高级生化-蛋白质综述

摘要：蛋白质组学是后基因组时代的新兴学科，是当今生命科学领域

新的增长点，本文就蛋白质组学中的分离和鉴定技术包括双向凝胶电泳、色谱和质谱等技术近几年的发展状况及最新研究进展进行综述。关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；色谱；质谱；生物信息学

Abstract：Proteomics which is the new discipline in the time of the post-genomics develops rapidly in the life science．The present paper has documented the current situation and new development of the techniques of separation and identification in this area，including 2·dimensional gel- electro·phoresis，chromatography an d mass spectrometry．

Key words：Proteomics；2-Dimensional gel electrophoresis；Chromatography；Mass spectrometry；Bioinformatics

1、概念及相关内容

随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的功能性产物即蛋白质的研究,并产生了一门新的学科———蛋白质组学(proteomics) 。“蛋白质组(proteome) ”一词是1995 年由澳大利亚科学家Marc Wilkins 和Keith Wil2liams[ 1 ] 最早提出的,是由蛋白质(protein) 和基因组(genome) 派生而来。被定义为“一个细胞或组织所表达的所有蛋白质产物或某一特定时期内所表达的所有蛋白质产物”。蛋白质组研究与以往的蛋白质化学研究不同,它着重于全面性和整体性,研究的对象不是单一或少数的蛋白质,而是从细胞整体水平上对蛋白质的结构和功能进行研究,包括蛋白质在细胞内的表达水平、位置、功能和调节以及翻译后的修饰、剪接等加工信息。蛋白质组研究使人们对生命系统与活动分子机制的认识由间接的基因、核酸层次深入到生命的直接执行者———蛋白质水平。蛋白

质组研究已成为后基因组时代的主要任务[ 2,3 ]。

2、蛋白质组研究的主要技术

相对于基因组的研究,蛋白质组的研究相对滞后,主要原因是缺乏像基因组研究那样成熟的技术。当前蛋白质组研究的主要技术可分为两大类,一类是蛋白质组的分离技术,包括双向电泳、双向高效柱层析等;另一类是蛋白质组的鉴定技术,包括质谱技术、生物信息技术等。

2.1 蛋白质组的分离技术

2.11 双向凝胶电泳技术(2-DE)

双向凝胶电泳技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方

法之一。这项技术是O′far2rell 、Klose 和Scheele 等[4 ,5 ]于1975发明的。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯

酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质

谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。

Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量

蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。

2.12 双向高效柱层析

其基本原理是先进行一次分子筛柱层析,按蛋白质分子量大小进行第一次分离,从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析进一步分离,第二向层析通常是利用蛋白质表面疏水性质进行的反相柱层析。和双向电泳相比,双向高效柱层析的优点是可以适当放大,分离得到较多

的蛋白质以供鉴定;可以和质谱技术联用实现蛋白质分析技术的自动化,同时流出的蛋白峰直接进入质谱进行鉴定,可减少印迹的步骤和

因此引起的缺点。

2．13 色谱分离技术

近年来，色谱技术的发展为蛋白质和多肽或亚基的分离分析提供了新的手段。色谱技术是利用各种物质在固定相和流动相之间不同的分配系数，使其在相对运动着的两相间经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。按两相状态来分类，有气相色谱法(gas chrom- atography，GC)和液相色谱法(1iquid chromatography，LC)

两种，而其中的LC是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法。单一的液相分离技术常不能满足复杂蛋白质复合物分离的需要，多维液相分离系统则在技术上弥补了单一的液相分离技术的不足。多维液相分离系统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相分

离方法的优化和组合，它有效地提高了系统对样本的分辨率和峰容量。此外，多维液相分离系统还具有快速、高通量、自动化、重复性好等优点[6]。常见的多维液相分离系统有二维液相(two．Dimensio- nal liquid chromatography，2D—LC)、二维毛细管(two·dimensional capillary eleetrophoresis．2D—CE)、液相色谱一毛细管电泳(LC —CE)等。色谱技术除了直接对蛋白分离分析外，常与质谱技术联用。如Opiteck等[7]。首次报道多维色谱整合质谱技术(MS)分析蛋白质混合物，Washurn等[8]在多维LC—MS／MS的基础上，提出

MudPIT(multidimensional protein identification technology)

方法，成功分离和鉴定了酵母中1484种蛋白质，这其中还包括一些低丰度的调控性蛋白激酶。Nielsen等[9]应用LC—MS／MS技术成功分离鉴定了海马组织中的1 685种蛋白质。

毛细管电泳(CE)作为一种最新的色谱分离技术，将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合，目前已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，CE由于其侧面截面积大，散热快，能克服由于焦耳热引起的谱带展宽，且可承受高电压，因此分离效率提高，柱效可达几百万乃至几千万理论塔板数／m以上[10]。CE在蛋白质组分析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质

