MPN法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
1实验原理
最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。
特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。
硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。 这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。
反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。
2实验材料
2.1样品
（1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，
充分混匀，制成10-1稀释样。然后用10倍梯度稀释法稀释成一系列梯度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。
2.2培养基
（1）蛋白胨琼脂培养基（检测氨化细菌）：
蛋白胨5g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.2
（2）改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A（检测亚硝酸细菌）：(NH4)2SO4 2.0g，K2HPO4 0.75g， NaH2PO4 0.25g，MnSO4·4H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2
（3）改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B（检测硝酸细菌）：NaNO2 1.0g，K2HPO4 0.75g，NaH2PO4 0.25g，MnSO4·4H2O 0.01g，
MgSO4·7H2O 0.03g，Na2CO3 1.0g，CaCO3 1.0g，蒸馏水 1000ml，pH 7.2 （4）反硝化细菌培养基（检测反硝化细菌）
KNO3 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 1.0g， KH2PO4 1.0g，柠檬酸钠
5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2
将培养基配制好后装入试管中，每管装5ml，塞上硅胶塞（反硝化培养基的试管中应放入一倒置杜氏发酵管，以检测气体的生成），121℃灭菌30min。每个样品需培养基12-30管（4-6个稀释倍数，每个稀释梯度3-5个平行）。
2.3检测试剂
（1）纳氏试剂：
甲液：称取20g碘化汞和10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液：称取20g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中。
分别配制甲乙溶液，冷却后混合，放置2天后使用，保存于棕色瓶中，取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。
（2）格里斯试剂（Griess Reagent）I 和Ⅱ：
试剂I：将0.5 g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）加到150ml的20~30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
试剂Ⅱ：将0.5g α-萘胺（α-naphthylamine）加到50ml蒸馏水中，煮沸后，
缓慢加入150ml的20%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
（3）二苯胺试剂：
溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。
2.4器材
三角瓶、试管（10×100mm）及硅胶塞、滴管、白瓷比色板、酒精灯；
移液枪及吸头，洁净工作台、恒温培养箱等。
3 实验方法
取出灭菌分装好的各培养基试管，用无菌吸管接种样品的稀释液1ml，每个稀释度接种3-5管，接种4-6个稀释度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。于25~30℃中恒温培养箱中培养。
3.1 氨化细菌测定
培养后第3天和5天检查培养基的浑浊度。培养第7天，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加纳氏试剂两滴，检查是否出现棕褐色，确定是否产生氨。
3.2亚硝酸菌测定
培养10~14d后，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）溶液I 和Ⅱ各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。记录下每个稀释度呈阳性反应的培养管数目。
3.3硝酸菌测定
培养10~14d后，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）溶液I 和Ⅱ各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。记录下每个稀释度呈阳性反应的培养管数目。
3.4反硝化细菌的测定
培养14天后检查杜氏发酵罐中是否有气泡出现，培养液变浑浊。用纳氏试剂检查是否有氨产生；格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ检测有无亚硝酸盐生成；用二苯胺试剂检测硝酸盐，判断反硝化作用进行情况。
4计算和报告计数结果
记录结果后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生
长的管数作为数量指标，从MPN数值表中求的数量指标后，再乘以数量指标第
一位数的稀释倍数，即为初始悬浮液中的菌液浓度。若为固体样品，则换算成每
克样品中的细菌数量。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下：
稀释度l0-3 10-4 10-5 l0-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5 阳性管数 5 5 5 4 1 0 根据以上结果，在接种l0-3~10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种
