系统发育分析

实习四: 系统发育分析－PHYLIP, MEGA, MrBayes

实习目的

1. 学会使用PHYLIP，MEGA和MrBayes构建进化树

2. 学会分析建树结果，体会各种方法差异

实习内容：

一、PHYLIP

PHYLIP网址： https://www.360docs.net/doc/0918033264.html,/PHYLIP.html

PHYLIP是一个免费的系统发育树构建软件，它的功能比较全面，可用距离法、最大简约法和最大似然法分别进行建树，还可以对进化树可靠性进行检验。PHYLIP没有多序列比对功能，所以先要用其它序列比对软件完成序列比对，并保存为phy格式后，才可提交给PHYLIP 进行分析。

1.1 比对序列的准备

1．将教学材料里demo sequence.zip文件解压到D盘根目录下，分别用其中的mRNA和protein序列学习进化树构建。首先我们用实习2学过的多序列比对软件对序列进行比对。

这里以CLUSTAX为例来说明。

强烈建议：将你的所有同源核酸（或蛋白质）序列存到一个文本文档里，将”>”之后那行只保留物种名称，或物种名称_蛋白（或基因）名称，方便后面分析比较。

2．用CLUSTALX进行多条序列比对，在Alignment - output format option选中PHYLIP 格式，对序列进行比对（Alignment - Do complete alignment）。将生成的phy文件保存，此文件可以用写字板打开浏览，里面内容是多条序列比对结果。（Figure 1.1）

Figure 1.1 用clustalx进行多条序列比对及生成的phy文件

3．双击解压PHYLIP-3.69.zip文件，得到三个文件夹，其中doc文件夹里是关于所有PHYLIP 子程序的使用说明，exe文件夹里是直接可以使用的可执行程序，src文件夹里是所有程序的源代码。

4．打开PHYLIP的exe文件夹，将上步保存的phy文件复制到exe文件夹中。

5．上课时我们是先将序列用某种方法建树后，然后做bootstrap检验，看树的可靠性。但

一般情况下用你的序列直接构建出来的树与伪样本建出来的一致树（consensus tree）是非常相似的，所以这里我们先做bootstrap，直接用伪样本建树。

6．双击SEQBOOT子程序（SEQBOOT是一个利用bootstrap方法产生伪样本的程序），所有PHYLIP子程序默认的输入文件名为infile, 输出文件名为outfile。如果在exe 文件夹里找不到默认的输入文件，会提示can’t find input file “infile”。 输入刚刚生成的phy文件名，点击回车。（Tip: 如果你的phy文件不在exe文件夹中，需要输入phy文件的完整路径；或者你也可以直接把phy文件拖到这个程序窗口里来。）

Figure 1.2 seqboot程序起始界面

7．进入程序参数选择页面（Figure 1.3）。第一列中的D、J、%、B、R、W、C、S等代表可选的参数。想改变哪个参数，就键入此参数对应的字母，并点击回车键，对应参数将会发生改变。当我们设置好所有参数后，（这里我们可以不做任何修改），键入Y表示接受所有参数，按回车。此时程序询问“random number seed? ”，这是询问随机抽列产生伪样本时，生成随机数的种子是多少，输入一个（4N+1）的数即可（如5，9，13等），点击回车程序开始运行，输出结果到文件outfile，保存在当前exe文件夹里。.

Figure 1.3 seqboot程序参数选择页面

主要参数解释：

D：数据类型，有Molecular sequence（分子序列）、discrete morphology（离散表型）、restriction sites（限制酶切位点）和gene frequencies （基因频率）4个选项。

J：伪样本产生方法，有Bootstrap, Jackknife（打乱一半位点）, Permute（打乱每个位点的物种次序）和rewrite（将phy文件转变为其它格式）4个选项。

B：自举法窗口大小选择，默认为1，也可任意设定。

R：产生伪样本的数目，默认100个。

W：输入文件为字符还是权重，我们是比对结果，所以是字符。

S：输出文件为字符数据还是权重，与输入要保持一致。

I：phy文件格式是顺序的（sequential）还是分块的(interleaved)。

Tip: 如果用MUSCLE进行多序列比对，在命令中加入参数 –phyl，(example: muscle –in mrna.txt –out mrna.out –phyl) 即可生成phy格式的比对结果。在用SEQBOOT读入序列时，将I参数改为No，即可读入结果，进行伪样本的构建。后面用到其它程序分析的时候，都要将I参数改为No。

