志贺毒性大肠杆菌 (STEC) 的临床实验室检验
志賀毒性大腸桿菌(STEC)的臨床實驗室檢驗
陳星宇1孫俊仁2*
1台北市立聯合醫院仁愛院區
2三軍總醫院臨床病理科
人類如果感染志賀毒性大腸桿菌 (shiga toxin–producing Escherichia coli ,STEC)會造成嚴重腹瀉。即時且適當的診治可以減少病人併發嚴重腎臟疾病及改善病人預後。所以實驗室如何正確診斷志賀毒性大腸桿菌就很重要。以群聚感染爆發與感染控制的角度而言，實驗室必須能區分所流行的志賀毒性大腸桿菌血清型。本篇文章為介紹臨床實驗室診斷志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程。此流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗。在台灣，志賀毒性大腸桿菌所造成的群聚感染並不常見，主要是跟我們熟食的飲食習慣有關。但隨著生食主義及生機飲食的盛行，志賀毒性大腸桿菌感染的風險也相對提高。臨床實驗室了解如何快速檢測志賀毒性大腸桿菌感染就顯得格外重要。
關鍵詞：志賀毒性大腸桿菌、志賀毒素
志賀毒性大腸桿菌
(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)簡介
志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)泛指會產生志賀毒素(shiga toxin)的大腸桿菌[1-3]。大腸桿菌的分型主要依據O抗原及H抗原進行血清分型。O抗原為表面抗原(Somatic Ag)而H抗原則為鞭毛抗原(Flagellar Ag)。STEC亦可以專一性抗血清針對其表面抗原及鞭毛抗原進行分型。舉例來說，STEC下最有名的E. coli O157:H7，別名為STEC O157:H7表示其所攜帶的表面抗原為O 157，而其所攜帶的鞭毛抗原為H7，並且可以產生志賀毒素。STEC 在分類上可以區分成O157 STEC及Non-O157 STEC 兩類。常見的STEC感染症主要是感染 E. coli O157:H7。但是至少還有150種STEC血清型證實與群聚感染或是人類疾病有關，這些血清型別可以被歸類為non-O157 STEC。在美國地區non-O157 STEC感染症與六株non-O157血清型(O26, O45, O103, O111, O121及O145)較為相關[4, 5]。志賀毒素的命名最早是因為其毒素結構與功能類似於Shigella dystenteriae 所分泌之Shigella dystenteriae type 1[6]。目前常見的Shiga toxin可以分成兩大類，分別為Shiga toxin 1 (Stx1)及Shiga toxin 2(Stx2) [7, 8]。其他常見名稱像是verocytotoxigenic E. coli則是指其所分泌的志賀毒素會使Vero細胞株產生細胞病變現象。因其會造成人類疾病主要是以腸道出血，所以又稱為enterohemorrhagic E. coli。STEC感染主要會造成急性腹瀉(diarrhea)，此外約8%病人在感染後會出現溶血性尿毒症候群(hemolytic uremic syndrome, HUS)的症狀。其他嚴症狀像是血小板減少症(thrombocytopenia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)及腎衰竭(renal failure)等症狀。如果臨床上觀察到血栓性血小板低下性紫斑症(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)或是溶血性尿毒症候群伴隨腹泄癥候，則必須要懷疑為STEC感染[9, 10]。但是，並非每個感染STEC病人都會出現溶血性尿毒症候群，出現症狀輕重與否與菌種毒性及宿主免疫力有直接關係。而HUS 症狀則是無論是O157 STEC亦或是non-O157 STEC皆有可能造成[10]。STEC造成的感染症主要是因為食用被STEC所污染過的食物(未煮熟的絞肉、受汙染的果汁、生菜及牛奶)、飲用