l0-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，
而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查MPN
数值表最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍
数为100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。即每毫
升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是
所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀
释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的
第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度l0-1 10-2 10-3 l0-4 10-5 10-6
重复数 4 4 4 4 4 4 阳性管数 4 4 3 2 1 0 以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查
表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同，
最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最
低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。二是每
个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。
5 MPN数值表
MPN法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌 1实验原理 最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。 特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。 氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。 硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。 这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。 反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。 2实验材料 2.1样品 （1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，
硝化反应和反硝化反应
硝化反应和反硝化反应 Prepared on 22 November 2020
一、硝化反应 在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。 硝化反应包括亚硝化和硝化两个步骤: NH4+++H 2 O+2H+ NO 2 -+ 硝化反应总方程式： NH 3 ++若不考虑硝化过程硝化菌的增殖，其反应式可简化为 NH4++2O 2NO 3 -+H 2 O+2H+ 从以上反应可知: 1)1gNH 4+-N氧化为NO 3 -需要消耗2*50/14=碱（以CaCO 3 计) 2)将1gNH 4+-N氧化为NO 2 --N需要,氧化1gNO 2 --N需要，所以氧化1gNH 4 +-N需 要。 硝化细菌所需的环境条件主要包括以下几方面： a.DO：DO应保持在2-3mg/L。当溶解氧的浓度低于L时，硝化反应过程将受 到限制。 b.PH和碱度：，其中亚硝化菌，硝化菌。最适合PH为。碱度维持在70mg/L 以上。碱度不够时，应补充碱 c.温度：亚硝酸菌最佳生长温度为35℃，硝酸菌的最佳生长温度为35～ 42℃。15℃以下时，硝化反应速度急剧下降；5℃时完全停止。 d.污泥龄：硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为～(温度20℃，～。 为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间。对于实际应用中，活性污泥法脱氮，污泥龄一般11～23d。 e.污泥负荷：负荷不应过高，负荷宜。因为硝化菌是自养菌，有机物浓度 高，将使异养菌成为优势菌种。总氮负荷应≤(m3硝化段·d)，当负荷>(m3硝化段·d)时，硝化效率急剧下降。 f.C/N:BOD/TKN应<3，比值越小，硝化菌所占比例越大。 g.抑制物浓度：NH 4+-N≤200mg/L，NO 2 --N10-150mg/L，L。 h.ORP:好氧段ORP值一般在+180mV左右。 二、反硝化反应 在缺氧条件下，由于兼性脱氮菌(反硝化菌)的作用，将NO 2--N和NO 3 --N还 原成N 2 的过程，称为反硝化。 反硝化反应方程式为： NO 2-+3H(电子供给体-有机物)+H 2 O+OH- NO 3-+5H(电子供给体-有机物)+2H 2 O+OH- 由以上反应可知： 1)还原1gNO 2--N或NO 3 --N，分别需要有机物(其O/H=16/2=8)3*8/14=和 5*8/14=，同时还产生50/14=碱（以CaCO 3 计） 2)如果废水中含有DO，它会使部分有机物用于好氧分解，则完成反硝化反应 所需要的有机物总量Cm=[NO 3--N]+[NO 3 --N]+DO 反硝化细菌所需的环境条件主要包括以下几方面： a.DO：DO应保持低于L（活性污泥法）或1mg/L（生物膜法）。
反硝化作用与反硝化菌KONODO
