Proflex PCR System使用说明书

USER GUIDE

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

ProFlex ?

PCR System User Guide

Installation, Use, and Maintenance

for use with: PCR reagents from Invitrogen ? and Applied Biosystems ?Catalog Number 4483636, 4483637, 4483638, 4484071, 4484073, 4484074, 4484075, 4484076, 4484078,4484072, and 4484077

Publication Number MAN0007697

Revision

A.0

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

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DISCLAIMER

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Important Licensing Information

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Trademarks

All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. AmpliTaq and AmpliTaq Gold are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. Clorox is a registered trademark of The Clorox Company, Bio-Rad, MyCycler, and C1000 Touch are trademarks of Bio-Rad Laboratories, Inc. Eppendorf, Mastercycler, and MJ Research are trademarks of Eppendorf AG.

Contents

About this Guide (6)

Revision History (6)

Purpose (6)

■CHAPTER 1 About the System (7)

About the system (7)

Use the Touchscreen (8)

Enter text (9)

Enter numerals (10)

Touchscreen menu overview (11)

■CHAPTER 2 Initial Set-up (14)

Site requirements (14)

Environmental requirements (14)

Temperature and humidity requirements (14)

Pollution (14)

Altitude (14)

Materials (15)

Required materials (15)

Optional protective hardware (15)

Unpack the product (15)

Set up the system (16)

Set up the wired connection (18)

Set up the wireless connection (20)

Recommended instrument settings (21)

Change sample blocks (30)

■CHAPTER 3 Operating the ProFlex? PCR System (31)

Load samples into the instrument (31)

Load samples (31)

Load samples in the ProFlex? 3x32-Well PCR System (33)

Create a new run method (34)

Edit a run method (36)

ProFlex? PCR System User Guide 3 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

Contents

Manage methods and folders (41)

Perform a run (43)

Perform a run on multiple instruments (45)

Connect the instruments (45)

Perform a run on multiple instruments (45)

Monitor a run (46)

Monitor via the Home screen (46)

Monitor via the run monitor screen (46)

If the power fails (48)

View and export the run report (48)

Remove the samples from the instrument (48)

■CHAPTER 4 Routine Maintenance (49)

As-needed maintenance (49)

Clean the instrument (49)

Replace the fuses (51)

Upgrade the system firmware (51)

Self Verification test (53)

Order kits and replacement parts (54)

■APPENDIX A Ordering Information (55)

Instrument part numbers (55)

Consumables (55)

■APPENDIX B Troubleshooting (59)

Troubleshoot problems (59)

Return an instrument for service (60)

■APPENDIX C Instrument specifications (62)

Technical specifications (62)

System specifications (64)

Location of power point and ports on the instrument (65)

■APPENDIX D Predefined Run Methods (66)

■APPENDIX E Safety (81)

Symbols on this instrument (81)

Safety alerts on this instrument (82)

Location of safety labels on this instrument (83)

Safety information for instruments not manufactured by Thermo Fisher Scientific (85)

4ProFlex? PCR System User Guide

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

Contents Instrument safety (86)

General (86)

Physical injury (86)

Electrical (86)

Cleaning and decontamination (86)

Laser (87)

Safety and electromagnetic compatibility (EMC) standards (87)

Safety (87)

EMC (87)

Environmental design (88)

Chemical safety (88)

Biological hazard safety (89)

Documentation and support (90)

PCR仪使用手册

P C R仪使用手册 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

Biometra T gradient 用户手册型号 050-810 T gradient48 050-811 T gradient96 Biometra biomedizinische Analytik GmbH Rudolf-Wissell-Str. 30, D-37079 Goettingen Tel.: 0551/50 686-0; Fax: 0551/50 686-66 email: 1 目录 1 目录 2 介绍 3 使用前安全警告警告标志 4 T gradient的初始操作步骤 T gradient前视图 T gradient后视图 T gradient控制板初始自检 T gradient的显示操作可调节的热盖