收稿日期：100年10月12日
通訊作者：孫俊仁三軍總醫院臨床病理科 台北市內湖區成功路2段325號臨床病理科
電話：886-2-87923311 ext 88092 傳真：886-2-87927226 電子郵件：sun3342@https://www.360docs.net/doc/1015082981.html, 綜 論
志賀毒性大腸桿菌的檢驗
水及與環境動物接觸或經由幼兒照護而傳染給幼兒。根據文獻指出只要感染約100個O157 STEC病原菌即會出現症狀，但是其他的血清型並未有相關文獻報導。有文獻指出使用抗生素治療STEC感染症，將會提高腎臟疾病的發生機率，並且增加併發嚴重副作用的風險[2]。所以實驗室快速且正確診斷出STEC，將有助於臨床更改治療模式及避免使用抗生素以改善病人預後。若實驗室能進一步快速鑑別診斷STEC血清型，將可避免病菌爆發群聚感染及後續感控措施的規畫。所以，實驗室如何即時檢驗及診斷STEC的感染症將是一個重要的課題[10]。
臨床實驗室檢驗流程
臨床實驗室進行STEC菌株之檢驗最好的檢體是腹瀉檢體(diarrheal stool)，腹瀉檢體的採集最好是在病人意識清楚且未使用抗生素前採集。實驗室建議操作流程參照圖1。腹瀉檢體採集後應儘快送往實驗室進行後續檢驗工作，檢體同時進行兩個不同檢驗流程，一為偵測志賀毒素：可以利用腹瀉檢體直接進行志賀毒素檢驗，確認檢體中是否有志賀毒素存在。但臨床腹瀉檢體中的志賀毒素可能會因為較少而容易發生偽陰性的情況，所以實驗室如果偵測結果為陰性，則可再將這檢體接種於液態培養基進行增菌培養，第二天再以液態培養基偵測確認是否有志賀毒素存在[11]。二為細菌培養：實驗室必須先操作臨床常見腸道腹瀉相關致病菌的培養(例如：沙門氏菌Salmonella、痢疾桿菌Shigella及彎曲桿菌Campylobacter )，以排除非其他病原菌所造成的腹瀉。接著必須將檢體接種於對STEC具有專一性篩選的培養基，第二天於篩選培養基上篩選懷疑是STEC菌落，再與STEC專一性抗體進行凝集反應確認是否為STEC。如果菌落與抗體產生凝集反應，則必須以傳統生化反應或自動鑑定儀器確認該菌落為大腸桿菌。則此大腸桿菌即為會產生志賀毒素的大腸桿菌。以下流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗[2]。簡述如下：
檢體採集與運送
圖1 志賀毒性大腸桿菌檢驗流程
檢體採集完成後，宜儘快送往細菌室進行後續相關檢驗工作。目前市面上有販賣之的商業套組所偵測標靶為噬菌體(phage)所攜帶的志賀毒素。如果檢體放置時間過久，可能會發生噬菌體溶解細菌而造成細菌死亡，毒素標靶將會消失不見而使志賀毒素結果為偽陰性[12]。檢體如果無法馬上送往細菌室則建議把檢體進行冷凍保存並應該在24小時內進行相關檢驗工作，如果運送過程中有使用運送專用培養基(transport medium)進行運輸，則建議在48小時內進行檢測。運送培養基必須選擇可以支持腸道細菌生長的運送培養基，例如：Cary-Blair運送液就是不錯的選擇。實驗室如果要直接以腹瀉檢體偵測志賀毒素，則不建議將檢體加入運送培養基運送以避免稀釋檢體中的志賀毒素。
以培養方法偵測STEC
根據前面所言，STEC可以區分成O157 STEC及non- O157 STEC兩大類，這兩大類在培養流程及鑑定程序上有極大差異。在臨床醫學實驗室主要會遭遇的最大威脅為O157 STEC。所以，實驗室所建立的培養鑑定流程應以O157 STEC為主。一般大腸桿菌則為可以發酵山梨糖醇，但O157 STEC具有不會發酵山梨糖醇(sorbitol)[8]。O157 STEC的培養可以直接將檢
