显微镜观察细菌动力。知识目标： 1.明确细菌不染色标本检查的原理、方法、结果及意义。 2.明确革兰染色原理、方法、结果判断及意义。 3.明确抗酸染色原理、方法、结果判断及意义。态度目标： 1.严格按照操作规程进行操作。 2.具有团队合作意识，培养分析问题及解决问题的能力。 3.具有高度的质量意识，养成良好的操作行为习惯。 4.对处理后的培养物妥善处理，注意生物安全。重点难点 1.针对可疑培养物选择形态检查方法。 2.暗视野显微镜的使用。教学资源培养基、接种环、酒精灯、超净工作台、显微镜、各种细菌培养物、革兰染液、抗酸染液等教学环境医学检验实训中心、一体化多媒体教室教学方法问题导入、多媒体展示、现场教学、全程参与式教学教学步骤问题导入：问题1：尿液标本在血平板上长出圆形、光滑、湿润、灰白色略扁平的菌落，怎样进行后续检测呢？问题2：粪便标本在SS琼脂上长出无色小菌落，疑似志贺氏菌，用怎样一个简单的方

法大致判断呢？引入学习内容： 1.针对不同的可疑培养物选择正确的细菌形态检查方法,明确形态学检查在细菌鉴定中的意义。 2.运用革兰染色或抗酸染色检查细菌的形态。 3.用暗视野显微镜、明视野显微镜检查细菌动力。教师多媒体授课 1.可疑培养物的细菌形态学检查方法：【不染色标本】不染色标本检查法：压滴法、悬滴法、暗视野检查法；不染色标本检查的意义：主要用于检查细菌动力。【染色标本】染色标本检查法有：革兰染色法、抗酸染色法、特殊染色法；染色标本检查的意义：主要是鉴别细菌 2. 不染色标本检查法的技术要点：【材料准备】不染色标本检查法所用材料：洁净的玻片、盖玻片、凡士林、无菌生理盐水、酒精灯、接种环【技术要点】1.标本新鲜 2.高倍镜观察 3.鉴别运动形式，正确判断结果 4.暗视野显微镜的使用要点压滴法、悬滴法学生实训 1.将学生分成8组，每组4人。 2.发放各种疑似培养物标本。 3.进行疑似培养物的涂片染色镜检，并记录结果。 4.进行疑似培养物的动力观察，并记录结果。 5.在操作过程中可以相互探讨，及时纠正操作训练中出现的问题。教师现场指导： 1.悬滴法和压滴法技能训练。悬滴法、压滴法方法步骤；悬滴法、压滴法注意事项 2.运用革兰染色检查细菌形态。革兰染色在形态学检查中的地位；染色关键步骤；染色方法类型与运用学习效果评价

(完整版)实验四细菌抹片的制备及染色

实验四细菌抹片的制备及染色实验班级：2017级牧医高职（动物微生物）指导老师：陶波实训地点：实训室207 时间：2018年6月【目的要求】 1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。 2.认识革兰氏染色和瑞特氏染色的反应特性。【实验材料】试剂用品：载玻片、接种棒、酒精灯、吸水纸、生理盐水、染色液等。菌种：羊、兔粪便便中提取培养的细菌。【实验内容】一、细菌涂片的制备 1.载玻片准备载玻片应清晰透明，如有残余油渍，可用95%酒精清洗。 2.抹片根据材料情况不同，抹片方法也有差异。液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片中央均匀涂布适当大小或可采用推片法。非液体材料（菌落、脓、粪便）应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用灭菌接种环取少量材料，在液滴

中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上触片或涂抹成薄层。 3.干燥上述涂片应让其自然干燥或适当烘干处理。 4.固定有两类固定方法火焰固定法：将干燥好的抹片使其涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰来回拖过数次，略作加热进行固定。化学固定法：血液、组织脏器等抹片要做姬姆萨染色，不同火焰固定，可将干燥后的抹片滴加数滴甲醇其实作用2~3min后自然干燥进行固定（瑞士染色可不做甲醇固定）。二、几种常用的染色方法（一）姬姆萨染色将足量的姬姆萨溶液（或将姬姆萨原液稀释）滴加到抹片上，或将抹片浸入盛有姬姆萨染液的染缸中浸染30min 至数小时，取出后水洗，吸干水分后镜检。（二）瑞特氏染色瑞氏染料是碱性美蓝与酸性伊红混合而成的染料，当溶于甲醇后立即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。由于细菌菌体蛋白偏酸性，菌体带负电（菌体蛋白等电点多在pH2~5），被染成蓝色。在以固定好的涂片或触片上滴加足量的瑞氏染液，染色3~5min后水洗，吸干水分后镜检（如染色不理想可重复几次）。（三）革兰氏染色 1.在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1~2min ,水洗。

