细菌学常用染色技术

实验四细菌学常用染色技术

一、实验目的:

1、掌握油镜的使用技术；

2、学会细菌的简单染色法，革兰氏染色法，芽孢，荚膜染色法。

二、实验原理

1、油镜的基本原理:通过在载玻片上加一滴香柏油提高分辨率。

2、简单染色法的原理:简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

3、革兰氏染色法的原理：G+菌与G-菌时由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的，G-菌的细胞壁类脂多，而肽聚糖薄，细菌易被脱色，经复染后染成红色，而G+菌肽聚糖较厚经脱色后细菌仍为初染后的紫色。

4、芽孢染色法的原理:用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

5、荚膜染色法的原理:由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法（负染）染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。

三、实验器材：

1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、圆褐固氮菌

2、仪器材料：显微镜、载玻片、盖玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、试管、接种环

3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、路哥尔氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、5%孔雀绿染液、黑色素

四、实验内容步骤：

1、革兰氏染色法：

①涂片：滴一滴无菌水到载玻片上，用接种环在酒精灯此案各挑取一环金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，均匀涂于载玻片上

②固定：涂片在火焰上方干燥（不烫手为宜）

③染色：加草酸结晶紫染液染2min，用水冲洗，滴加路哥式碘液1min，水洗，滴加95%乙醇，紫色去除后用水洗去，滴加番红染液2min，用吸水纸吸干。

④镜检：用油镜观察。

2、芽孢染色法：

①制备菌液：加一滴水于小试管，用接种环取2-3环枯草芽孢杆菌到小试管中打匀，制成浓稠菌液。

②加3滴5%孔雀绿染色液三滴，试管沸水浴加热20min

③涂片：用接种环取菌液涂于载玻片上

④固定：用火焰将菌液干燥

⑤脱色：水洗脱色，水中无孔雀绿为止

⑥复染：加番红染液3min，去染色液，用吸水纸吸干

⑦镜检

3、荚膜染色法：

①制菌液：滴一滴黑色素于洁净的玻片上，挑取圆褐固氮菌与其混匀

②加盖玻片并在油镜下观察

五、报告要求

1、绘图并说明大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形状、颜色和革兰氏染色反应。

2、绘图表示枯草芽孢杆菌的形态，注意芽孢的形状、位置及芽孢囊的形状特征。

3、绘图表示圆褐固氮菌菌体和荚膜的形态。

实验结果分析：

1.革兰氏染色中，对三区分配不太明显，最开始的两滴水的距离较近。还有可能使在染色和洗片的过程中，将一端的菌样冲到另一边，使两菌样混合。最终的染色效果不错，能良好的区分革兰氏阴性和阳性菌。

2.对芽孢的染色中实验结果很好，能清楚地观察到芽孢和菌体的不同颜色和位置。

3.对圆褐固氮菌荚膜的染色中，菌体的黑色不明显，似乎整个细菌都是透明的，效果不是很好。里面有气泡。

思考题

1、使用油镜应特别注意什么？为什么要求制片完全干燥以后才可以使用油镜观察？

答：①应先用低倍镜下找到物象，再转换为油镜；②加香柏油时切勿加多，下降镜筒使油镜浸入香柏油中；

③各个镜面切忌用手涂抹，以免手上的油、汗沾于镜面，否则日后易发霉，腐蚀；④用二甲苯擦镜头时，用量要少，不宜久抹，以防胶粘透镜的树脂被溶解；⑤油镜工作距离甚短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼睛对这目镜边观察边下降镜筒，由于直接在玻片上滴加香柏油，当制片时未完全干燥时，水与香柏油不互溶，影响观察。

2、革兰氏染色中，那一步可以去除而不影响最终结果？为什么？

答：复染这一步可以去除而不影响最终结果，因为G+菌肽聚糖较厚，交联度高，类脂含量少，脱色后仍保持原初染的紫色，而G-菌肽聚糖薄，脱色后原有颜色失去，若不经过复染则保持无色，因此去除复染后，紫色为G+菌，无色或无法染色为G-菌。

3、如果涂片中观察到大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为是什么原因？

答：a.由于芽孢的壁厚，耐压力比细胞体强。因此有可能是由于在图片是用力过大，将细胞体的细胞壁压碎，从而使芽孢脱落出来的缘故。b.也有可能是由于菌体培养时间过久，芽胞正处于复苏阶段，所以大多芽孢都从饱囊中游离出来。