反硝化作用与反硝化菌2020 一、反硝化作用： 反硝化作用一般指在缺氧条件下，反硝化菌将（硝化反应过程中产生的）硝酸盐和亚硝酸盐还原成氮气的过程。 在反硝化过程中，有机物作为电子供体，硝酸盐为电子受体，在电子传递过程中，有机物失去电子被氧化，硝酸盐得到电子被还原，实现在反硝化过程对硝态氮和COD的脱除。理论上，1g硝态氮的全程反硝化需要硝化2.86g有机碳源（以BOD计）。对生化处理中反硝化进水，可以考察其可生化性（BOD/COD）和含量（BOD/TN比例），以判断有机物碳源是否适宜并足够系统用于反硝化脱氮。 影响污水生物脱氮过程中反硝化作用的主要因素包括：溶解氧、pH值、温度、有机碳源的种类和浓度，以及水背景情况等。 一般认为，系统中溶解氧保持在0.15mg/L 以下时反硝化才能正常进行。反硝化作用最适宜的pH为6.5-7.5,反硝化作用也是产碱过程，可以在一定程度上对冲硝化作用中消耗的一部分碱度。理论上，全程硝化过程可产生3.57g碱度（以CaCO 3 计）。在温度方面，实际中反硝化一般应控制在15-30 ℃。 二、参与反硝化作用的细菌 反硝化菌主要参与硝态氮及亚硝态氮还原过程，是生化系统中硝酸盐氮去除的主要功能菌。参与反硝化作用的细菌主要有以下几类： 1、反硝化细菌(Denitrifying bacteria) 这是一类兼性厌氧微生物，当水环境中有分子态氧时，氧化分解有机物，利用分子态氧作为最终电子受体。当溶解氧(DO)低于0.15mg/L，即缺氧状态，反硝化细菌可用硝酸盐、氮化物等作为末端电子受体，以有机碳源为氢供体，将硝 酸盐还原为NO、N 2O或N 2 。反硝化作用既可脱除污水中的硝态氮（总氮也自然降 低），又可一定程度维持水环境pH稳定性，还可以降低COD。这类反硝化菌中，有的能还原硝酸盐和亚硝酸盐，有的只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 2、好氧反硝化细菌 有些细菌能营有氧呼吸，同时实现反硝化作用。从污水中，最早分离的好氧
如何快速培养硝化细菌的几种方法)
如何快速培养硝化细菌的几种方法 硝化细菌,培养 快速培养硝化细菌的几种方法~ 水族箱过滤器只具备物理过滤和化学过滤的功能，而降解水中毒素的硝化细菌并未繁殖起来，需要在过滤系统开始运转后逐渐进行培养。若想尽快放入观赏鱼，就需要采取措施加快培养硝化细菌的进度。 通常有以下几种快速培养硝化细菌的方法： (1) 利用旧滤材或滤砂移植硝化细菌饲养过观赏鱼的旧水族箱中滤材或底砂上都附着大量的硝化细菌，若能将旧滤材或滤砂移入新设立的水族箱引入菌种，可大大促进硝化细菌繁殖的速度，至少节约一半的培养时间。 (2) 利用污染源刺激硝化细菌的繁殖在引入菌种后，要配合过滤、充气促进水流循环，并在水族箱中放入4～5 个新鲜的去壳蛤蜊或虾，利用肉质腐烂生成的毒素作为硝化细菌的营养，刺激菌种大量繁殖。还可以购买一些小型易养的实验鱼，放入几条，利用它们的排泄废物、食物碎屑提供有机物废料，促进硝化细菌的繁殖。 (3) 添加人造硝化细菌目前市售的人造硝化细菌，有液态、粉末状、干燥孢子化等不同类型，可以满足观赏鱼爱好者迫切尽快饲养的要求。 培养生物过滤系统的要点~ 在进行水族箱生物过滤系统培养时，要掌握以下几个要点：(1)不宜频繁换水大量的换水，容易破坏水族箱中硝化细菌的繁殖，使附着于底砂滤材中的硝化细菌随换水大量散失，同时水质的频繁改变也无法维持硝化细菌繁殖的适宜pH值，因此换水不必过勤，1～2 个月换20％的水即可。 (2)正确清洗滤材经过长期饲养，过滤系统的滤材上会附着大量硝化细菌，但同时也会积累许多杂质污物，需定期清洗。清洗时，用原水族箱的海水将滤材轻轻挤压揉搓，千万不能用自来水冲洗或使用洗涤剂等化学物质。 (3)渐次追加观赏鱼刚设立的新缸要逐渐增加观赏鱼数量，不可一次放入过多，以免大量的残饵和排泄物产生的毒素超过硝化细菌氧化分解的能力，造成水质污染和观赏鱼死亡。
硝化与反硝化
3.7 硝化与反硝化 废水中的氮常以合氮有机物、氨、硝酸盐及亚硝酸盐等形式存在。生物处理把大多数有机氮转化为氨，然后可进一步转化为硝酸盐。一、硝化与反硝化 (一) 硝化 在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。 反应过程如下： 亚硝酸盐菌 NH4++3/2O2 NO2-+2H++H O-△E △E=278.42KJ 第二步亚硝酸盐转化为硝酸盐： 硝酸盐菌 NO-+1/2O2 NO3--△E △E=278.42KJ 这两个反应式都是释放能量的过程，氨氮转化为硝态氮并不是去除氮而是减少它的需氧量。上诉两式合起来写成： NH4++2O2 NO3-+2H++H2O-△E △E=351KJ 综合氨氧化和细胞体合成反应方程式如下： NH4+1.83O2+1.98HCO3- 0.02C5H7O2N+0.98 NO3-+1.04 H2O+1.88H2CO3 由上式可知：(1)在硝化过程中，1g氨氮转化为硝酸盐氮时需氧4.57g；(2)硝化过程中释放出H+，将消耗废水中的碱度，每氧化lg 氨氮，将消耗碱度(以CaCO3计) 7.lg。 影响硝化过程的主要因素有： (1)pH值当pH值为8.0～8.4时(20℃)，硝化作用速度最快。
由于硝化过程中pH将下降，当废水碱度不足时，即需投加石灰，维持pH值在7.5以上； (2)温度温度高时，硝化速度快。亚硝酸盐菌的最适宜水温为35℃，在15℃以下其活性急剧降低，故水温以不低于15℃为宜； (3)污泥停留时间硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为＝0.3～0.5d-1(温度20℃，pH8.0～8.4)。为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间。在实际运行中，一般应取＞2 ； (4)溶解氧氧是生物硝化作用中的电子受体，其浓度太低将不利于硝化反应的进行。一般，在活性污泥法曝气池中进行硝化，溶解氧应保持在2～3mg/L以上； (5)BOD负荷硝化菌是一类自养型菌，而BOD氧化菌是异养型菌。若BOD5负荷过高，会使生长速率较高的异养型菌迅速繁殖，从而佼白养型的硝化菌得不到优势，结果降低了硝化速率。所以为要充分进行硝化，BOD5负荷应维持在0.3kg(BOD5)/kg(SS).d以下。 (二) 反硝化 在缺氧条件下，由于兼性脱氮菌(反硝化菌)的作用，将NO2--N和NO3--N还原成N2的过程，称为反硝化。反硝化过程中的电子供体(氢供体)是各种各样的有机底物(碳源)。以甲醇作碳源为例，其反应式为： 6NO3-十2CH3OH→6NO2-十2CO2十4H2O 6NO2-十3CH3OH→3N2十3CO2十3H2O十60H-
硝化与反硝化池
■K硝化池 反硝化池主要是去除废水中的氨氮，同时降解废水中其他的污染物质。 反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N）或一氧化二 氮（NO）的过程。微生物和植物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO —NH+f有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。另一用途是利用N02和NO 为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（2）,称为反硝化作用或脱氮作用：NO —NO-NT。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： GH2Q+12NO—6HO+6C312NO+能量 CHCOOH+8N e6H2O+1OC04N+8OF+ 能量 少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。可进行以下反应： 5S+6KNO2HX 3N2+K2SO+4KHSO ■硝化池 这里的硝化主要是指生化处理工艺段的好养段，将氨氮氧化成亚硝酸氮或者 硝态氮的过程。由于污水氨氮较高。 该反应历程为： 亚硝化反 应］' （2-6） 硝化反 N~O2~-h-02 (2-7)