盖子卡住时如何放开转轮 5 创建一个程序选择一个目录选择一个程序储存库输入子目录的名称输入程序名输入热盖的温度选择/取消热盖预热输入温度和时间设置设置温度梯度查看模块的温度梯度值设置循环次数冷却到环境温度以下储存程序 6 浏览/编辑程序数据删除/插入程序档拷贝程序删除程序 7 其他选项的设置设置时间增量设置“触地”（touch down）PCR 调节加热和冷却坡度

8 运行程序选择和开始程序操作过程中的显示浏览剩余的运行时间察看当前的温度梯度暂停/停止程序 9 特别功能打印协议警报声的开关选择语言标准模式/测试模式 RS232-控制器 10 微板的密封在PCR中密封微板取下热封膜 11 维护 12 问题解答减慢加热和冷却的速度由于断电重新启动来自其他PCR仪的协议的更改13. Tg radient 96技术参数 2 介绍

ABI Veriti 梯度PCR仪使用说明

ABI Veriti 梯度PCR仪使用说明哈尔滨德远科技开发有限公司

操作步骤： 1、打开PCR仪的热盖，插入0.2ml的样品管。盖好热盖。 2、打开PCR仪的电源，仪器程序开始初始化，需等待几分钟。 3、初始化完成后，显示主菜单： 4、点“Browse/New Methods”，进入PCR程序列表：

5、可以直接点一个PCR程序，选择“Start Run”运行；点右边的符号，可以选择不同的文件夹。如要新建一个PCR程序，点“New”，出现PCR程序： 6、添加一段程序：点中上方的“Stage”位置，该位置变红；再点“Add”，软件将加入一段新的程序。

7、修改循环数、温度、时间：点中循环次数、温度或时间位置，下方出现数字键。依次点数字键，出现合适数字后，点“Done”确定。 8、增加一个步骤：点“Step”位置，该位置变红；再点“Add”，软件将加入一个新的步骤。 9、删除一个步骤：点“Step”位置，在点“Delete”，软件将该步骤删除。

1）点中一个步骤，再点“Option”键，出现选项如下 2）点“VeriFlex step”，出现梯度创建窗口：输入6个梯度温度，温度下方的“1－2”是指对应的1、2两行加热孔，全部输好后，点“Done”确定。注意：相邻的两个梯度温度之差最大不能超过5℃！

1）点中一个步骤，再点“Option”键，出现选项如下 2）点“Auto Delta”，出现渐变模式创建窗口。点“Staring Cycle”，输入起始循环数；点“Delta Temperature”，输入温度变化值；点“Delta Time”，输入时间变化值。渐变模式适用于touchdown PCR，可以提高PCR 反应的特异性。例：输入起始循环数为2，温度变化值为＋0.5℃，时间变化值为＋5s，则表示从第2个循环开始，每循环一次升温0.5℃，时间增加5s。

PCR实验室报批细节、注意事项、常见问题问答

报批细节 1、技术档案：技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件 2、仪器档案：实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。 5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值 3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。仪器简单操作流程标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。仪器的申请、采购、使用、验证程序样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认

注意事项 1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致."写你所做的,做你所写的". 2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如"消毒时间一到两小时"不能这样写,多少就是多少. 3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外. 4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程. 5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用. 6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为) 7、所有仪器、设备都要有档案卡. 8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。 9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚. 10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制度、硬件、意识。 11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风. 12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充. 13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾. 14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记等. 15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单. 16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管. 17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,

