人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科
安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生
[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养
C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001
[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.
[Key words] Endot helial cells;Culture
我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
材料与方法
一、材料与培养用液的配制
CK 型倒置显微镜(日本Olympus Tokyo 公司),流式细胞仪(Coulter 公司),BB 5060型CO 2培养箱(美国Heraeus),Cryfuge500S 型低温离心机,胎牛血清(FBS,100ml/瓶,H yclone 公司),人血管内皮生长因子(VEGF,10 g/支,Pepro Tech 公司),CD31PE 购自Becton Dickison 公司(编号:340297)。
培养用液:(1)PBS 液:Nacl 8.5g 、Kcl 0.2g 、NaH 2PO 4H 2O 2g 、KH 2PO 40.2g 溶于1000三蒸水中,120!灭菌20m in,分装备用。(2)胶原酶(Gibco
公司,10mg/支)和胰蛋白酶(上海华美公司)分别溶于100ml PBS 中,浓度分别为0.1%和0.25%,抽滤消毒备用。(3)DMEM 培养基(购自BRL-Gibco 生命技术公司):按照说明书操作,将一袋干粉溶于1000ml 三蒸水中,抽滤消毒,加入胎牛血清终浓度为10%,4!贮存备用。
二、方法
1.内皮细胞原代培养:无菌获取新生儿脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,再用PBS 液冲净脐静脉内血迹。将脐带一端用丝线结扎固定,用注射器向脐静脉另一端内注满0.1%胶原酶液,止血钳钳夹后放入水浴锅内孵育15min 。取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中,再用PBS 液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中,1000rpm ?8min 。弃去上清液,转移至35cm 2
培养瓶(Falcon 公司)中,加入DM EM 培养液(内含10%胎牛血清,青霉
素100U/ml、链霉素100 g/ml,VEGF20ng/ml), 5%CO2、37!条件下培养,24h后换液1次,以后每2 ~3d换液1次。
2.传代培养:原代培养内皮细胞80%以上汇合时,倾去培养液后用DM EM培养液冲洗,然后加入0. 25%胰蛋白酶消化,在倒置显微镜下观察见细胞皱缩、彼此分离或出现大片状分离即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化,并用吸管反复吹打瓶壁制成细胞悬液,计数后按105个/ml分装成瓶继续培养。
3.血管内皮细胞的鉴定
(1)倒置显微镜下观察细胞形态并摄片,待培养细胞将近汇合时,更换新鲜培养液摄片。
(2)流式细胞术:待细胞长满单层后,以胰蛋白酶消化并反复吹打制成单细胞悬液,离心后去上清液,再用PBS液洗涤2次以排除培养液可能的干扰。加入CD31PE20 l,充分摇匀,闭光孵育30min。结合多抗的细胞加入FIT C标记的羊抗鼠多克隆稀释抗体,闭光15min后立即行流式细胞术分析,结果以荧光图表示。设阴性对照组,不加一抗,其余操作相同。FM 术检测vWF因子与CD31相似,一抗为抗人vWF抗体。
结 果
一、倒置显微镜观察 原代细胞接种12h后开始贴壁,24h后大部分贴壁生长。早期细胞球形、椭圆形及团块状,仅少数细胞伸展,48~72h后生长最快、变成梭形。5~7d后融合,呈现典型的镶嵌状卵石样排列。传代细胞的形态变化及生长方式与原代培
养细胞类似,汇合后细胞也呈卵石样排列(见图1)
。
图1 培养细胞倒置显微镜观察 二、流式细胞术鉴定内皮细胞 与对照相比,细胞表面的CD31表达荧光强度相似,表明培养细胞也有CD31表型存在。vWF因子的荧光强度与对照相比无明显的差异,进一步说明培养细胞为血管内皮细胞(见图2)。
anti PECA M(CD31) anti vWF
图2 培养细胞CD31和vWF因子荧光密度表达
讨 论
新生儿脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源,具有取材方便、操作简单易掌握、获得细胞多等优点,能够很好的满足基础和临床研究的需要。国外Jaffe等人于1973年培养人脐静脉内皮细胞获得成功,我们则主要参考张宝庚等人的方法也培养成功,并通过细胞形态学、细胞生长特性、细胞表型和特异性分泌抗原证实。
血管内皮细胞的贴壁生长受诸多因素的影响,首先,是脐带离体时间的影响。王建明等[1]人的研究表明,随时间延长离体脐带内皮细胞某些物质的含量会发生变化,6h至12h内皮细胞V因子相关抗原、前列环素呈下降趋势,程满根等[2]人研究表明脐带离体3h内内皮细胞存活率达90%,离体24h仅有50%存活。一般实验时取足月分娩新生儿脐带,经简单的去除血迹等处理即进行消化培养。其次,在内皮细胞获取方法上有:(1)离心分离法,主要用于血细胞等的分离。(2)机械分散法,如Priebe等[3]使用带有尼龙筛的分离管刮取内皮获得细胞,体外培养成功。(3)消化分离法,如胰蛋白酶、胶原酶及EDTA进行消化,一般很少混杂平滑肌细胞和成纤维细胞,我们应用胶原酶 获取足够内皮细胞,并且未见细胞污染。第三,培