总反应 亚硝酸菌有亚硝酸单胞菌属、 亚硝酸螺杆菌属和亚硝酸球菌属。 硝酸菌有硝 酸杆菌属、硝酸球菌属。亚硝酸菌和硝酸菌统称为硝化菌。 发生硝化反应时细菌 分别从氧化NH -N 和NO 「-N 的过程中获得能量，碳源来自无机碳化合物，如 CO 3 一、HCO 、CO 等。假定细胞的组成为 GH 7NO ，则硝化菌合成的化学计量关系可表 示为： 亚硝化反 15CQ TlONO/ +3C 5H ?NO a +22H + +4巴0 硝化反 + NH. +10NO ； T + (2-10) 工艺中采用了两段硝化工艺设施。最大限度上降低生化手段降低氨氮的浓度, 同时减少其他污染物的浓度。 同时废水中的其他污染物质在两段反硝化 +硝化的过程中得到有效降解。 血 3 +202——NO,+ 屮 + (2-8) (2-9)
(推荐)硝化菌的培养方法
硝化菌的培养方法 硝化反应影响因素： 1、温度在生物硝化系统中，硝化细菌对温度的变化非常敏感，在5～35℃的范围内，硝化菌能进行正常的生理代谢活动。当废水温度低于15℃时，硝化速率会明显下降，当温度低于10℃时已启动的硝化系统可以勉强维持，硝化速率只有30℃时的硝化硝化速率的25%[1]。尽管温度的升高，生物活性增大，硝化速率也升高，但温度过高将使硝化菌大量死亡，实际运行中要求硝化反应温度低于３８℃[2]。 2、pH值硝化菌对pH值变化非常敏感，最佳pH值是8.0～8.4，在这一最佳pH值条件下，硝化速度，硝化菌最大的比值速度可达最大值。Anthonison认为pH对硝化反应的影响只是表观现象，实际起作用是两个平衡H++NH3 = NH4+和H++NO2-= HNO2中的NH3（FA）和HNO2（FNA），pH通过这两个平衡影响FA和FNA的浓度起作用的。 3、溶解氧氧是硝化反应过程中的电子受体，反应器内溶解氧高低，必将影响硝化反应得进程。在活性污泥法系统中，大多数学者认为溶解氧应该控制在1.5～2.0mg/L内，低于0.5mg/L则硝化作用趋于停止。当前，有许多学者认为在低DO（1.5mg/L）下可出现SND现象。在DO＞2.0mg/L，溶解氧浓度对硝化过程影响可不予考虑。但DO浓度不宜太高，因为溶解氧过高能够导致有机物分解过快，从而使微生物缺乏营养，活性污泥易于老化，结构松散。此外溶解氧过高，过量能耗，在经济上也是不适宜的。 4、生物固体平均停留时间（污泥龄）为了使硝化菌群能够在连续流反应器系统存活，微生物在反应器内的停留时间（θc）N必须大于自养型硝化菌最小的世代时间（θc）minN，否则硝化菌的流失率将大于净增率，将使硝化菌从系统中流失殆尽。一般对（θc）N的取值，至少应为硝化菌最小世代时间的2倍以上，即安全系数应大于2。 5、重金属及有毒物质除了重金属外，对硝化反应产生抑制作用的物质
硝化与反硝化
硝化：在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。反应过程如下： 亚硝酸盐菌： 向左转|向右转 接着亚硝酸盐转化为硝酸盐： 向左转|向右转 这两个反应式都是释放能量的过程，氨氮转化为硝态氮并不是去除氮而是减少它的需氧量。上诉两式合起来写成： 向左转|向右转 综合氨氧化和细胞体合成反应方程式如下： 向左转|向右转
上式可知：(1)在硝化过程中，1g氨氮转化为硝酸盐氮时需氧4.57g；(2)硝化过程中释放出H+，将消耗废水中的碱度，每氧化lg氨氮，将消耗碱度(以CaCO3计) 7.lg。 影响硝化过程的主要因素有： (1)pH值当pH值为8.0～8.4时(20℃)，硝化作用速度最快。由于硝化过程中pH将下降，当废水碱度不足时，即需投加石灰，维持pH值在7.5以上； (2)温度温度高时，硝化速度快。亚硝酸盐菌的最适宜水温为35℃，在15℃以下其活性急剧降低，故水温以不低于15℃为宜； (3)污泥停留时间硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为＝0.3～ 0.5d-1(温度20℃，pH8.0～8.4)。为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间。在实际运行中，一般应取＞2 ； (4)溶解氧氧是生物硝化作用中的电子受体，其浓度太低将不利于硝化反应的进行。一般，在活性污泥法曝气池中进行硝化，溶解氧应保持在2～3mg/L以上； (5)BOD负荷硝化菌是一类自养型菌，而BOD氧化菌是异养型菌。若BOD5负荷过高，会使生长速率较高的异养型菌迅速繁殖，从而佼白养型的硝化菌得不到优势，结果降低了硝化速率。所以为要充分进行硝化，BOD5负荷应维持在0.3kg(BOD5)/kg(SS).d以下。
硝化与反硝化
硝化与反硝化 利用好氧颗粒污泥实现同步硝化反硝化 1 生物脱氮与同步硝化反硝化 在生物脱氮过程中，废水中的氨氮首先被硝化菌在好氧条件下氧化为NO-X，然后NO-X 在缺氧条件下被反硝化菌还原为N2(反硝化)。硝化和反硝化既可在活性污泥反应器中进行，又可在生物膜反应器中进行，目前应用最多的还是活性污泥法。硝化菌和反硝化菌处在同一活性污泥中，由于硝化菌的好氧和自养特性与反硝化菌的缺氧和异养特性明显不同，脱氮过程通常需在两个反应器中独立进行(如Bardenpho、UCT、双沟式氧化沟工艺等)或在一个反应器中顺次进行(如SBR)。当混合污泥进入缺氧池(或处于缺氧状态)时，反硝化菌工作，硝化菌处于抑制状态；当混合污泥进入好氧池(或处于好氧状态)时情况则相反。显然，如果能在同一反应器中使同一污泥中的两类不同性质的菌群(硝化菌和反硝化菌)同时工作，形成同步硝化反硝化(Simultaneous Nitrification Denitrification简称SND)，则活性污泥法的脱氮工艺将更加简化而效能却大为提高。此外从工程的角度看，硝化和反硝化在两个反应器中独立进行或在同一个反应器中顺次进行时，硝化过程的产碱会导致OH-积累而引起pH值升高，将影响上述两阶段反应过程的反应速度，这在高氨氮废水脱氮时表现得更为明显。但对SND工艺而言，反硝化产生的OH-可就地中和硝化产生的H+，减少了pH值的波动，从而使两个生物反应过程同时受益，提高了反应效率。 2 实现同步硝化反硝化的途径 由于硝化菌的好氧特性，有可能在曝气池中实现SND。实际上，很早以前人们就发现了曝气池中氮的非同化损失(其损失量随控制条件的不同约在10%～20%左右)，对SND的研究也主要围绕着氮的损失途径来进行，希望在不影响硝化效果的情况下提高曝气池的脱氮效率。