Figure 1.4 seqboot程序运行过程页面

程序默认产生100个伪样本，点击回车关闭seqboot程序后，将outfile更名为seqb, 用写字板打开seqb，可以看到里面是100套多条序列比对结果。（Figure 1.5） 注意：实习指导里每一步都将outfile和outtree的重命名，重命名的文件名是为了方便各位识别哪个文件由哪个程序产生，不是必须这样命名，你完全可以按照你的习惯进行重命名。

Figure 1.5 seqboot运行后输出文件内容

1.2 最大简约法建树（Maximum Parsimony）

PHYLIP中对核酸序列进行最大简约法建树的程序有两个，DNAPARS和DNAPENNY，其中DNAPARS在搜索最优树时采用的是启发式算法，而DNAPENNY是完全算法，所以前者不能保证得到最优树，而后者可以，但后者运行所需时间也相应要长。我们这里介绍如何用DNAPARS建树。

1. 打开DNAPARS（PROTPARS如果序列是蛋白质），将刚才生成的seqb文件名输入。（Figure 1.6）如果上一步输出的outfile文件你忘了更名，将会有警告，询问你如何处理已存在的outfile，是用新生成的文件替换掉R，还是在原文件后面续写A，或结果输出到另一个文件F或退出程序Q。所以一定记得重命名每步新生成的outfile和outtree。

Figure 1.6 DNAPARS程序起始页面

2.因为我们前面用seqboot生成了100个伪样本，所以要改M参数为分析多个数据 (multiple data sets，Figure 1.7），输入M回车，程序会提问是分析多个数据还是多个权重？输入D（数据），程序提问有多少个数据要分析？输入你在SEQBOOT里生成的replicate的数目100。程序会再要求输入一个随机数种子（random number seed），作为打乱输入序列次序的随机数种子，同样给一个4N+1的数，然后输入打乱序列次序的次数，一般10次就可以了。打乱输入序列的次序，是为了得到不受输入序列次序影响，更可靠的系统发育树，每打乱一次，建树就要多花1倍的时间。

Figure 1.7 DNAPARS程序参数选择页面

主要参数解释：

U：是否自动寻找自佳树，还是利用使用者所提供的树

S：寻找最佳树的搜寻方式，more thorough（运行时间较长）或 less thorough（运行时间较短）

V：保存多少个树 number of trees to save （当最优树不止一个的时候）

J：是否更改输入序列的次序，由于输入序列的次序有时会影响分析结果，可以打乱输入序列次序以得到更可靠的结果。如果选是，会要求输入一个4N+1的数做种子，然后询问打乱次数，一般打乱10次以上会提高结果的可靠性。

O：外群位置，默认不设外群，可以更改为任意一条序列。

T：每个位点进化步骤（替换次数）是否要设定阈值，如果设置了阈值，当实际进化步骤大于

阈值时，忽略多出部分。目的是平衡各位点对于建树结果的影响。

N：转换和颠换是否全部计算在内。

W：位点之间是否权重不同

M：是否分析多个数据。由于我们第一步seqboot产生了100个伪样本，每一步都要更改这个参数。

参数0-4都是关于显示方面的选择。

5：是否推断节点（node）上的祖先序列。

6：是否将建好的树写入树文件。

点击回车键，程序运行。将生成两个文件outfile和outtree，将outfile更名为mpfile，将outtree更名为mptree。用写字板打开mpfile（Figure 1.8），用TREEVIEW打开mptree(Figure 1.9)后，可以看到这两个文件都含有100个进化树。Figure1.9显示共有101棵树，这是因为有时会生成不止1个最大简约树。

Figure 1.8 outfile（更名为mpfile）用写字板打开

Figure 1.9 outtree（更名为mptree）用treeview打开

3.打开CONSENSE（将多个伪样本建成的进化树，根据majority原则，得出一致

树）软件，将刚才生成的mptree文件输入。生成两个文件outfile和outtree。Outfile 可用记事本打开，outtree可用TREEVIEW打开，两个文件是最后得到的一致树。将两个文件更名为cmpfile和cmptree。至此我们采用MP方法，并使用bootstrap检验，得到了最优树。

Figure 1.10 CONSENSE软件界面

参数C是选择构建一致树的方法，Strict consensus只将在所有树中完全相同的部分显示在一致树中；MR, MRe and M1 产生的都是根据多数原则产生一致树。默认的MRe方法将在50%以上自举树中出现的分枝列入一致树；M1允许使用者指定一致性百分阈值。