养基质的影响,进口培养瓶因加入促细胞贴壁物质利于细胞生长而广泛应用,我们选用Falcon公司35cm2培养瓶效果满意。同时预先于瓶底面铺加0.1%明胶蛋白(gelatin),它是一种变性胶原,具有良好的亲合性,能与许多细胞自然配位结合使细胞更容易贴壁生长,且具有很好的光学性质便于观察。第四,培养液的影响,常用培养基DM EM、RPM I1640及M199均可用于内皮细胞的培养,但是必需加入血清,细胞才能更好地生长。因为,血清含有供细胞生存所必需的生长调节因子,为培养液提供良好的缓冲系统,利于细胞贴壁和铺展等特殊作用,是一种优良的天然培养基。实验中,我们加入10%胎牛血清(fetal bovine serum),从而使细胞在体外良好生长。第五,传代对H UVEC产生很大影响,有人检测出随着培养代数的增加,细胞形态和功能发生明显的变化,传代2个月后不仅出现较多的#巨细胞?,细胞群稀疏,透光度下降,最后死亡,而且在功能上分泌前列环素和vWF因子的功能逐渐下降、直至消失[4]。另外,HU VEC的传代较困难,一般仅能传2~3代,为此我们于培养液中加入血管内皮生长因子(VEGF),后者对血管内皮具有特异的促有丝分裂作用,有利于多次传代培养。第六,细菌、霉菌和支原体污染培养物也较常见,使培养细胞生理、生化、遗传学等方面发生变化,只能废弃。对于细菌、霉菌和支原体污染,培养基中预防性的加入青霉素、链霉素和二性霉素,而支原体污染迄今尚无行之有效的方法。至于杂细胞污染,因为采用较温和的胶原酶消化,基本上无平滑肌和成纤维细胞的污染,红细胞和单核细胞不能传代也将随细胞传代而去除。
Jaffe和Gimbrone曾提出HUVEC的鉴定标准[5,6]:(1)相差显微镜下细胞多角形、单层铺路石样排列,这是因为内皮细胞具有群体依赖性(population dependence)并有接触抑制(contact inhibition)的特性,体外培养条件下为贴壁依赖性细胞(anchorage-de pendent cell)。(2)电镜下胞浆内有Weibel-Palade小体。(3)细胞内V相关抗原vWF因子存在。vWF 因子为内皮细胞特异分泌的糖蛋白,贮存于Weibel-Palade小体内,为正常人血浆中因子的重要组分之一,因为并非每一细胞均可检测Weibel-Palade小体存在,且电镜标本制作较困难,我们仅检测vWF因子,并运用流式细胞仪检测CD31的表达。后者为与血管相关性细胞黏附/信号分子,表达于血小板、单核细胞尤其是内皮细胞连接处,为近年来发现的内皮特异标志物,可以用来从其它组织中分选纯化内皮细胞[7]。
参考文献
1 王建明.正常脐静脉离体后不同时间内皮某些物含量的变
化.第三军医大学学报,1995;17(1):86
2 程满根.血管内皮细胞单克隆抗体研究.国外医学 生理、
病理科学与临床分册,1989;10(3):138~141
3 Piebe M,Paulsen F,Jalnke T,et al.M echanical brush-
catheter abr asion method for the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.Firstin v itro results.2001;173
(10):955~958
4 何宏兵,潘玉先.人脐静脉内皮细胞体外培养20天左右是
进行有关研究的较佳时期.中国病理生理杂志,1992;8(5): 447
5 Jaffe EA.Culture of human endothelial cells der ived from um
bilical veins.Identification by mor phological cr iter ia.J Cell Bi o l,1973;52:2745
6 G imbrone M A.Human v ascular endo thelial cells in culture,
grow th and DN A synthesi s.J Cell Biol,1974;60:673
7 St Crix B,R ago C,V elculescu V,et al.Gene expressed in
human tumor endothelium.Sience,2000;289(5482):1197~ 1202
(2003 04 21收稿)
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人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科 安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生) 人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生 [摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。 [关键词] 内皮细胞;培养 C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001 [Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient. [Key words] Endot helial cells;Culture 我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。 