动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。CE在蛋白质组分

析中用于蛋白质肽图的建立与蛋白质鉴定、物化常数分析、蛋白质

动力学研究、样品定性定量检测与微量制备等方面。CE有很多灵敏的

检测技术，如紫外检测、荧光检测、化学发光检测等。应用于蛋白质

组研究中的CE技术主要包括毛细管区带电泳(capilary zone electro

—phoresis，CZE)、毛细管等电聚焦电泳(capilary iso．eletrie

focusing，CIEF)、毛细管凝胶电泳(capilarygel eleetrophoresis，

CGE)和胶束电动毛细管层析(mieelar eleetrokinetie eleetrophor- esis ehromatogra·phy，MECC)等。

2.14 同位素包被亲和标记（ICAT）

ICAT是用同位素标记帮助蛋白质组定量研究的技术，基本原理是

将某一状态的蛋白混合物标记后作为内标准，与另一状态的蛋白混

合物混合酶解，消化后的复杂多肽混合物通过亲和标签用生物素亲和

层析柱将标记的多肽分离，最后分离的样品可以用LC-MC分析或用

LC-MC/MC直接由蛋白序列信息来确定蛋白。这一技术克服了2DGE的缺

点，能全自动化，可以用于高通量蛋白质组"可以精确检测疏水的膜

蛋白、PI和分子量偏大或偏小的蛋白，同时还能够测定其中蛋白质序

列[11]使它的分析范围远大于2DEG。有人用这一方法精确鉴定了体

外和自然状态下分化的人HL60细胞微粒体片段中491个蛋白及其相对

量，其中大部分是膜或膜相关蛋白。ICAT在定量及差异表达检测上有

巨大的优势，但也面临一些问题。ICAT最大的挑战在于样品高度复杂，

质谱分析获得数据的能力与这种复杂性相比显得不足。但随着ICAT

技术的不断进步与完善，它仍将是蛋白质组差异表达研究中的主要技术之一。

2.2蛋白质组鉴定技术

2.21质谱技术

其原理是对2DE所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。它需要三个步骤，首先通过离子化装置将分子转化为气态离子，接着通过质谱分析器按照质荷比（m/z）的不同进行分离，最后转化到离子检测装置[ 12 ]。目前，用来分析蛋白质和肽的样品离子化技术主要包括基质辅助激光解吸收离子化质谱(MALDI)和电子喷射离子化质谱(ESI)。MALDI通常与飞行时间质谱(TOF)相结合。TOF主要用来测量分析物飞过固定的路径所需的时间。另一种鉴别蛋白质的方法是串联质谱(MS/MS)。在这种情况下，经质谱分析的肽段进一步断裂并再次进行质谱分析，这样可得到肽序列的部分信息。

质谱技术能清楚地鉴定蛋白质并能准确地测量肽和蛋白质的分子量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前MS/MS是唯一能够迅速测序N 末端封闭或共价修饰肽段的方法[1 ]。质谱技术很灵活，能与多种蛋白分离、捕获技术联用，对普通的缓冲液成分相对耐受[15]，能快速鉴定大量蛋白质点，而且很灵敏[14]，在一些情况下，仅需10-15 fmol的蛋白[14,16,13], 这在只能得到极少量蛋白的情况下鉴别蛋白是很有用的。在实际工作中可将几种技术结合应用，如串联质谱与Edeman微测序技术相结合[15]，MALDI质谱与纳米电子喷射质谱相结合，这些技术相互

互补，为分析2DE所分离的大量蛋白质提供了有效的手段。

2.22表面等离子共振技术(SPR)

SPR是研究蛋白质相互作用的新技术，其原理是利用平面单色偏振光与金属膜内表面电子发生等离子共振时反射光强度最小时的入射角SPR角[17]。与金属表面结合的生物分子的质量呈正比，如将“诱饵”蛋白作为配基，固化在几十纳米的金属膜表面加入“猎物”蛋白溶液，这样就可以通过SPR角的改变来反映“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白形成的蛋白质复合物，从而反映二者的相互作用。SPR技术因其高效灵敏、无需额外标记等优势，广泛应用于蛋白检测和蛋白(蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布、结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新的模式。细胞粗提液或上清液中存在未知配体，配体垂钓可以筛选并确定新配体[18]。目前，此技术己广泛应于蛋白质组学、细胞信号传导、受体/配体、抗体/抗原分子垂钓、免疫识别、癌症研究和新药筛选等生命科学领域。

2.23 串联亲和纯化（TAP)

TAP是由德国和法国的两家实验室开发出的一套研究蛋白质生理条件下相互作用的新方法。TAP技术可以说是在研究蛋白质相互作用的方法学上获得了巨大的突破[19]，其基本原理是在目的蛋白的一端或中部导入蛋白质标记（主要由蛋白A的IgG结合区(ProtA)和钙调蛋白结合区(CBP)构成,中间被一个TEV蛋白酶的酶切位点隔开）.经过特异性的两步亲和纯化,在生理条件下与目标蛋白发生真实作用的蛋白