参数O是询问是否设定外群，和将哪条序列定为外群，默认是不设定的。参数R是选择输出有根树还是无根树，默认为无根树。

用写字板打开cmpfile，（Figure 1.11）首先给出了输入序列的次序，注意，这里zebrafish 是第一条序列。接下来是一致树上采用了的branch pattern的总结。左边一列是branch pattern图示，用 dot(.)和 star(*)表示，dot (.) 代表这个物种不出现在这枝上，*代表这个物种出现在这枝上。 . 和 * 出现的次序就是上面的物种次序，第一行前2个物种是.，中间两个是*，后面3个是.，意思是说物种3（rat）和4(mouse)聚为一枝。右边这列是这种branch pattern的支持率，第一行支持率为100%，说明101棵自举树都把物种3和4聚为一枝。特别要注意的是，PHYLIP在不设外群的时候，总是把第一个物种，这里是zebrafish，放在最外层，也就是右边一致树最下面那枝，这并不是说这个物种离其它物种最远，只是这

个软件的设置。所以在分析不同方法的结果时，用treeview找开树文件后，用unrooted tree (radiation)来看比较不容易出错。

Figure 1.11 cmpfile用写字板打开

1.3 距离法建树(Distance Method)

1.3.1 距离矩阵计算

首先利用DNADIST(PROTDIST)软件计算两两序列的距离，得到距离矩阵用于下一步分析。将刚才生成的seqb文件输入，更改M参数为分析多个数据，运行后生成文件outfile。（Figure 1.12）该文件同样包含了100个replicate，只不过每个伪样本是以两两序列的进化距离来表示，将outfile改名为dnadist或者protdist。（Figure 1.13）

Figure 1.12 DNADIST程序界面

核酸序列距离的计算有四种模型（参数D），JC单参数模型，Kimura双参数模型，这两个模型都假定四种核苷酸含量均等，F84与Kimura模型相似，但核苷酸含量不平衡。当序列间含量差异较大时，可选择Logdet距离模型。 对于蛋白质序列，有五种进化模型可供选择， JTT (Jones-Taylor-Thornton 1992年数据), PAM (Dayhoff), PMB（以Blocks数据库保守模拟为基础构建）, Kimura（纠正了多次替换）以及 categories（Felsenstein提出的模型）

参数G设定各位点的替换速率相同的，还是否呈gamma分布。如果设定符合gamma 分布，程序随后会问gamma分布相关参数的值。参数T设定转换和颠换的比值。C参数允许使用者将位点进行分类，不同类别不同替换速率。参数F是询问是使用输入DNA序列的4种核苷酸含量计算距离，还是指定各种核苷酸含量。

Figure 1.13 用DNADIST程序计算出来的序列两两之间的距离

1.3.2 NJ方法

1．执行NEIGHBOR软件，这个软件包括了NJ和UPGMA两种建树方法。将上一步生成的dnadist(或protdist)输入，程序默认利用NJ方法建树，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree。将其分别更名为njfile和njtree。用记事本和TREEVIEW打开后，可以看到这两个文件都含有100个进化树。（Figure 1.14）

Figure 1.14 Neighbor程序界面

N参数选择使用NJ法还是UPGMA方法建树。L和R参数设定读入距离矩阵的左下方还是右上方。

2．将njtree文件输入CONSENSE软件，得到两个文件outfile和outtree。Outfile 可用记事本打开，Outtree可用TREEVIEW打开。将两个文件更名为cnjfile和cnjtree。

至此我们采用NJ方法，并使用bootstrap检验，得到了最优树。

1.3.3 UPGMA方法

1.执行NEIGHBOR软件，将dnadist(或protdist)输入，更改N，选择UPGMA方

法建树，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree。将其分别更名为upgmafile和upgmatree。用记事本和TREEVIEW打开后，可以看到这两个文件都含有100个进化树。

2.再将upgmatree文件输入CONSENSE软件，得到两个文件outfile和outtree。

Outfile可用记事本打开，Outtree可用TREEVIEW打开。将两个文件更名为cupgmafile 和cupgmatree. 至此我们采用UPGMA方法，并使用bootstrap检验，得到了最优树。

5.1.3.4 FM方法

1.执行FITCH软件，将dnadist(或protdist)输入，更改M参数为分析多个数据，

生成两个文件outfile和outtree。将其分别更名为fmfile和fmtree。用记事本和TREEVIEW打开后，可以看到这两个文件都含有100个进化树。（Figure 1.15）