材料与方法 一、材料与培养用液的配制 CK 型倒置显微镜(日本Olympus Tokyo 公司),流式细胞仪(Coulter 公司),BB 5060型CO 2培养箱(美国Heraeus),Cryfuge500S 型低温离心机,胎牛血清(FBS,100ml/瓶,H yclone 公司),人血管内皮生长因子(VEGF,10 g/支,Pepro Tech 公司),CD31PE 购自Becton Dickison 公司(编号:340297)。 培养用液:(1)PBS 液:Nacl 8.5g 、Kcl 0.2g 、NaH 2PO 4H 2O 2g 、KH 2PO 40.2g 溶于1000三蒸水中,120!灭菌20m in,分装备用。(2)胶原酶(Gibco 公司,10mg/支)和胰蛋白酶(上海华美公司)分别溶于100ml PBS 中,浓度分别为0.1%和0.25%,抽滤消毒备用。(3)DMEM 培养基(购自BRL-Gibco 生命技术公司):按照说明书操作,将一袋干粉溶于1000ml 三蒸水中,抽滤消毒,加入胎牛血清终浓度为10%,4!贮存备用。 二、方法 1.内皮细胞原代培养:无菌获取新生儿脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,再用PBS 液冲净脐静脉内血迹。将脐带一端用丝线结扎固定,用注射器向脐静脉另一端内注满0.1%胶原酶液,止血钳钳夹后放入水浴锅内孵育15min 。取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中,再用PBS 液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中,1000rpm ?8min 。弃去上清液,转移至35cm 2 培养瓶(Falcon 公司)中,加入DM EM 培养液(内含10%胎牛血清,青霉
小胶质细胞培养及鉴定
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
血管内皮细胞体外培养(赵)
血管内皮细胞体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。 c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。 d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。 e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。 f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。 2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养 1.将15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的PBS 溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24 小时，室温下不超过6 小时，否则废弃） 2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS 溶液冲洗3-5 次，将污 血冲洗干净为止。 3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15m l的胶原酶（1m g/ml）室温下消化15-20 分钟，并不时上下摇动脐带。 4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 m l无菌离心管中，用无 菌的PBS 溶液冲洗脐带2-3 次。 5.将收集液离心（2000 转/分）3 分钟。 6.倒去上清，加入10m l M199培养基（加入10U/m l的bF G F），用弯管吹散细 胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。 （注：每个培养瓶中加入3-4ml 无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。） 7.培养24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS 溶液清洗2-3 次，洗掉红细 胞和死细胞，加入10 m l新鲜的M199培养基。 8.以后每2 天换一次培养基（每次换掉2/3 的培养基）。 9.一般培养5-7 天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。 10.倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3 次，加入2-3m l消化液（0.25%胰酶 +0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3 倍的——————————————————————————————————————————————
血管内皮细胞培养
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定.