硝化反应和反硝化反应
一、硝化反应 在好氧条件下，通过亚硝酸盐菌和硝酸盐菌的作用，将氨氮氧化成亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程，称为生物硝化作用。 硝化反应包括亚硝化和硝化两个步骤: NH4++1.5O 2 NO 2 -+H 2 O+2H+ NO 2-+0.5O 2 NO 3 - 硝化反应总方程式： NH 3+1.86O 2 +1.98HCO 3 - 0.02C 5 H 7 NO 2 +1.04H 2 O+0.98NO 3 --+1.88H 2 CO 3 若不考虑硝化过程硝化菌的增殖，其反应式可简化为 NH4++2O 2 NO 3 -+H 2 O+2H+ 从以上反应可知: 1)1gNH 4+-N氧化为NO 3 - 需要消耗2*50/14=7.14g碱（以CaCO 3 计) 2)将1gNH 4+-N氧化为NO 2 --N需要3.43gO 2 ,氧化1gNO 2 --N需要1.14gO 2 ，所以氧 化1gNH 4+-N需要4.57gO 2 。 硝化细菌所需的环境条件主要包括以下几方面： a.DO：DO应保持在2-3mg/L。当溶解氧的浓度低于0.5mg/L时，硝化反应过程 将受到限制。 b.PH和碱度：PH7.0-8.0，其中亚硝化菌6.0-7.5，硝化菌7.0-8.5。最适合 PH为8.0-8.4。碱度维持在70mg/L以上。碱度不够时，应补充碱 c.温度：亚硝酸菌最佳生长温度为35℃，硝酸菌的最佳生长温度为35～42℃。 15℃以下时，硝化反应速度急剧下降；5℃时完全停止。 d.污泥龄：硝化菌的增殖速度很小，其最大比生长速率为 0.3～0.5d-1(温度 20℃，pH8.0～8.4)。为了维持池内一定量的硝化菌群，污泥停留时间必须大于硝化菌的最小世代时间。对于实际应用中，活性污泥法脱氮，污泥龄一般11～23d。 e.污泥负荷：负荷不应过高，负荷宜0.05-0.15kgBOD/(kgMLSS·d)。因为硝化 菌是自养菌，有机物浓度高，将使异养菌成为优势菌种。总氮负荷应≤ 0.35kgTN/(m3硝化段·d)，当负荷>0.43kg/(m3硝化段·d)时，硝化效率急剧 下降。
硝化与反硝化池
■反硝化池 反硝化池主要是去除废水中的氨氮，同时降解废水中其他的污染物质。 反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。微生物和植物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO3-→NH4+→有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。另一用途是利用NO2-和NO3-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（N2），称为反硝化作用或脱氮作用：NO3-→NO2-→N2↑。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示：C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量 CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量 少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。可进行以下反应：5S+6KNO3+2H2O→3N2+K2SO4+4KHSO4 ■硝化池 这里的硝化主要是指生化处理工艺段的好养段，将氨氮氧化成亚硝酸氮或者硝态氮的过程。由于污水氨氮较高。 该反应历程为： 亚硝化反应 (2-6) 硝化反应 (2-7) 总反应式 (2-8)
亚硝酸菌有亚硝酸单胞菌属、亚硝酸螺杆菌属和亚硝酸球菌属。硝酸菌有硝酸杆菌属、硝酸球菌属。亚硝酸菌和硝酸菌统称为硝化菌。发生硝化反应时细菌分别从氧化NH3-N和NO2－-N的过程中获得能量，碳源来自无机碳化合物，如CO32－、HCO－、CO2等。假定细胞的组成为C5H7NO2，则硝化菌合成的化学计量关系可表示为： 亚硝化反应 (2-9) 硝化反应 (2-10) 工艺中采用了两段硝化工艺设施。最大限度上降低生化手段降低氨氮的浓度，同时减少其他污染物的浓度。 同时废水中的其他污染物质在两段反硝化+硝化的过程中得到有效降解。
硝化细菌的简介及研究思路
问题的提出 我国水体富营养化状况 我国是一个湖泊众多的国家，大于1 km2的天然湖泊就有2300多个，湖泊面积为70988 km2，约占全国陆地总面积的％。湖泊总蓄水量为7077多亿m3[1]。调查结果表明：2004年七大水系的412个水质监测断面中，I～III类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为％、％和％，七大水系主要污染指标为氨氮、五日生化需氧量、高锰酸盐指数和石油类[3]。 2004年监测的27个重点湖库中，II类水质的湖库2个，III类水质的湖库5个，Ⅳ类水质的湖库4个，Ⅴ类水质湖库6个，劣Ⅴ类水质湖库10个。其中，“三湖”（分别为太湖、巢湖和滇池）水质因总氮和总磷浓度高而均为劣Ⅴ类。太湖水质与上年比有所改善，但仍处于中度富营养化状态。滇池的草海属于中度富营养化，外海属重度富营养化。巢湖水质属中度富营养化。对于海洋环境，2004年全海域共发现赤潮96次，较上年减少23次。赤潮累计发生面积266630平方公里，较上年增加％，其中，大面积赤潮集中在东海。 目前，水体的富营养化已经成为我国最为突出的环境问题之一。许多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱阳湖、滇池和西湖等，都已经处于富营养或重度富营养化状态。而且一些河流在部分河段也出现了富营养化现象，如黄浦江流域、珠江广州河段等。据统计，我国主要湖泊处于因氮、磷污染而导致富营养化的占统计湖泊的56％[4]。因此，如何治理富营养化的水体，减少其中的营养物质的含量，回复水体的综合功能，已成为当前全球性的环境问题的研究热点[5]。 富营养化水体的微生物治理 针对水体富营养化现象，其水质改善及对策包括三个大的方面：污染源控制对策、水体生态修复对策以及应急除藻对策[6-8]。水体富营养化的关键与核心是生物多样性的破坏，其典型表现就是富营养化水体发生藻类“水华”现象[9]。因此，从保护和恢复生物多样性入手，引入微生物、植物和动物，尤其是关键物种，重建食物链结构，是恢复水体正常的主要手段之一[10-12]。为此经常用到的技术措施包括：以藻控藻，投加细菌微生物[13]、放养鱼类[14]，恢复与构建水生植被[15,16]等。 