PCR仪操作说明

Mastercycler Personal PCR仪操作手册

1 简介 Eppendorf的Mastercycler Personal是适用于所有分子生物学和生化实验室研究的PCR仪。样品温度在4-90度间快速可调（最大速度每秒3度）。设计有特殊的“离心管控制”模式，从而对装有不同体积溶液的不同离心管中的样本进行温度控制。加热槽为一通用模块，可适用5X5的微孔板、25个0.2ml的Eppendorf PCR管、16个0.5ml薄壁的Eppendorf PCR管或其他相应的试管，而无须更换模块。为避免样本蒸发浓缩，本仪器设计有可适应各种试管高度的热盖。本仪器易于操作，有完整的八线显示，并可连接打印机。 Mastercycler Personal是Perkin-Elmer公司授权许可生产的PCR仪。 2 安全警告 3 安装 3.1 包装一个包装内应含有以下物品： 1台小型PCR仪 1条主电源线 1本操作指南 1张个人存储卡 1包0.2mlPCR管（100个） 3.2 装机安装时请确保通气孔通畅，四周有足够的空间散热；并请确保仪器下部无其他异物。搬动仪器时无须其他装置，可抓住仪器两侧将其提起。所需空间：宽 18cm 深：35cm 高： 25cm 电源连接：1个防电击插座。如需连接打印机，则需用另一电源连接。 3.3 启动仪器拆除热盖上的胶条并取出热盖下的泡沫塑料。连接电源线。启动仪器前请核对用户电源是否与铭牌要求相符。连接和启动打印机的步骤见第9部分。 4 技术说明 4.1 仪器结构图1：前面观 1 热盖 2 热盖锁 3 显示与控制面板 4 个人存储卡读取器

pcr仪使用说明

一. 开机打开 PCR 仪的电源，需等待一小段时间，大概几十秒，仪器程序开始初始化。初始化完成后，显示主菜单，二. 建立新方法 1. 点击“N ew Methods ”，进入以下界面，点击“open template ”进入创建程序界面，可以通过已存在的模板创建程序，如果没有使用其中的模板，请选择“Blank Template ”，在选择“General PCR ”进入下边第三幅图界面。 2. 温度，时间，循环等体积等的设置：点击”Edit ”进入如下“edit ”界面，可以通过点击页面上的步骤温度、时间、热盖温度、反应体积和循环数，来设定每个步骤时间和温度；点击“Save ”保存当前程序，可以设定程序名称，保存位置。程序保存后选择模块，直接运行程序。

3. 添加步骤和阶段。点击“Manage Stages ”进入如下界面，点击“Add Stage ”出现“+”，点击“+”则在该Stage 之前添加一个相同的Stage ，点击“Remove Stage ”在程序界面上出现“-”，点击“-”则移除当前Stage ；点击“add step ”出现“+”，点击“+”则在该Step 之前添加一个相同的Step ，点击“Remove Step ”在程序界面上出现“-”，点击“-”则移除当前Step ； 4. 高级设置。点击“Advanced Options ”进入高等设置界面，如下图：点击“Simulation Mode ”进入模拟界面，可以选择需要模拟的机器。当选择模拟机器时，仪器的变温速率是不可以调整的。通过“VeriFlex ”设定仪器的梯度，点击，设置梯度，两个梯度范围间隔最小0.1℃，最大5℃ 三、运行已有的程序点击“Open method ”，进入“Select Method ”菜单项，选择左侧的文件夹，查看文件夹中的程序，选择要运行的程序直接点击，进入程序界面，在此界面下也可以对程序进行编辑，如果无需编辑选择要使用的模块，直接点击“Start RUN ”,运行当前程序。

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml 的PCR管中不能均匀传热。不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。检查模板和引物的用量。增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

PCR仪使用说明及注意事项

PCR仪使用说明及注意事项开机：PCR仪的开关在仪器的背面将开关打开后仪器显示如下界面 F1（Run）选择一个程序并开始运行； F2（Create）Ｆ3（Ｅdit）建立一个新程序或修改已有程序；Ｆ４(Ｕtil) 查看仪器最后运行的程序；Ｆ５（Ｕser）建立、编辑或删除新用户。建立新用户：

选择Ｆ５选择Ｆ２用户名可以用字母、数字或它们的组合命名，通过方向键选择字母、通过数字键选择数字。命名完成后选择Ｆ１，用户名建立完成。程序设置：1、新建程序选择用户名后，选择Ｆ２

通过光标移动及数字键设定程序的各个参数（包括各反应阶段的事件、温度及循环数），完成后选择Ｆ２储存程序，出现以下界面，选择Ｆ３为程序命名选择Ｆ１保存。２、编辑程序：在主菜单的界面下选择Ｆ２，选择需要编辑的程序选择Ｆ１编辑编辑完成后，选择Ｆ２保存程序信息。运行程序：在主菜单下选择Ｆ１，然后选择运行的程序选择Ｆ１