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定 作者：秦明春，王若光，秦莉花，刘小丽，李春梅，刘惠萍，叶赞 【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液, 一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。 【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定 Cultivation and in vitro identification of endothelial cells from human umbilical vein 〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕Ｏｂｊｅｃｔｉｖ ｅTo explore the primary culture method of human vascular endothelial cells(ECs) from umbilical vein, enhance the succes s rate of separating and culturing ECs in vitro, establish the model of human vascular ECs, and provide an experimental method for research of ECs. Methods The umbilical veins in human umbilical cords, 20 cm long, were fixed and filled the digestive fluids, 0.2% collagenenaseⅡin one cord and t he complex enzyme of 0.25% trypsin and 0.1% collagenaseⅠin an other, and the digestive results were compared. All the cells were collected and cultured in fluid with 10 mg/mL VE GF, their procreation and generation were observed, the morph ologic characteristics of ECs were observed with light micros copy and immunohistochemistry under inverted microscope, and t he cell cycle was observed by flow cytometer. Results Enough
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
细胞培养与细胞生死状态的鉴别
姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳 科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红 【实验步骤】
人脐静脉血管内皮细胞
HUVEC 人脐静脉血管内皮细胞General Information: Culture Method:
具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系， 时和我们联系武汉普诺赛生命科技有限公司 全国免费服务电话：400-650-3656 邮箱：techsupport@https://www.360docs.net/doc/078557066.html, sales@https://www.360docs.net/doc/078557066.html, 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象 发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需 细胞因子等，确保细胞培养条件一致。若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。 3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量 从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及 4. 静置细胞贴壁后，请将细胞瓶内的培养基倒出，留6~8mL 维持细胞正常培养，待细胞 汇合度90%左右时正常传代。 5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传 代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。 6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部 沟通交流 告知细胞的
内皮细胞的培养
内皮细胞的培养 内皮细胞，用高倍镜观察肠系膜上的毛细血管，可见到内皮细胞，内皮细胞较间皮细胞小，排列紧密。内皮细胞或血管内皮是一薄层的专门上皮细胞，由一层扁平细胞所组成，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。血管内皮细胞（EC）位于血液与血管组织之间，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，并且能合成和分泌多种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。抗凝血材料表面内皮细胞化，可以减少血栓的形成和血小板激活。 下面以脐带静脉为例介绍内皮细胞的培养： 一、试剂准备： （1）脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL/L、100 U/ml青霉素一100 U/m1链霉素。（2）组织消化液：0．1％I型胶原酶和0．05％胰酶-0．02％乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液。 （3）内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素-100 U／m1链霉素的M199培养基。 （4）器皿：0．2％明胶包被：用PBS配制。 二、原代提取 （1）脐带处理：在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。 （2）脐静脉处理：用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止。 （3）组织消化：将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。 （4）收集细胞：用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10 ml离心管， （5）离心培养：1 000 r／min离心10 min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10 min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中，置于37℃5％C02饱和湿度培养箱中培养，24 h 后更换培养液，以后每隔2 d换液1次。
组织细胞培养技术课程教学大纲