利用微生物种群的新陈代谢活动对富营养化水体中的有机污染物、氨氮和有机氮等进行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化－反硝化体系。而在自然界中，原本存在有专门从事硝化－反硝化过程中的微生物种群。但是由于某些微生物种群，如硝化细菌的代时较长，增殖速率非常低。同时，水体的人为活动的破坏。导致了富营养化水体中硝化－反硝化体系的弱化甚至缺失。故针对富营养化水体，可采用向水体中投加复合微生物菌群，从而增强水体的生物自净化能力，达到控制水体富营养化的目的，该技术被称之为“微生物强化技术”。该技术具有费用低、见效快、无污染和方便安全等特点。 复合微生物种群主要由光合细菌、硝化细菌等组成，再辅之以反硝化细菌。其中，光合细菌通过自身代谢与藻类竞争性争夺营养物质，并可降解、消除藻类代谢分泌于体外的多种物质，削弱藻类的竞争力。一般的光合细菌都有固氮能力，在厌氧光照条件下固氮能力最强。光合细菌与其他细菌的混合培养，能够提高其他细菌的固氮能力。另外，硝化细菌、反
硝化与反硝化去除氨氮的原理
硝化与反硝化去除氨氮的 原理 Prepared on 22 November 2020
硝化与反硝化去除氨氮操作 一、硝化与反硝化的作用机理： 1、硝化细菌包括亚硝化菌和硝化菌，亚硝化菌将废水中的NH3转化为亚硝酸盐，硝化菌将亚硝酸盐转化为硝酸盐，称为硝化作用。硝化作用必须通过这两类菌的共同作用才能完成。 2、反硝化菌将硝酸盐转化为N2、NO、N2O，称为反硝化作用。 3、硝化细菌必须在好氧条件下作用。 4、反硝化菌必须在无氧或缺氧的条件下进行。 二、作用方程式： 硝化反应： 2NH3＋3O2――（亚硝化菌）――2HNO2＋2H2O＋能量（氨的氧化） 2HNO2＋O2――（硝化菌）――2HNO3＋能量（亚硝酸的氧化） 反硝化反应： NO3— +CH3OH —— N2 + CO2+H2O+ OH—（以甲醇作为C源） 三、操作： 1、将购买的硝化菌投加到曝气池5、6#，亚硝化菌投加到曝气池1、 2、 3、4#，反硝化菌投加到厌氧池。 2、控制指标： 生物硝化 ①PH值：控制在— ②温度：25—30℃ ③溶氧：2—4mg/L
④污泥停留时间：必须大于硝化菌的最小世代时间，一般应大于2小时生物反硝化： ①PH值：控制在— ②温度：25—30℃ ③溶氧：L ⑤机碳源：BOD5/TN＞（3—5）过低需补加碳源
生物脱氮机理 污水生物脱氮的基本原理就是在将有机氮转化为氨态氮的基础上，先利用好氧段经硝化作用，由硝化细菌和亚硝化细菌的协同作用，将氨氮通过硝化作用转化为亚硝态氮、硝态氮，即，将转化为和。在缺氧条件下通过反硝化作用将硝氮转化为氮气，即，将（经反亚硝化）和（经反硝化）还原为氮气，溢出水面释放到大气，参与自然界氮的循环。水中含氮物质大量减少，降低出水的潜在危险性，达到从废水中脱氮的目的。 ○1硝化——短程硝化： 硝化——全程硝化（亚硝化+硝化）： ○2反硝化——反硝化脱氮： 反硝化——厌氧氨氧化脱氮： 反硝化——厌氧氨反硫化脱氮： 废水中氮的去除还包括靠微生物的同化作用将氮转化为细胞原生质成分。主要过程如下：氨化作用是有机氮在氨化菌的作用下转化为氨氮。硝化作用是在硝化菌的作用下进一步转化为硝酸盐氮。其中亚硝酸菌和硝酸菌为好氧自养菌，以无机碳化合物为碳源，从或的氧化反应中获取能量。其中硝化的最佳温度在纯培养中为25-35℃，在土壤中为30-40℃，最佳pH值偏碱性。反硝化作用是反硝化菌（大多数是异养型兼性厌氧菌， DO 硝化细菌的培养及作用 近年来，硝化细菌已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要性开始引起广泛的注意。可以说，迄今为止，在大规模、集约化的水产养殖模式中，如果没有硝化细菌参与其中的净水作用，想获得成功的养殖，是相当困难的。鱼、虾等水产动物吃、喝、排泄、生活、休息都是在水体中进行的，那么，如何管理水体的水质以便适合它的生长、生存、健壮就成了重要的问题。尤其是现代集约化养殖长期累积了大量养殖生物排泄物，所有有机物的排泄物，甚至其尸体，在异养性细菌的作用下，其中的蛋白质及核酸会慢慢分解，产生大量氨等含氮有害物质。氨在亚硝化菌或光合细菌作用下转化成亚硝酸，亚硝酸与一些金属离子结合以后可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。因此，亚硝酸盐常与恶名昭彰的氨相提并论，由于亚硝酸盐长期蓄积中毒，会使鱼、虾等抗病力降低，易招致各种病原菌的侵袭，故常被视为是鱼、虾的致病根源。然而，当亚硝酸在硝化菌的硝化作用下转变成硝酸后，很容易形成硝酸盐，从而成为可以被植物吸收利用的营养物质。所以说，硝化细菌与养殖环境的关系十分密切。 目前市面上宣称具有硝化作用的一些异养菌及真菌，虽然也能将氨氧化成硝酸盐，但通常只能利用有机碳源获取能量，不能利用无机碳源，其对氨的氧化作用十分微弱，反应速率远比自养性硝化细菌慢，不能被视为真正的硝化作用。 硝化作用必须依赖于自养性硝化细菌来完成。养殖池中有丰富的氮源，原本很适于硝化细菌生长，不过由于养殖池中存在大量的异养菌，受到异养性细菌的排斥作用，适合硝化细菌栖息的地方，相对自然环境显然少得多，因此无足够数量的自养性硝化细菌来消费过量的亚硝酸氮，这就是问题所在。 硝化细菌系指利用氨或亚硝酸盐作为主要生存能源，以及能利用二氧化碳作为主要碳源的一类细菌。硝化细菌是古老的细菌之一，其广泛分布于土壤、淡水、海水及污水处理系统中，却在自然界鲜少大量出现，原因在于硝化细菌的分布会受到许多环境因素的影响，如氮源、温度、氧气浓度、渗透压、酸碱度和盐度等等。 硝化细菌分为亚硝化菌与硝化菌，亚硝化菌的主要功能是将氨氮转化为亚硝酸盐；硝化菌的主要功能是将亚硝酸盐转化为硝酸盐。氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点，由于亚硝化菌的生长速度比较快且光合细菌也具有降解氨氮的作用，因此现代养殖已能成功地将氨氮控制在较低的水平上。而对于亚硝酸盐，由于自然界中的硝化菌生长极慢且还没有发现有其它的任何微生物可代替硝化菌的功能，所以养殖过程中产生的亚硝酸盐就成为阻碍养殖发展的关键因素。在此当中，硝化细菌就起到了关键的作用。 反硝化细菌和反硝化聚磷菌在污水处理中的运用 摘要：微生物法在污水处理过程中起到十分重要的作用。其中反硝化细菌与反硝化聚磷菌在污水处理中运用更为广泛，本文就对这两种细菌的研究情况作一些简单概述。 关键词：反硝化细菌；反硝化聚磷菌；自养反硝化；好氧反硝化 随着人类生活水平的不断提高和工业生产的快速发展，带来越来越严重的水质污染问题。寻求新的高效污水处理办法也是现在的一大研究方向，微生物处理法在污水处理中有着广泛的运用。本文着重介绍两种细菌：反硝化细菌和反硝化聚磷菌在污水处理中的一些运用。 一．