在此界面下需确定样品的体积，选择Ｆ１开始运行。程序运行结束后出现以下界面退出到主菜单，取出样品并关闭电源。注意事项：１、使用PCR仪需提前预订，预订的程序要标明退火温度和延伸时间：如果不用要及时取消或通知接下来要做的人。２、不得无故拖延反应开始的时间，如无故拖延超过半小时，该时间段即刻取消，其他同学可协商使用。３、PCR反应结束后请及时收取PCR产物，或交代同学及时帮忙收取。若后续反应不能及时跟上，请务必关机！因为开机状态下，热盖将持续工作，长此以往，热盖容易损坏。４、PCR反应最后一步请务必设置为：16℃，2 min。（切忌4℃，∞，避免压缩机过度耗损！）５、PCR仪不能同一温度设置较长时间，16℃３小时。６、PCR仪不能开机运行过夜。

PCR仪操作方法

美国伯乐公司MyCycler PCR仪操作步骤： 1．接通电源，打开开关，如果仪器处于备用状态，可直接按显示屏上的standby键，在通过一个快速自动诊断程序后，初始界面将会出现。 2．按F2键，初始界面上将会出现选择菜单。 3．选择“Custom”项，并按Enter键以建立新的运行程序。如果菜单已有的程序与你需要的程序相近，那么你也可以在选择菜单对已有的模板程序进行编辑。 4．编辑运行程序：仪器默设的运行程序有3个简单的步骤组成。95℃30秒，55℃30秒，72℃0秒。你将根据需要按如下步骤更改。（1）按F4键增加或删除部分步骤，注意竖线把不同的循环周期搁开，正在运行的循环次数在第一次循环的左下脚标出。（2）采用方向键在不同的步骤之间转换，调定点温度将显示在温度曲线上方。相反运行时间将显示在温度曲线下方。循环次数将在每一个循环最后一步的右下角，后跟随“x”符号。（3）在用方向键选择要更改的温度调定点以及运行时间后，按F3，选择要更改的操作，此时会弹出一个新的界面，在此界面下，可以输入所需的时间或温度。（4）程序编辑完成后按F5。 5．在选择菜单中点“Save Protocol As…”保存编辑程序，以字母与数字组合命名。然后按Enter键完成操作。 6．此时初始界面会出现，按F1键进入程序储存库，用箭头键选择你新编辑的程序，随后按Enter键，将会出现一个选择菜单。选择“Run Protocol” 7．随之出现运行方案界面。提示是否想热启动（如果你选择“YES”将会进一步提示你所需要的热启动温度），如果你选择“Algorithmic Measurement”，界面上还会让你选择温度标准以及取样容积标准。 8．按F5开始运行程序。 9．运行完毕后按Stop键完成操作。

相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

相对定量方法实际操作（常用方法） 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中公式： P1 P2 F=2— 待检样品看家基因平均 Ct值对照组目的基因平均Ct 值对照组看家基因平均Ct 值 — 待检样品目的基因平均 Ct值 ——

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于，二是换用其它的相对定量方法。应用实例：如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为和，两者的差值<，因此，

荧光定量PCR仪操作指南eppendorf

目录： 1 安全预防法 2 安装 2.1 交货包装 2.2 仪器的安装 2.3 功能性单元 2.3.1 Mastercycler ep realplex 2.4 启动 2.4.1 realplex模块与热模块之间的连接 2.4.2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2.4.3 与其它部件的连接 2.4.4 realplex软件的安装 2.4.4.1 安装主程序 2.4.4.2 数据恢复 2.4.4.3 开始realplex软件的运行 3. 操作 3.1 管理者登陆 3.2 登陆 3.3 用户变更 3.4 系统配置 3.4.1 对使用者的管理 3.4.1.1 新用户建立 3.4.1.2 编辑用户 3.4.1.3删除用户 3.4.2 用户层 3.4.3 循环仪 3.4.4 realplex 模块 3.4.5 系统层 3.4.5.1 特性 3.4.5.2 登陆出错信息 3.4.5.3 用户登陆 3.4.5.4 软件更新 3.5 检测项目管理 3.5.1 建立检测项目 3.5.2 打开检测项目 3.5.3 保存检测项目 3.5.4 保存模板文件 3.5.5 模板文件的使用 3.5.6 复制检测项目 3.5.7 检测项目的输出 3.5.8 检测项目的输入 3.5.9 建立文件夹