體接種在含有山梨糖醇的培養基培養進行篩檢，像是sorbitol-MacConkey agar (SMAC)、cefixime tellurite- sorbitol MacConkey agar (CT-SMCA)或CHROMagar O157[13]。培養基體在經過37℃進行培養16-24小時後，在SMAC 或CT-SMCA 會出現無色菌落，但是如果選用CHROMagar O157培養基則會出現淡紫色或是粉紅色菌落。接著選取單一菌落與O157-抗血清或乳膠試劑進行凝集反應。倘若選取的菌落與O157-抗血清或乳膠試劑產生凝集反應且不與正常血清或是對照組進行反應，則可以初步認定所該菌株為O157 STEC 。根據美國疾病管制局(Center for Disease Control and Prevention; CDC)建議，操作者至少須測試三個單一疑似菌落，若O157 STEC 在任何一個菌落偵測為陽性，則確定為陽性[2]。為避免因為其他細菌會與O157抗血清產生交互反應，所以這偵測為陽性的菌落則必須次培養至SMAC 或是其他非選擇性培養基，並依實驗室鑑定流程鑑別為大腸桿菌。後續鑑定為大腸桿菌，需耗時24小時以上，所以，當一發現O157 STEC 抗血清凝集則必須先行通報臨床醫師。但是必須在完成O157 STEC 菌落分離並且與O157抗體凝集最後再以生化反應確認為大腸桿菌，才可以確診為O157 STEC 。Non- O157 STEC 的培養鑑定通常執行的單位為食品、公衛相關實驗室為主。Non-O157 STEC 對人類依然具有致病能力與爆發大流行的可能，因其血清型相當的繁多且皆對山梨糖醇與乳糖皆具有發酵能力，所以其篩檢在臨床微生物實驗室較為不易[10]。Non-O157 STEC 建議篩選流程主要為先將檢體接種於液態培養基進行增菌培養接著偵測液態培養基中的志賀毒素。如果偵測結果為陽性則必須分離至低選擇性的培養基進行篩檢(例如：MacConkey agar, SMAC, Statens Serum Institut [SSI] enteric me-dium, or blood agar)。所有可能為STEC 菌落必須先以O157 抗體偵排除O157 STEC 則再利用其他偵測O 抗原之商業套組偵測STEC 的型別[2]。
非培養方法偵測STEC
臨床上培養STEC 較為耗時且篩選過程較為繁瑣，且只有O157 STEC 可以利用山梨糖醇選擇性培養基進行篩檢。所以微生物實驗室可以建置非培養方
表1 各偵測志賀毒性大腸桿菌之方法學比較
方法學
原理 優點 缺點 以培養方法偵測STEC
O157 STEC 專一性培養基 O157 STEC 不會發酵山梨糖醇，培養基中含有山梨糖醇即可與一般大腸桿菌區分
可以得到單一菌落進行確認試驗 無法鑑別其他Non-O157 STEC
非培養方法偵測STEC
1.商業產品有FDA 認可，可以即時偵測1.需要儀器進行偵測 酵素免疫法 (enzyme immunoassay, EIA) 利用專一性抗體偵測志賀毒素
2.可以偵測其他Non-O157 STEC 2.無法區分血清型
1.敏感度極高 1.需要細胞培養技術並且過程耗時
細胞毒殺試驗 (Cell Cytotoxicity Assay)
志賀毒素對Vero 細胞株及HeLa 細胞株具有毒殺作用 2.可用志賀毒素中和抗體確認 2.無法區分血清型
目前尚未有FDA 認可及應用於臨床檢體 磁性抗體免疫磁珠分離法 (Immunomagnetic separation 、IMS) 利用在免疫磁珠上標定O 抗體專一性抓取O 抗原，最後再用磁鐵抓取免疫磁珠與檢體分離 1.可以得到較高濃度的病菌並初步純化2.可以區分血清型
1.可以即時偵測並分血清型
2.廣泛應用於食品篩檢
目前尚未有FDA 認可的商業套組
核酸增幅檢驗
(nucleic acid amplification test,NAAT)
以PCR 技術為以偵測DNA 為基礎的檢驗方法
志賀毒性大腸桿菌的檢驗
式先偵測志賀毒素或分子診斷技術偵測相關基因進行即時診斷STEC，目前常見的幾種方法介紹如下：
酵素免疫法(enzyme immunoassay, EIA)
非培養方式鑑別STEC的方法最常建議使用的方法以酵素免疫法偵測志賀毒素。目前市面上已有多款偵測志賀毒素的商業套組，經過美國FDA認可而微生物實驗室可以直接運用於臨床病人檢體[2, 5]。偵測志賀毒素的酵素免疫法方法最早發展於西元1995年，其最大優點為可以偵測出所有攜帶志賀毒素的STEC。酵素免疫法最大優點為可以即時偵測且比培養法快速，其缺點在於無法分離單一菌株出且無法進行後續血清型別鑑定與流行病學追蹤[5]。這方法亦會針對Shigella dysenteriae type 1所分泌的Stx1產生作用而發生偽陽性。志賀毒素在病人腹瀉糞便中的含量相當少，所以可以藉由液體培養基經過增菌來提高偵測的陽性率及敏感度。實驗室如果偵測到含有志賀毒素陽性檢體，則必須及時通報治療醫師及感染管制單位進行後續治療與追蹤。