《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码：26990214 课程名称：组织细胞培养技术 英文名称：Cell and tissue culture technology 开课学期：第二学期 授课对象：统招硕士 开课院系：基础医学院 开课教研室：病理学与法医学教研室 学时：40 （其中理论学时：20 实验学时：20 ） 学分：0.5 课程类型：公共选修课（公共必修课/选修课/专业课） 选用教材：自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书：⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京：人民军医出版社，2000。 大纲编写人员：张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法，被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一，在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术，及其在医学研究和临床实践中的应用，该领域的研究历史和最新发展动态；转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构，掌握现代生物技术中的基本实验技能，培养学生开拓创新的能力，适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法，简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程，了解各种操作的基本原理；有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识，了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展，了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用，并能自行根据需要设计实验，运用所学技术解决科研中的实际问题，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识（4.5学时） 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念；了解对组织培养的评价；熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化；掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态；熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。
人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定
人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、 冻存、复苏及鉴定 1人脐静脉内皮细胞的分离及培养 1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养 在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。 1.1.1胰蛋白酶消化法 在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1mL细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。 1.1.2胶原酶消化法 在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液
初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。取明胶包被的六孔细胞培养板，吸去明胶，每孔加入内皮细胞悬液2.5mL，置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中静置培养，24 h后更换培养液以除去未贴壁的细胞。然后每隔3d换液1次至生长汇合。 1.2 传代内皮细胞的培养 原代内皮细胞融合后用培养液冲洗2次，然后用0.25%胰酶和0.25%乙二胺四乙酸以1：1的比例充分混匀后加入到内皮细胞中，每孔0.3 mL。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞出现皱缩、边缘略变圆、彼此分离或呈大片状分离，此时即可吸弃消化液终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，用吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按10个细胞/mL，并置于5% CO2饱和度的37℃孵箱中继续静置培养。每隔2~3d换液1次。 1.3 人脐静脉内皮细胞的冷冻和复苏 传代细胞贴壁80%后0.25%胰酶消化，离心1200 r/min，5min，弃上清，加入冻存液(含10%甘油、90%细胞外基质)重悬后置4℃30 min，-20℃2 h，-80℃过夜后置入液氮中保存。复苏时在37.2℃水浴中迅速轻摇解冻，胎盘蓝染色，计算细胞存活率。 1.4 影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素 影响脐静脉内皮细胞体外生长的因素包括： 1培养液的pH值。最适pH值为7.0~7.2，脐静脉内皮细胞耐酶不耐碱，pH 值为7.4时贴壁困难，pH值7.6以上贴壁细胞脱落受损失去活力。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定
大鼠肺微血管内皮细胞培养及鉴定* 谢 崧 杨晓静 钱桂生 王关嵩 (第三军医大学新桥医院, 重庆 630037) 摘要 取大鼠周边肺组织进行肺微血管内皮细胞培养。将肺组织切成小块,用含有20%新生牛血清、肝素90L g/ ml、L-谷胺酰胺4mmol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/m l的R PM I-1640培养基培养。血细胞立即从肺组织周围游出。继而是肺微血管内皮细胞。成纤维细胞及其他细胞72h才游出。培养60h后取出肺组织块,培养瓶中只有微血管内皮细胞和血细胞。后者可通过传代除去。获得的肺微血管内皮细胞具有规律的鹅卵石样形态和对异植物血凝素结合试验及八因子相关抗原免疫荧光染色均阳性。 关键词 大鼠 肺循环 微循环 内皮细胞 细胞培养 肺微血管在生理和病理情况下都起着重要作用,如与成人呼吸窘迫综合征、肺动脉高压[1]等的发生有关。目前仅限于肺动脉内皮细胞的研究,而肺微血管和大血管之间据文献报道在表型和功能有着显著的不同[2]。故有培养和研究肺微血管内皮细胞的必要。 虽然肺有大量的血管内皮细胞,但同时存在40多种类型的细胞尤其成纤维细胞和平滑肌等细胞的迅速生长,使内皮细胞生长受抑制。分离和培养纯的肺微血管内皮细胞较为困难。国内未见肺微血管内皮细胞培养的报道。本文采用简单的方法成功地分离和培养出大鼠肺微血管内皮细胞。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 RPM I-1640培养基为美国Gibco 公司产品。新生牛血清由华西医科大学公共卫生学院生产。兔抗人八因子相关抗原抗血清为DAKO公司产品,华美分装。荧光标记异植物血凝素为Sigm a 公司产品。荧光标记羊抗兔1gG由卫生部上海生物制品研究所生产。抗菌素为青霉素钠盐和硫酸链霉素。L-谷氨酰胺为第二军医大学分装。胰蛋白酶和肝素钠均为上海生化试剂商店提供。大鼠肺动脉内皮细胞按本研究所建立的方法[3]培养。 1.2 取材 选重200-300g健康雄性Wistar大鼠,10%乌拉坦(10L l/mg)腹腔麻醉。颈动脉放血后,将整个大鼠泡于75%酒精中2-3s,以后用组织剪逐层剪开胸腔。切下心肺放入盛有含青霉素200U/m、链霉素200L g/ml和Hanks液的三角烧瓶内备用。 1.3 大鼠肺微血管内皮细胞培养 大鼠肺微血管内皮细胞原代培养:将盛有心肺组织的无菌三角烧瓶置于超净台,抗生素Hanks液冲洗心肺组织的血迹。眼科剪剪去肺组织表面的脏层胸膜,剪取胸膜下肺组织(厚度不应大于1.5mm)。并将肺组织用锋利的手术刀切成1.5×1×1mm3大小的组织块。贴入无菌的25cm2培养瓶(1%明胶预置过夜,4℃,用前2h移入CO2培养箱,培养液冲洗)中进行培养。每瓶贴10块,置培养箱固化2h后,加入含20%新生牛血清、肝素90U/m l、L-谷氨酰胺4mm ol、青霉素100U/ml和链霉素100L g/ml的RPM I-1640培养基3m l,放入培养箱中培养。60h后将肺组织块取出。继续培养7-10d,细胞汇合成单层细胞。肺组织贴瓶后3d换液,以后每两天换液一次,每次均换1/2。 大鼠肺微血管内皮细胞传代培养: 将长成单层的原代细胞用0.08%胰蛋白酶进行消化,每瓶加入1ml,置常温5m in左右。镜下观察,当细胞间连接疏松时立即倒出消化液,加入培养基3ml,用吸管吹打使细胞脱落并充分混匀,吸出0.1m l计数,得出细胞总数后,将含细胞的培养液稀释成(2.5-3.0)×105个细胞/ml的接种浓度。每25cm2培养瓶接种3ml细胞悬液,与肺微血管内皮细胞相混的血细胞就通过传代除去了。 1.4 肺微血管内皮细胞的鉴定 制片: 如同细胞传代将细胞消化成细胞悬液。再以800rpm离心5min除去含血清的培养液。向沉降的细胞中加少许Hanks液,用吸管轻轻吹打漂洗后,取少许细胞悬液薄涂于玻片上。用吸水纸吸干后甲醇固定5-10min取出备用。 189 中国应用生理学杂志1997;13(2) X1996-9-20收稿 1997-2-6修回