特殊染色及组织化学

第一节特殊染色及组织化学的基本知识一、染色方法 1863年由waldeyer率先倡导用苏木素染液染细胞核，后来Mallory、Mayer等也阐述过苏木素的应用。近年来特殊染色和组织化学方法也屡有创新。Shikata(1973)，Tanka 等(1981年)分别介绍了用地依红和维多利亚蓝混合液显示乙型肝炎表面抗原的方法；1987年Crocker J等推出了核仁组成区嗜银蛋白染色的技术方法以及1991年进行的乳腺肿瘤核仁组成区的研究方法等。特殊染色的分类：特殊染色方法按照所染目的物进行分类，有结缔组织、肌肉组织、神经组织、脂类物质、糖类、色素、病理的内源性沉着物、病原微生物、内分泌物质、单种细胞和性染色质、骨、血液及造血组织、核酸、酶类等。特殊染色的命名：对于特染的命名至今尚无统一的规定，多数均按发明者的姓名命名，如van Geison 染色等；有的则按所用染色剂命名，如甲基绿一派若宁染色、苏丹Ⅲ染色等；有的按目的物命名，如网织纤维染色；还有的采用混合命名，如试剂十人名等。二、染色目的未加染色的任何组织切片在镜下只能辨认细胞和胞核的轮廓，看不清楚其他任何结构。染色的目的就是将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，将组织或细胞及其他异常成分染上不同深浅的颜色，便于在光学显微镜下进行观察。三、染色原理染色过程是染色剂和组织细胞相结合的过程。其机理尚未完全清楚。 1、有学者认为从物理学角度看，染色剂和组织细胞的结合是“溶解”或“吸收”。例如苏丹类染色剂使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在洒精等溶剂中的溶解度这一特性。有些染色剂是染色剂分子通过渗透和毛细血管作用而被吸收或沉淀到组织、细肋的小孔中去而着色的‘这种机制的染色是很少的。 2、另有学者认为染色是染色剂相组织、细胞之间的化学性结合。如显示含铁血黄素的普鲁士反应是最典型的例子。但是，大量染色的化学反应并不象铁反应那样明确。大多数染色的原理至今仍未搞清楚，有些可能是物理性的，有些可能是化学性的，有些则可能2种机制都起作用。正因为人们对染色的原理还没有完全掌握，所以还不能很好地运用原理来控制它，在相当程度上需凭工作经验。四、染色的分类 (一)普通染色最广泛应用于常规制片的苏木素和伊红染色，又称为常规染色。 (二)特殊染色

细菌形态学检查法(二)

细菌形态学检查法（二）三、染色标本的检查细菌标本经染色后，不仅能清晰地看到细菌的形态、大小及排列方式，还可根据染色结果将细菌进行分类。染色标本与周围环境在颜色上形成鲜明对比，可在普通光学显微镜下进行观察。一般形态学检查均需染色。 (一)常用染料用于细菌染色的染料，大部分是人工合成的含苯环的有机化合物，在其苯环上带有色基和助色基。色基赋予化合物颜色，助色基可增加色基与被染物的亲和力。助色基有的为碱性(如一NH2)，有的为酸性(如一OH)，因此助色基的性质决定染料的酸碱性。常用染料一般均难溶于水，易溶于有机溶剂，实验室配制时通常制成盐类水溶液。 1．碱性染料常用的碱性染料有碱性亚甲蓝、结晶紫及碱性复红等，这些染料电离后色基带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。多数细菌等电点(pI)在2～5之间，在中性、碱性以及弱酸性环境中都带负电荷，易被碱性染料着色，故细菌学检查中常用此类染料。 2．酸性染料常用的有伊红、酸性复红及刚果红等，这些染料电离后色基带负电荷，不易与细菌结合，不常用于细菌染色。必要时可降低菌液的pH，使细菌带正电荷，方可着色。 3．中性染料是碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染液中的伊红亚甲蓝、吉姆萨染液中的伊红天青等，可用于较特殊染色技术。 (二)常用的细菌染色法根据所用染料是一种还是多种，细菌染色法分为单染色法和复染色法。单染色法是用一种染料染色，细菌涂片染成同一颜色，可观察到形态、大小及排列等特点，但不能显示细菌染色特性。复染色法是用两种或两种以上染料进行染色，将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同颜色。复染色法不仅可以观察细菌的形态结构，还可根据染色反应鉴别细菌，故又称鉴别染色法。临床常用的主要有革兰染色和抗酸染色。革兰染色本法是细菌学检验中最经典、最常用的染色方法，沿用至今已有百余年历史，是一种包括初染、媒染、脱色和复染的鉴别染色技术。通过此染色法，可将细菌分为革兰阳性(G+)菌和革兰阴性(G—)菌两大类，并可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。有时结台细菌特殊形态结构及排列方式，对病原茵可做出初步鉴定。革兰染色的原理至今尚未完全清楚，有以下几种学说：①细胞壁学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，G—菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入；②等电