細胞毒殺試驗(Cell Cytotoxicity Assay)
Vero細胞株及HeLa細胞株因為其表面具有高量的志賀毒素接受體globotriaosylceramides Gb3及Gb4，所以志賀毒素對細胞株具有細胞毒殺能力[2, 14]。吾人可以將病人糞便亦或將懷疑的細菌經過液體培養基增菌培養後再將這液體通過過濾膜去除細菌收集無菌液體，接著將液體接種於細胞培養液中觀察是否有細胞毒殺現象出現。如果出現細胞毒殺現象，則表示檢體中具有對細胞有害的物質。接著要確認細胞毒殺現象是否為Stx1及Stx2所引起，可以再選用anti-Stx 1及anti-Stx 2抗體與液體作用進行中和反應作確認[15]。這方法的優點為偵測志賀毒素非常敏感，而其缺點為需要純熟的細胞培養技術與環境。這方法耗時需要約48至72小時，所以不建議臨床微生物實驗室採用[16]。
磁性抗體免疫磁珠分離法(Immunomagnetic separation、IMS)
磁性抗體免疫磁珠分離法的原理為利用在免疫磁珠上標定特定STEC的O抗體，接著將檢體與免疫磁珠混合。免疫磁珠會去專一性抓取O抗原，最後再用磁鐵抓取免疫磁珠與檢體分離[17]。藉此方法可以得到較高濃度的病菌並且可以初步純化。目前已有商業套組針對O26, O103, O111, O145, or O157設計抗血清可以提供抓取相關細菌。但是這方法目前亦尚未有FDA認可而可以應用於人類檢體。目前亦有發表文獻指出可以利用此技術而後搭配聚合連鎖反應進行即時鑑定STEC，但是只初步應用於食品檢驗並未應用於人類腹瀉檢體[18, 19]。
核酸增幅檢驗(nucleic acid amplification test, NAAT)
核酸增幅檢驗主要是以聚合連鎖反應(PCR)技術為以偵測病菌DNA為基礎的檢驗方法。這方法目前並沒有相關商業套組通過FDA認可而可運用於臨床病人檢體。但是，核酸增幅檢驗廣泛運用於許多食品篩檢、公衛調查實驗室進行確診STEC[5]。實驗室最常所選用的標靶為stx1 及stx2 基因[20]。除了stx1 及stx2 基因常被利用作為偵測標靶外，其他像是選用毒力因子(例如：intimin及enterohemolysin)亦可作為進一步區分O血清型[18]。亦有作者發展利用O抗原出利用即時聚合連鎖反應(Real-time PCR)搭配複數引子對(multiple primers)可以偵測數種臨床常見的STEC。
[21]。目前有其他文獻指出可以選用糞便檢體、增菌的液態培養基及固態培養基上的懷疑菌落萃取DNA 進行PCR檢測，但是直接選用糞便檢體萃取DNA進行PCR檢測的敏感度較差[22]。
台灣臨床微生物實驗室是否應該常規篩檢
STEC
在2009年10月，美國疾病管制局建議臨床微生物實驗室應將所有懷疑社區感染腸胃炎的腹瀉檢體常規篩檢STEC，並且建議作法為利用選擇性培養基培養篩檢E. coli O157:H7及利用EIA方式偵測Shiga toxin或是利用核酸增幅試驗來診斷這基因來診斷non-O157 STE C[2]。但是，這對臨床微生物實驗室而言必須更改以往操作流程及增加成本負擔，在美國本土並非每個微生物實驗室都遵守。所以，在2011年6月，臨床微生物期刊(journal of clinical microbiology)針對臨床微生物實驗室是否需要建立常規篩檢STEC