质便可被洗脱下来，这样得到的蛋白质复合体接着可以用质谱技术或Edman降解法进行鉴定.该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀

这两种技术的优点,既吸收了经典亲和纯化可以得到高纯度、低拷

贝数的蛋白质复合体，也继承了免疫共沉淀中运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用。可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质[20]。目前，TAP技术与质谱技术的联用,以及质谱技术的自动化,使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上已成为可能。

2.24蛋白质芯片

蛋白质芯片或称蛋白质微阵列，有几种形式[21、22]一种形式称为“捕获蛋白质芯片”，捕获表面矩阵点的直径为1-2mm，捕获表面可以有疏水的、亲水的、阳离子的或阴离子的层析支持物，小量的蛋白质标本直接加在捕获表面。洗涤去除了非特异结合蛋白质后，表面捕获的蛋白质应用飞行时间质谱进行分析，就得到了基于不同相互作用的多维蛋白质图谱。这种技术称为表面加强的激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）方法,这种方法能够获得可重复的、统一的质谱图，因而可用于定量蛋白质研究，是目前国外进行蛋白质测定所使用的最多的方法。在乳腺癌的研究中SELDI-TOF被寄予厚望，能补充mRNA 分析,并且在蛋白质水平和翻译后修饰方面能提供关键信息[23]。

另一种称为靶蛋白芯片，其原理与cDNA微阵列相似,是将特殊的蛋白分子如抗体排列于载体表面,作为探针检测相应的靶和相关的复合物,既可以用于研究蛋白质图谱，也可以用于检查不同蛋白质之间、

蛋白质和DNA片段之间、蛋白质和RNA分子之间的相互作用。靶蛋白芯片的典型代表是抗体微阵列，在卵巢癌的研究中，此芯片对血清蛋白质表达类型的敏感性达到100%，特异性达98%[ 24 ]，此芯片也用于检测膀胱移行细胞癌蛋白质标志物、寻找胰腺癌标志物。

2.25 酵母双杂交系统

酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的

认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录，而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白具有激活转录的功能。DB与AB分别能与多肽X和Y结合，由DB 和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或

靶蛋白(prey or target protein)。如果在X和Y之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的转录激

活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”

的两个蛋白质之间是否存在相互作用[ 25 ]。用酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用通常会存在假阳性或假阴性的问题，已有许多学者对此系统进行了改进，并且将其扩展到检测DNA-蛋白质，RNA-蛋白

质，小分子-蛋白质之间的相互作用上[ 26 ]。

2.26生物信息学

基因组学与蛋白质学的发展促使生物信息学迅速发展。基因组和蛋白质组研究提供了生物学上史无前例的大量数据,这就要求必须有高度自动化的信息处理技术,包括数据的输入、存储、加工、索取以及数据库之间的联系。通过各种特殊设计的软件来实现数据的各种处理和分析,可达到对已知或未知基因产物的全面功能分析。例如用质谱结合数据库的搜索鉴定蛋白质已成为蛋白质组研究的一种主要方法。蛋白质样品首先经过双向电泳分离,然后用特异性的酶(通常用胰蛋白酶) 进行胶内酶解,然后再用质谱仪测定各个肽段的分子量,得到肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint , PMF) [ 27 ,28 ] ,便可以根据PMF 信息并通过特定的软件进行数据库的搜索来鉴定蛋白质。最常用的数据库SWISS2PROT(真正的蛋白质序列数据库) 、TrEMBL (自动从核酸翻译而来还没有进入SWISS2PRO T 的蛋白质序列) 及nrNCBI (包含由GenBank 中的DNA 翻译而来的以及PDB、SWISS2PROT 和PIR 数据库中的蛋白质序列) 等的非冗余蛋白质序列数据库。对于已建立完整基因组序列数据库的生物体,通常利用肽质指纹图谱就可以成功鉴定蛋白质,而对于基因组序列信息还未完全知道的生物体则鉴定成功率显著降低。无法用肽质指纹图谱鉴定的蛋白质还可以通过串联质谱分析推断出蛋白质的部分氨基酸序列,这样C - 端的一段肽序列加上N - 端的一段肽序列以及内部一段小肽氨基酸序列,就组成了肽序列标签(peptidesequence tag , PST) [ 28 ] ,然后再进行数据库的搜

索来鉴定蛋白质。对仍无法鉴定的蛋白质,可根据部分氨基酸序列信息设计DNA 探针进行分子克隆来鉴定蛋白质。

3、展望

目前有约60种微生物的全基因组序列已经测出, DNA序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照, 蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生(如蛋白翻译), 以及非基因编码的活动之间的关系(如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用)。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率，蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达必不可少的一种手段，它的发展将给分子生物学领域带来革命性变化。

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