3.5.10 删除检测项目和文件夹 3.6 探针管理 3.7 染料管理 3.8 校准 3.8.1 背景校准 3.8.2 颜色校准 3.8.2.1 使用商业的校准工具包进行的颜色校准3.8.2.2 客户特有的染料的校准 3.9 数据库管理 3.9.1 当前数据库的自动保存 3.9.2 当前数据库的保存 3.9.3 输入数据库 3.9.4 数据库的归档 4 编程（检测项目的建立） 4.1 建立一个新的检测项目 4.2 建立板布局 4.2.1 染料的确定 4.2.2 参考染料的选择 4.2.3 样本容积输入 4.2.4 探针类型的确定 4.2.5 背景的确定 4.2.6 样品类型的定义 4.2.6.1 标准 4.2.6.2 阳性对照 4.2.6.3 阴性对照 4.2.6.4 未知样品 4.2.7 复制和标准系列的自动建立 4.2.8 定量的样品类型 4.2.9 相对定量的样品类型 4.2.9.1 多plex分析例子 4.2.9.2 单plex分析的例子 4.2.10 熔点分析中的样品类型 4.2.11 终点测定中的样品类型 4.2.12 +/-检测项目中的样品类型 4.2.13 基因辨识中的样品类型 4.2.12 样品的复制与剪切 4.2.15 删除样品 4.2.16 几个样品的归组 4.2.17 子检测项目的测定 4.2.18 板布局的删除 4.2.19 完整检测项目的板布局编辑 4.3 pcr程序的建立 4.3.1 用模板程序建立一个pcr程序 4.3.2 不用模板程序建立pcr程序

PCR注意事项

影响PCR的主要因素 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。 1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。 2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G+C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。 3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA 片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。 4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。二、引物引物设计要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。

PCR原理及注意事项

PCR 一、PCR的原理 PCR，Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明。该技术基本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下，依赖于DNA polymerase的酶促合成反应。DNA polymerase以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端(退火),并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环。 1.PCR反应的基本成分包括：Templates DNA(待扩增DNA)、Primers、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的Buffer(对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO)。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃或60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，新链又可成为下次循环的模板。 3.PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示实际扩增效率，平均约为75%，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。如果进行30个Cycles，实际扩增倍数往往为106-107（理论上以Y=2n计算，为109）。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有