這個議題進行討論，其編輯請來一個有進行常規篩檢的兒童專責醫院微生物實驗室與與一個沒有執行常規篩檢的一般醫學中心微生物實驗室就這個議題進行對話[23]。在這對話中具有三點共識值得我們參考：一、只有E. coli O157:H7可以被sorbitol MacConkey agar選擇性培養基所培養出來，但是其他non-O157 STEC則無法利用培養方式進行篩檢。二、針對non-O157 STEC，常規建議用EIA方式偵測增菌後的液態培養基是否含有志賀毒素，但是亦可以用核酸增幅檢驗偵測是否攜帶這毒素基因。三、Non-O157 STE 與O157 STE相同都引起腎臟損傷與高致死率且具有疫情爆發的可能，所以實驗室不可以忽視。但是雙方實驗室就篩檢的成本與產生的效應是否成正比並沒有共識，在兒童專責醫院，認為如果採行在進行糞便培養同時篩檢E. coli O157:H7培養及偵測Shiga toxin 則具有較高效應。但是在一般醫院，病患分布年齡及地理位置關係如果進行糞便培養全面檢體篩檢non-O157 STEC是不符合經濟效應。最後建議如果為生物實驗室想要提供全面篩檢STEC，則建議實驗是可以先選擇12個月糞便培養檢體以EIA方式篩檢看看內含Shiga toxin比例有多少再決定是否有需要提供全面篩檢[23]。在台灣，志賀毒性大腸桿菌的感染症極為少見。其原因是仰賴政府衛生機關對各食材的嚴格把關及國人的飲食習慣還是以熟食為主。隨著時代改變及生食主義與生機飲食的盛行，一些因為食用生菜及未煮熟之食材的零星感染案件也時有所聞。台灣臨床實驗室對志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程較為陌生，實驗室應該開始對志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程提高注意以備不時之需。
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Mini Review
Diagnosis of Shiga Toxin- Producing Escherichia coli (STEC)
Infections by Clinical Laboratory
Hsing-Yu Chen1, Jun-Ren Sun2*
1Department of Clinical Pathology, Taipei City Hospital Renai Branch
2Division of Clinical Pathology, Tri-Service General Hospital
Objective: Infection with shiga toxin–producing Escherichia coli (STEC) causes diarrhea in hu-mans. Accurate diagnosis of STEC infection by clinical laboratory is important because appropri-ate treatment early might decrease the risk for serious complications such as renal damage and im-prove patient outcome. The differentiation of STEC serotypes is essential for outbreak responses and infection control. This article describes the procedure of STEC diagnosis in clinical laboratory.
The procedure including the diarrhea specimen handling and transport; a review of culture and non-culture experiments for STEC diagnosis. In Taiwan, STEC infection is uncommon because of the eating habit of cooked food. But the risk of STEC infection is higher than before because the prevalent fashions of feed raw foodism and living food die. It is important to know how to rapidly diagnose STEC infection in clinical laboratory.