反硝化细菌 反硝化细菌(Denitrifying bacteria) 是一类兼性厌氧微生物,当处于缺氧环境时,反硝化细菌可用硝酸盐、氮化物等作为末端电子受体。有些反硝化细菌能还原硝酸盐和亚硝酸盐,有些反硝化细菌只能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 反硝化细菌与污水除氮原理：污水中的含氮有机物经过异养菌的氨化作用转变为氨氮,再经过硝化细菌的硝化作用将氨氮转变为亚硝酸盐和硝酸盐态氮,最后经过反硝化细菌的反硝化作用将亚硝酸盐和硝酸盐还原为NO、N 2 O ,并最终变 为N 2 ,从而将含氮物质从污水处理系统中排出。当环境中有分子态氧存在时,反硝化细菌氧化分解有机物,利用分子态氧作为最终电子受体。在无分子态氧存在下,反硝化细菌利用硝酸盐和亚硝酸盐作为电子受体,有机物则作为碳源及电子供体提供能量。在污水处理中,当溶解氧(DO) 小于或等于0.15mgPL 情况下,反硝化细菌利用污水中的有机碳源(污水中的BOD) 作为氢供体,以硝酸态盐作为电子 受体,将硝酸盐还原为NO、N 2O 或N 2 ,这既可消除污水中的氮,又可恢复环境的pH 稳定性,对污水处理系统的正常运行起重要作用。在污水处理中反硝化细菌种类很多。 影响污水脱氮过程中反硝化反应的因素： 1.有机碳源：一般认为,当污水中的BOD 5 PT2N 值> 3～5 时,即可认为碳源是充足的,此时不需要补充外加碳源。甲醇作为碳源时反硝化速率高,被分解后的产物为 CO 2和 H 2 O ,但处理费用较高。污水处理系统中碳源的种类不同可导致反硝化细 菌的类群及反硝化活性不同。 硝化作用 nitrification 硝化细菌将氨氧化为硝酸的过程。19世纪以前，人们把硝酸盐看作是化学作用的产物，即空气中的氧和氨经土壤催化形成。1862年L.巴斯德首先指出硝酸盐的形成可能是微生物作用的结果。1877年，德国化学家T.施勒辛和A.明茨用消毒土壤的办法，证实了氨被氧化为硝酸的确是生物学过程。1891年，С.Н.维诺格拉茨基用无机盐培养基成功地获得了硝化细菌的纯培养，最终证实了硝化作用是由两群化能自养细菌进行的。先是亚硝化单胞菌将铵氧化为亚硝酸；然后硝化杆菌再将亚硝酸氧化为硝酸。这两群细菌统称硝化细菌。其作用过程如下： 硝化细菌从铵或亚硝酸的氧化过程中获得能量用以固定二氧化碳，但它们利用能量的效率很低，亚硝酸菌只利用自由能的5～14％；硝酸细菌也只利用自由能的5～10％。因此,它们在同化二氧化碳时，需要氧化大量的无机氮化合物。 土壤中硝化细菌的数量首先受铵盐含量的影响，一般耕地里，每克土中只有几千至几万个。添加铵盐即可使其数量增至几千万个。土壤中性偏碱，通气良好，水分为田间持水量的50～70％，温度为10～30℃时，最适宜硝化细菌的生长繁殖，铵盐也能迅速被转化为硝酸盐。 自然界中,除自养硝化细菌外,还有些异养细菌、真菌和放线菌能将铵盐氧化成亚硝酸和硝酸，异养微生物对铵的氧化效率远不如自养细菌高，但其耐酸，并对不良环境的抵抗能力较强，所以在自然界的硝化作用过程中，也起着一定的作用。 亚硝化反应 有机化合物分子中的氢被亚硝基(-NO)取代的反应。用亚硝酸做为亚硝化试剂，被强共轭给电子基团活化的苯环，例如酚、某些酚醚、萘酚、三级芳胺，在亚硝酸作用下，可发生亲电取代的亚硝化反应。由于亚硝酸很不稳定，所以亚硝化一般采用亚硝酸盐作为亚硝化剂。在反应中，先将反应物溶于酸(如盐酸、稀硫酸、醋酸)中，再将亚硝酸钠的水溶液逐滴加入到反应物中，使生成的亚硝酸立即与反应物作用。二级脂肪族胺和二级芳香族胺与亚硝酸反应，生成N-亚硝基二级胺。可用还原剂将亚硝基除掉，得回原来的 二级胺。利用此性质，可以提纯二级胺。一级胺在此反应条件下则发生重氮化反应。 反硝化作用（denitrification） 也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。微生物和植物吸收利用硝酸盐有两种完全不同的用途，一是利用其中的氮作为氮源，称为同化性硝酸还原作用：NO3-→NH4+→有机态氮。许多细菌、放线菌和霉菌能利用硝酸盐做为氮素营养。另一用途是利用NO2-和NO3-为呼吸作用的最终电子受体，把硝酸还原成氮（N2），称为反硝化作用或脱氮作用：NO3-→NO2-→N2↑。能进行反硝化作用的只有少数细菌，这个生理群称为反硝化菌。大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量 CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量 少数反硝化细菌为自养菌，如脱氮硫杆菌，它们氧化硫或硝酸盐获得能量，同化二氧化碳，以硝酸盐为呼吸作用的最终电子受体。可进行以下反应： 5S+6KNO3+2H2O→3N2+K2SO4+4KHSO4 反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利。农业上常进行中耕松土，以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。 好氧反硝化细菌的筛选 摘要：采集江安河及府河淤泥样本，采用btb培养基与n-（1- 萘基）-乙二胺光度法筛选出20株具有反硝化能力的好氧菌株。选取其中5株反硝化能力较强的dm1、dm2、dm3、dm4和dm5菌株，进行no3--n去除率测定，其48 h no3--n去除率均达到了30%以上。其中dm1、dm2、dm3和dm5菌株氮去除率依次为43.9%、47.6%、47.9%和51.3%。对dm5菌株进行生长曲线测定，进行ph值和温度对反硝化速率影响测定，试验结果表明在ph 7.0～7.4，温度20～30 ℃时，dm5菌株反硝化效果较好。 关键词：好氧；反硝化细菌；分离；反硝化效率 中图分类号：q936 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）05-1053-04 screening of aerobic denitrifying bacteria he wei，zhang yue-xiao，li yong-hong （college of chemical engineering， sichuan university，chengdu 610225， china） abstract： by using btb medium and n-（1-naphthyl） -ethylenediamine photometry， twenty aerobic strains that were capable of denitrification were isolated from the silt samples of jiang an river and fu river. being more capable，five individuals numbered as dm1， dm2， dm3， dm4 and dm5 of the above strains were selected to determine the nitrate 1.1 问题的提出 1.1.1 我国水体富营养化状况 我国是一个湖泊众多的国家，大于1 km2的天然湖泊就有2300多个，湖泊面积为70988 km2，约占全国陆地总面积的0.8％。