PCR仪使用方法

步骤： 1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：“-RUN ENTER PROGRAM PROGRAM”准备执行程序。 2、放入样本管，关紧盖子。 3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“-ENABLE DISABLE HEATED LID”按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。 4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示“-NEW LIST EDIT DELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。 2）输入程序步骤：名字输入后，显示“STEP1 _TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。 3）选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）（为实际循环数 -1)。 4) 选择option，显示“STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。 4）选择End，输入结束步骤。 5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。 6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。编辑程序： 1、可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。 2、对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删除。 3、删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示主菜单，选择DELET，用《Select》选择删除。 4、查看程序的步骤：在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称，再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行: 将PＣＲ反应得试管与反应板紧贴、当酶反应混合物以70℃“热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0。2—m ｌ得PCR管中不能均匀传热。?不要随意减少dNTＰ得用量,它就是一个系统得因素,必须与其它成份保持平衡。?对于有问题得PCR反应,例如模板得量少,模板不纯与环状模板等,先尝试加Ｔａｑ酶前得体系进行预变性,后加模板进行正常PＣＲ扩增。?没有扩增产物: 在提供MgCl2缓冲液中,以0、25mmoｌ／L为梯度增加MgCl2浓度;无ＭgCl２得缓冲液以0、5mmol/L为梯度增加MgCｌ2浓度。?泳道中出现模糊条带,如果ＤNＡ模板中存在R ＮA,则按上述提示浓度补加MgＣl2,因为在PCR反应中可能缺少游离得Ｍg２+。?检查退火温度与变性条件,如果有需要得话,可降低退火温度。?检查模板与引物得用量。?增加循环次数与／或模板ＤＮA得用量。?泳道中出现模糊条带: ?减少循环次数或模板DNA得用量。?提高退火温度,但不要超过６8℃。重新设计引物或设计更长得引物。其她值得注意得条件: 建议使用0、2—ｍｌ薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml,推荐用30mｌ矿物油覆盖(对盖子加热得PCR仪可以不加)。?大多数反应中,0、75ml(0。5～1ml)得酶量在大多数情况下可以得到满意得结果。建议使用1.75mｍol／ＬMgCｌ2∶３5０mmol/L dNＴP或2.２5mmｏl/L MgCｌ2∶5０0mmol/ＬdNTＰ组合得混合物、然而要得到最佳结果,优化Mg２＋得浓度就是必需得。?基因组DNＡ模板得质量显著影响PＣR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 得长度。DNＡ片段长度可以超过50kb,传统得基因组DNＡ能扩增片段至10kb。要扩增更长得片段应使用超纯或高分子量得ＤＮA。请查阅高分子量ＤNＡ提取操作过程相关文献、?降低二级结构与引物二聚物形成得可能性、进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2４～34个核苷酸,溶点在６0～68℃间。使用这类引物可提高PCR反应得退火温度来增加反应得特异性。这点非常重要,长片段扩增得效果往往受到非特异性短片段优先扩增得影响。?变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(9４℃下进行２0—-30秒),除非模板中富含ＧC,则95℃下变性３0秒。这可以防止DNA脱嘌啉与链断裂,对于所需扩增得基因组DＮＡ片段终长度超过12kb时,应该尽可能得降低变性温度。延伸:68—－72℃下进行延伸操作。?循环延伸:尽量采用循环延伸得条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸得时间,例如在扩增１0kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来得８分钟、长片断PCR系统扩增得片断其3’—末端带有一个突出得Ａ,因此建议采用Ｔ／A克隆。若要进行平端可隆,可用Ｋｌenow酶与T4 DNＡ多聚酶将PCＲ产物补平后再进行、测序时因酶得混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一得(染色体)带型。在无菌得0。5ml或0.2mｌ离心管中按下列操作程序加样: ?反应物加样顺序体积(μl) 终浓度去离子水1 2９、4 1０×Bufｆer B 2 5 １× 10×PCRＢufｆer成分:

Biometra梯度PCR仪使用说明

Manual Software Version 5.00gr April 2005 Order-No. 050-800 TGradient 48 050-801 TGradient 96 Biometra biomedizinische Analytik GmbH Rudolf-Wissell-Str. 30, D-37079 Goettingen Tel.: 0551/50 686-0; Fax: 0551/50 686-66 email: info@https://www.360docs.net/doc/097843618.html, https://www.360docs.net/doc/097843618.html,