Figure 1.15 FITCH程序界面

参数D选择程序，默认是FM方法，也可用最小进化法建树。参数- 设定是否允许枝长为负数，默认是不允许。参数G是搜寻最优树时的方法设定。

2.再将fmtree文件输入CONSENSE软件，得到两个文件outfile和outtree。

Outfile可用记事本打开，Outtree可用TREEVIEW打开。将两个文件更名为cfmfile 和cfmtree. 至此我们采用FM方法，并使用bootstrap检验，得到了最优树。

1.4 最大似然法建树(Maximum Likelihood )

1．打开DNAML(PROML)软件。将刚才生成的seqb文件输入，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree。将outfile更名为mlfile，将outtree 更名为mltree。用记事本和TREEVIEW分别打开，可以看到这两个文件都含有100个进化树。（Figure 1.16）

Figure 1.16 DNAML程序界面

参数S：设置是否对所有树型和枝长依次迭代计算，默认是不迭代的，如果选择迭代，程序运行速度变慢，但找到似然值最大的树的概率增加。参数G：设置拓朴结构是否要迭代计算，默认不迭代，迭代的话至少需要三倍的时间。

2．打开CONSENSE软件，将刚才生成的mltree文件输入，生成两个文件outfile 和outtree。Outfile可用记事本打开，Outtree可用TREEVIEW打开。将两个文件更名为cmlfile和cmltree.。至此我们采用ML方法，并使用bootstrap检验，得到了最优树。

二、MEGA

网址：https://www.360docs.net/doc/0918033264.html,/

MEGA 的全称是Molecular Evolutionary Genetics Analysis，可用于序列比对、进化树的推断、估计分子进化速度、验证进化假说等。MEGA 还可以通过网络（NCBI）进行序列的比对和数据的搜索。 MEGA6在线帮助：

https://www.360docs.net/doc/0918033264.html,/webhelp/helpfile.htm

2.1 安装软件

下载MEGA6程序,按照默认将程序安装到自己的计算机。

2.2 生成多条序列比对文件

MEGA自带多序列比对分析软件，所以不需要借助其它软件进行比对。点击 开始－程序-MEGA6－MEGA6，启动程序。（Figure 2.1）

Figure 2.1 MEGA 6启动页面

点击Align图标-Edit/Build a Alignment， 出现对话框有三个选项(Figure 2.2)。如果你手头有比对好的mas格式的文件，选择第２个选项-open a saved alignment session,否则，选择１（创建新的比对）或３（从文件输入序列）。

Figure 2.2 任务选择

这里我们先选择第一个选项,点击OK。然后出现对话框，询问你的序列类型，如果是核酸序列，点击DNA,如果是蛋白质序列，选择Protein,如果不输入序列，选择Cancel.(Figure 2.3)

Figure 2.3 序列类型选择

选择DNA,出现新窗口Alignment Explorer,点主菜单Data-open-retrieve sequences from file.(Figure 2.4)

Figure 2.4 输入要比对的序列

选择你的序列文件（所有序列fasta格式，保存到一个文本文件txt中，改扩展名为 .fas）,点打开，文件中的序列出现在窗口中。（Figure 2.5）

Figure 2.5 序列输入成功

按住Shift点击序列名，选中所有的序列，点击主菜单Alignment，有四种比对方式可选Align by ClustalW，Align by ClustalW（codons），这两种是渐近式算法； Align by Muscle，Align by Muscle（codons）这两种是迭代式算法。Codons选项是在比对时考虑密码子因素，不允许空位出现在密码子中间，对于mRNA序列比对，可以提高可靠性。(Figure 2.6)

Figure 2.6 比对程序选择页面

选择一种算法，出现比对参数设置界面(Figure 2.7).要更改哪个参数，点击该参数前面的复选框，待这栏变成黄色，就可以修改参数了，修改完毕点击OK或Compute,稍等一会儿就出现比对结果页面。(Figure 2.24)

Figure 2.7 比对参数设置页面(左ClustalW 右MUSCLE)

Figure 2.8 比对结果页面

点击Data-Export Alignment-MEGA Format，保存比对结果（Figure 2.9）。然后点击Data-Exit AlnExplorer，程序询问是否要要保存现在的比对结果，我们已经保存过，点击否.

Figure 2.9 比对结果保存页面

2.3 进化树构建

点击主菜单File-Open a File/session,选择刚保存的meg文件，主窗口出现所选择文件的图标。(Figure 2.10)