湖泊总蓄水量为7077多亿m3[1]。调查结果表明：2004年七大水系的412个水质监测断面中，I～III类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为41.8％、30.3％和27.9％，七大水系主要污染指标为氨氮、五日生化需氧量、高锰酸盐指数和石油类[3]。 2004年监测的27个重点湖库中，II类水质的湖库2个，III类水质的湖库5个，Ⅳ类水质的湖库4个，Ⅴ类水质湖库6个，劣Ⅴ类水质湖库10个。其中，“三湖”（分别为太湖、巢湖和滇池）水质因总氮和总磷浓度高而均为劣Ⅴ类。太湖水质与上年比有所改善，但仍处于中度富营养化状态。滇池的草海属于中度富营养化，外海属重度富营养化。巢湖水质属中度富营养化。对于海洋环境，2004年全海域共发现赤潮96次，较上年减少23次。赤潮累计发生面积266630平方公里，较上年增加83.0％，其中，大面积赤潮集中在东海。 目前，水体的富营养化已经成为我国最为突出的环境问题之一。许多大型湖泊，如巢湖、太湖、鄱阳湖、滇池和西湖等，都已经处于富营养或重度富营养化状态。而且一些河流在部分河段也出现了富营养化现象，如黄浦江流域、珠江广州河段等。据统计，我国主要湖泊处于因氮、磷污染而导致富营养化的占统计湖泊的56％[4]。因此，如何治理富营养化的水体，减少其中的营养物质的含量，回复水体的综合功能，已成为当前全球性的环境问题的研究热点[5]。 1.1.2 富营养化水体的微生物治理 针对水体富营养化现象，其水质改善及对策包括三个大的方面：污染源控制对策、水体生态修复对策以及应急除藻对策[6-8]。水体富营养化的关键与核心是生物多样性的破坏，其典型表现就是富营养化水体发生藻类“水华”现象[9]。因此，从保护和恢复生物多样性入手，引入微生物、植物和动物，尤其是关键物种，重建食物链结构，是恢复水体正常的主要手段之一[10-12]。为此经常用到的技术措施包括：以藻控藻，投加细菌微生物[13]、放养鱼类[14]，恢复与构建水生植被[15,16]等。 利用微生物种群的新陈代谢活动对富营养化水体中的有机污染物、氨氮和有机氮等进行去除，尤其是氮污染物的去除，主要需要建立硝化－反硝化体系。而在自然界中，原本存在有专门从事硝化－反硝化过程中的微生物种群。但是由于某些微生物种群，如硝化细菌的代时较长，增殖速率非常低。同时，水体的人为活动的破坏。导致了富营养化水体中硝化－反硝化体系的弱化甚至缺失。故针对富营养化水体，可采用向水体中投加复合微生物菌群，从而增强水体的生物自净化能力，达到控制水体富营养化的目的，该技术被称之为“微生物强化技术”。该技术具有费用低、见效快、无污染和方便安全等特点。 复合微生物种群主要由光合细菌、硝化细菌等组成，再辅之以反硝化细菌。其中，光合细菌通过自身代谢与藻类竞争性争夺营养物质，并可降解、消除藻类代谢分泌于体外的多种物质，削弱藻类的竞争力。一般的光合细菌都有固氮能力，在厌氧光照条件下固氮能力最 一株自养硝化细菌培养条件的优化 摘要：针对前期筛选的自养硝化杆菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）测定的菌液终浓度为指标，设计单因素试验和正交试验对其培养基和培养条件进行优化。结果表明，优化的硝化杆菌y3-2的培养基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2浓度分别为0.5、1.0、0.5 g/L。最佳培养条件为培养温度28 ℃、pH 8.0、摇床转速200 r/min。优化后硝化杆菌y3-2的发酵周期由优化前的7 d缩短至4 d，菌液终浓度达到4.31×109 CFU/mL。 关键词：硝化杆菌（Nitrobacter）；培养基；培养条件；优化 氮素是水体污染源的主要成分之一，水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。与传统的物理化学脱氮工艺相比，生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化—反硝化工艺，其中的硝化工艺由硝化细菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。硝化过程通常由氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先将氨氮转化为亚硝酸盐，然后由亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。与自养型AOB 一样，自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点，这一方面使NOB 的研究较为困难，另一方面也制约了其工业化生产和应用。因此，研究加快NOB 生长速度的培养方法显得尤为重要[5，6]。本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株，对其培养基和培养条件进行了优化，并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）计数的方法对其菌液浓度进行计数，以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏，经16 S rDNA鉴定为硝化杆菌属（Nitrobacter）细菌。 1.1.2 优化前培养基及培养条件优化前初始培养基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、无水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min灭菌。优化前的培养条件为250 mL三角瓶加入50 mL培养基，200 r/min、30 ℃恒温培养。 1.1.3 试剂亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]：Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺—硫酸试剂，细菌基因组DNA提取试剂盒和Real Master硝化细菌的培养及作用
环境微生物作业,硝化,反硝化细菌
硝化和反硝化
好氧反硝化细菌的筛选
硝化细菌的简介及研究思路
一株自养硝化细菌培养条件的优化