病毒的细胞培养
病毒的细胞培养
病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒的培养。SPF动物及SPF鸡胚是目前常用的培养载体。
一．细胞培养的特点
20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养，得以应用于病毒学研究、诊断及疫苗制备等方面。
细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异，而且可以用于实验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可以在无菌的条件下进行标准化的实验，可重复性良好。
感染病毒的细胞可以通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可以结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。
细胞培养的重要用途之一就是从感染的动物体内分离病毒以及病毒克隆。从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。
二．细胞培养的类型
1.原代细胞：动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个的细胞，再生长于培养器
皿中。大多数组织均可制备原代细胞，但生长的速度及难易程度不等。肾和睾丸最
为常用，甲状腺细胞生长缓慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性胃肠炎病毒的培
养。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。最好用SPF
动物的组织，以免携带潜伏的病毒，会影响所需病毒的生长，甚至造成灾难性的后
果。
2.二倍体细胞株：将长成的原代细胞分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体
数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可以扩大，对病毒的易感性则基本
无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。但巨噬细胞、神经细胞等
体外培养一般不分裂，很难获得二倍体细胞株。
3.传代细胞系：与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制的分裂，亦可无限制
的传代。有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。传代
及培养方便是其优点，因此使用广泛。缺点是有的对分离野毒（即样本中的病毒）不敏感。因在实验室传代时间长，有的可能污染霉形体或者隐形感染的病毒，应予
注意。由于担心致肿瘤的潜在危险，传达细胞系一般不能用于制备疫苗。
病毒的细胞培养
病毒的细胞培养 病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒的培养。SPF动物及SPF鸡胚是目前常用的培养载体。 一．细胞培养的特点 20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养，得以应用于病毒学研究、诊断及疫苗制备等方面。 细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异，而且可以用于实验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可以在无菌的条件下进行标准化的实验，可重复性良好。 感染病毒的细胞可以通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可以结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。 细胞培养的重要用途之一就是从感染的动物体内分离病毒以及病毒克隆。从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。 二．细胞培养的类型 1.原代细胞：动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个的细胞，再生长于培养器 皿中。大多数组织均可制备原代细胞，但生长的速度及难易程度不等。肾和睾丸最 为常用，甲状腺细胞生长缓慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性胃肠炎病毒的培 养。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。最好用SPF 动物的组织，以免携带潜伏的病毒，会影响所需病毒的生长，甚至造成灾难性的后 果。 2.二倍体细胞株：将长成的原代细胞分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体 数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可以扩大，对病毒的易感性则基本 无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。但巨噬细胞、神经细胞等 体外培养一般不分裂，很难获得二倍体细胞株。 3.传代细胞系：与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制的分裂，亦可无限制 的传代。有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。传代 及培养方便是其优点，因此使用广泛。缺点是有的对分离野毒（即样本中的病毒）不敏感。因在实验室传代时间长，有的可能污染霉形体或者隐形感染的病毒，应予 注意。由于担心致肿瘤的潜在危险，传达细胞系一般不能用于制备疫苗。
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养 一. 实验目得 了解倒置显微镜得构造与使用，了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特 征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接利方法及收毒方法。 二、常用细胞得种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela ：人得子宫瘤细胞 Ver 。：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero 细胞 TK-143:人得胸昔激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、lOOml 细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 BHK-21 (baby hamster kidney)细胞 生长液:含10%犊牛血清、200U/inl 青、链霉素得DMEM 2、 3、 0、25%胰酶 4、
维持液:含2-5%犊牛血清、200U/inl青、链霉素得DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV) 四.传代细胞培养得条件要求 1)细胞密度:2-3X105个/ml 2)pH 范围最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、8 3)培养温度 哺乳动物细胞一般为37°C 昆虫细胞28-3(rC 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得竣基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导 致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合■从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶川I灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋口酶、氨肽酶与竣肽 酶得混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嚓吟、陀唏、辅助生长因子。 2、血清 1)血清得种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
实训八 病毒的鸡胚接种技术
实训八病毒的鸡胚接种技术 目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。 仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。 方法与步骤（实验视频六） （一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。 发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。 （二）接种前的准备 病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。 照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。 （三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。 （四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。 绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。 注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。 思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？ 2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？ 1
细胞培养与病毒培养实验步骤
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela :人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9 :昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21 (baby hamster kidney )细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV
四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3 x 105个/ml 2）p H范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37C 昆虫细胞28-30 C 五、常用细胞分散剂与作用原理 1 、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质 水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA :与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。 六、营养液 1 、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1 ）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30min 3）血清的作用
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒 令狐采学 一、所需试剂 1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年） （1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分 （2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分 （3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因. 三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。 2、包装细胞：293T细胞 3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒 4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物 5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌 **也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，
4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml 6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml） 7、无血清培养基：optimen 8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞） 9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞 二、具体步骤 <一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转） 第一天 1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜 2、配制5X PEG8000/NaCl溶液 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃ 第二天 1、配管 A+B混合室温静置20min
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1）几乎可以感染所有类型的细胞
病毒感染细胞实验整体流程及原理最新版
病毒感染细胞实验整体流程及原理 杨晓芳于2011年5月11日整理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 （一）鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。 3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： （1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 （2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 （3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 （4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 （二）各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 （1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL 新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。收获前将鸡胚置于0～4 ℃冰箱中冷藏4 h 或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.5～2.0 cm 的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得5～6 mL ，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 （3）消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min ，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min 。 2.卵黄囊接种法 （1）接种方法 选用6～8日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm ，向卵黄囊内注入0.1～0.5 mL 病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化3～7 d （实图6-22）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 ℃冰箱冷冻保存。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养 一、目的要求 掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。 二、器材 1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。 2.接种材料新城疫I系疫苗 3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。 三、内容和方法 （一）接种前的准备 1.鸡胚的准备 本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。 2.病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1
小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。 （二）接种 绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。（三）收获 新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存
(整理)传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养.
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如 并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经 元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、慢病毒和腺病毒的比较
2、构建目的基因到载体 构建手段 质粒载体 概念 能够进行自主复制的环状DNA 双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体） 特征 质粒上常有抗生素的抗性基因， (episome) 质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过
个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。(为了扩增DNA) 3、质粒DNA在大肠杆菌里转化 连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。(为什么不进行PCR，因为不能做。) 大肠杆菌感受态细胞的制备 1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。 2）取菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h 3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 4）4℃离心10min（4000r/min） 5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽 6）用冰浴的悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min 7）4℃离心10min（4000r/min） 8）倒出上清液，用冰浴的L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4℃保存 质粒DNA的转化 1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min 2）离心管放到42℃保温90s