免疫荧光组织化学技术

免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述…………………………………………………… 二、免疫荧光组织化学的原理………………………………………………………………… （一）直接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗原方法…………………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… （二）间接方法…………………………………………………………………………… 1．检查抗体(夹心法)方法…………………………………………………………… 2．检查抗体方法…………………………………………………………………… 3．检查抗原法……………………………………………………………………… （三）补体法……………………………………………………………………………… 1．直接检查组织内免疫复合物方法……………………………………………… 2．间接检查组织内抗原方法……………………………………………………… （四）双重免疫荧光组织化学标记方法………………………………………………… （五）对照试验…………………………………………………………………………… 1．直接方法………………………………………………………………………… 2．间接方法………………………………………………………………………… 3．补体方法………………………………………………………………………… 三、荧光抗体的制备……………………………………………………………………………… （一）荧光素……………………………………………………………………………… 1．异硫氰酸荧光素………………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明………………………………………………………… 3．得克萨斯红(Texas red)…………………………………………………………… 4．其它荧光素………………………………………………………………………… （二）荧光素标记抗体的方法…………………………………………………………… 1．FITC标记抗体的方法…………………………………………………………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法…………………………………………… 3．藻红蛋白标记抗体方法…………………………………………………………… 4．蓝色荧光素标记抗体方法………………………………………………………… （三）荧光抗体的质量控制……………………………………………………………… 1．染色特异性和敏感性的测定方法………………………………………………… 2．F/P比值的测定方法……………………………………………………………… 3．荧光抗体的保存…………………………………………………………………… 四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………

酶组织化学和组织化学染色

第14章酶组织化学和组织化学染色酶酶是由细胞合成的生物催化剂，它们增加整个过程的反应速率，而自身的数量和特性不会改变。组织化学组织化学被Pearse定义为“用化学或物理的测试方法对细胞和组织中的特定物质、反应基团和酶催化物质进行鉴定、定位和定量的方法”。因此，采用化学方法技术将组织细胞中的物质进行定位，以用于显微观察的过程就是组织化学技术。酶组织化学技术酶组织化学技术是将免疫学和分子生物学相结合的一种组织学技术。组织中酶的表现与其他无活性组织成分完全不同，酶必须是具有活性的。而且，细胞内酶的表达主要取决于酶在活性位点的特定底物和形成不溶物质，这种不溶物质随后变成有色体或不透明体。组织必须尽可能新鲜才适合酶的表达，尸检组织/尸体解剖通常不适合用于研究。经处理不能被用于酶表达的组织要保存在冰箱中。对于大多数酶来说，它们的表达需要新鲜组织（如细胞培养物）或冷冻/晶体组织和冷冻干燥的组织切片，但是，一些酶如碱性磷酸酶或酸性磷酸酶对底物具有抵抗性，因此它们无法表达。定影液冰箱冷却丙酮，并用甲醛盐水或95％乙醇作为缓冲剂，在大多数情况下，冷丙酮用于酶的表达。酶组织化学原理组织化学方法是基于生化反应，含有酶的组织或细胞当置于溶液中时，它们与溶液发生化学反应，产生着色的不溶性产物，然后可以在细胞或组织中评估最终产品的位置和数量。经典组织化学反应通常遵循以下四个原则之一： *简单离子相互作用。 *醛与希夫试剂或银化合物的反应。 *芳香族重氮盐与芳香族残基的偶联。 *底物和酶的转化形成着色沉淀。酶的分类 *氧化还原酶：它是一个大组，由以下亚组组成： -氧化酶：在氧气存在下催化底物的氧化。 -脱氢酶：通过除去氢原子来催化底物的氧化。 -过氧化物酶：通过除去与过氧化氢结合的氢原子来催化底物氧化。 -Diaphoresis酶：通过除去氢原子来催化NADH和NADPH的氧化。 *水解酶：催化引入水中元素成为特定的底物键。 *转移酶：催化两种化合物基团的转移，但不利用也不损失水分。 *裂解酶：催化从底物中去除基团从而形成碳双键。脱羧酶是该组一个亚类。组织化学反应类型主要有四种类型：