TG RADIENT Manual____________________________________________________________I 1INTRODUCTION (1) 2BEFORE YOU START (2) 2.1S AFETY PRECAUTIONS (2) 3FIRST STEPS WITH THE TGRADIENT (3) 3.1T HE TG RADIENT T HERMOCYCLER FRONT V IEW (3) 3.2T HE TG RADIENT REAR VIEW (4) 3.3T HE TG RADIENT CONTROL PANEL (5) 3.4I NITIAL SELF TEST (6) 3.5T HE TG RADIENT DISPLAY (6) 3.6H ANDLING OF THE ADJUSTABLE HEATED L ID (6) 3.7R ELEASING WHEEL IN CASE OF BLOCKED LID (7) 4CREATING A PROGRAM (8) 4.1S ELECT A DIRECTORY (8) 4.2S ELECT A PROGRAM STORE (8) 4.3E NTER NAME FOR SUBDIRECTORY (9) 4.4E NTER A PROGRAM NAME (9) 4.5E NTER THE LID TEMPERATURE (10) 4.6S ELECT / DESELECT PRE-HEATING OF THE LID (10) 4.7E NTER TEMPERATURE AND TIME SETTINGS (11) 4.8S ET TEMPERATURE GRADIENT (12) 4.9V IEW DIFFERENT TEMPERATURES OF THE GRADIENT IN THE BLOCK (12) 4.10S ET CYCLE NUMBER (13) 4.11C OOL BELOW AMBIENT TEMPERATURE (13) 4.12S AVE PROGRAM (14) 5VIEW/EDIT PROGRAM DATA (15) 5.1D ELETE / INSERT PROGRAM STEPS (15) 5.2C OPY PROGRAM (16) 5.3D ELETE PROGRAM (17) 6FURTHER PROGRAMMING OPTIONS (19) 6.1P ROGRAM TIME INCREMENTS (19) 6.2P ROGRAM TOUCH DOWN (20) 6.3A DJUST HEATING AND COOLING RAMPS (20) 7RUN PROGRAM (21) 7.1S ELECT AND START PROGRAM (21) 7.2D ISPLAY DURING OPERATION (22) 7.3V IEW REMAINING RUN TIME (23) 7.4V IEW CURRENT GRADIENT TEMPERATURES (23) 7.5P AUSE / STOP PROGRAM (24) 8SPECIAL FUNCTIONS (25) 8.1P RINT PROTOCOLS (25) 8.2S WITCH BEEP ON/OFF (25) 8.3S ELECT LANGUAGE (26) 8.4RS232 C ONTROL (26) 8.5B LOCK TYPE (26) 9MAINTENANCE (27) 10EXCHANGE OF MODULES (27) 11TROUBLE SHOOTING (28) 11.1S LOW HEATING AND COOLING (28) 11.2A DAPTATION OF PROTOCOLS FROM OTHER CYCLERS (28)

steponeplus型pcr仪操作规程和pcr仪简易设置指南

1.StepOnePlus上机可由两种方式来进行：由StepOne Software Quick Start进行上机或由StepOnePlus 机器面板直接触控上机。 2. 由StepOne Software Quick Start进行上机：开启StepOne Software 进入主画面后点选 Quick Start 窗口进行快速上机设定。进入Experiment Properties后输入：Experiment Name及档案储存位置；选择Experiment Type选择使用荧光系统；选择Ramp Speed选择实验样品种类；点选Run Method确定PCR 反应条件是否需要修改后，按下START RUN。如欲使用StepOnePlus机器上VeriFlex Block的功能，请由左方Setup功能列上点Plate Stepup窗口，在“Assign Targets and Samples”窗口下，勾选Enable VeriFlex Block选项，此时Block即被分成六个区块。接着点选Run Method，在run program上点一下欲调整的温度步骤，选择“Set different temperatures for one or more zones”并设定每个区块的温度，请注意两相邻区块温度差异不可以超过5度，第一和第六区块最多可差异25度。按下Start Run Now进行data 收集，反应结束后，则会回到“Main Menu”画面，触控Collect Result将data 存出。 2.由StepOnePlus 机器面板直接触控上机：开启电源后，进入主画面，由触控式屏幕来进行StepOnePlus 的设定。按下TaqMan cDNA（Standard）进入PCR Thermal Cycle Program，可利用下面工具列再重新编辑反应条件，如果条件相同则直接按下Save。如欲使用StepOnePlus机型上VeriFlex Block的功能，请点选Options下的VeriFlex step并设定每个区块温度，请注意两相邻区块温度差异不可以超过5度以上，第一和第六区块最多可差异25度。触控需要更改之处则会跳出触控式键盘，重新给予实验名称、选择档案储存的Folder、并更改实际反应样品体积，按下Save & Exit；然后在Browse Last Accessed Experiments 下选择刚设定好的实验，按下Start Run。此时跳出

PCR注意事项总结

PCR注意事项 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，