Key words: shiga toxin- producing Escherichia coli, shiga toxin
Received: October 12, 2011
Corresponding author: Jun-Ren Sun, Division of Clinical Pathology, Tri-Service General Hospital
Tel: 886-2-87923311 ext 88092, Fax:886-2-87927226, Email: sun3342@https://www.360docs.net/doc/1015082981.html,
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和耐药性分析
产志贺毒素大肠埃希菌的分子生物学鉴定和 耐药性分析1 李咏梅，李凡 吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 1320011 E-mail：mayflower380@https://www.360docs.net/doc/1015082981.html, 摘 要：本文采用多重PCR（multiplex PCR, mPCR）法对产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC）分离株进行毒力基因的分子生物学鉴定；用WHO 推荐的K-B法对分离株进行抗生素的敏感性测定，以了解stx1、stx2、eaeA、hlyA 4种毒力基因的分布情况，以及分离株对18种抗生素的敏感性。结果显示产志贺毒素的大肠埃希菌共有46株，其中两种毒素均产生的有22株（47.8%）；单纯产生stx1的有16株（36.9%），stx2的有8株（17.4%）；四种毒力基因均存在的有19株（41.3%），血清型为O157:H7，而非O157:H7血清型的菌株（23/46）中，4种毒力基因同时存在的仅有3株（6.6%），但有13株（56.9%）hlyA基因阳性。全部STEC对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为28.3%，氨苄西林为30.4%，红霉素为69.6%，而且有5株对至少4种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-红霉素-氨苄西林。非O157型 STEC耐药菌次为122， 而O157 型为63。实验结果证明mPCR法可以快速检测STEC特征性毒力基因，以判定其致病性能。非O157型STEC对抗生素较易形成耐药性。 关键词：STEC；鉴定; 耐药性 1．引言 STEC是世界上人类食物中毒的重要致病因子，也是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌[1]。STEC中有100余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis, HC），溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome, HUC)。但是，近年来非O157H7 STEC引起的HC、HUC在逐年增加。由于E.coli O157H7不发酵山梨醇而比非O157H7STEC容易鉴定，所以非O157H7STEC 常被人们所忽视。而STEC致病的特征性毒力因子是1型志贺毒素（Shiga toxin type1, stx1）和2型志贺毒素（Shiga toxin type2, stx2）,分别由stx1基因编码和stx2基因编码。然而，其他毒力因子如由eaeA基因编码的紧密素（intimin）也称黏附抹平因子（attachment and effacement factor）；由hlyA基因编码的溶血素（hemolysin）等也是重要的毒力因素[2]。因此，用多重PCR技术对标本进行STEC毒力基因的鉴定，不仅可作特征性鉴定，而且还可对其潜在的致病性能作出前瞻性判定。 1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为30271251 -1-
实验室常用菌株及特性
一、实验室常见菌株简介 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cm R)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC 载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F? traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 DH10B菌株 基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ- The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。 host for pUC and other α-complementation vectors; pBR322
实验室常用溶剂共沸体系
实验室常用溶剂共沸体系 18、00、960浓盐酸1、19 12、 10、372浓硝酸1、42 15、 90、704磷酸1、70 14、 80、855冰醋酸1、05 17、4 50、998浓氨水0、90 14、5 30、566浓氢氧化钠1、54 19、 40、505注：表中数据录自John A、 Dean、Lange’s Handbook of Chemistry、13th ed、1985常见的共沸混合物1）与水形成的二元共沸物（水沸点100℃）溶剂沸点/℃共沸点/℃含水量/%溶剂沸点/℃共沸点/℃含水量/%氯仿 61、2 56、 12、5甲苯1
85、020四氯化碳77、0 66、04、0正丙醇97、2 87、7 28、8苯 80、4 69、 28、8异丁醇108、4 89、9 88、2丙稀腈 78、0 70、0 13、0二甲苯137- 40、5 92、0 37、5二氯乙烷 83、7 72、0 19、5正丁醇1 17、7
37、5乙睛82、0 76、0 16、0吡啶1 15、5 94、042乙醇78、3 78、 14、4异戊醇1 31、0 95、1 49、6乙酸乙酯77、1 70、 48、0正戊醇1 38、3 95、4 44、7异丙醇82、4 80、4 12、1氯乙醇1
97、8 59、0乙醚353 41、0二硫化碳464 42、0甲酸101107262）常见有机溶剂间的共沸混合物共沸混合物组分的沸点/℃共沸物的组成(质量)/%共沸物的沸点/℃乙醇-乙酸乙酯 78、3， 78、030：70 72、0乙醇-苯 78、3， 80、632：68 68、2乙醇-氯仿 78、3， 61、27：93 59、4乙醇-四氯化碳 78、3， 77、016：84 64、9乙酸乙酯-四氯化碳 78、0， 77、043：57 75、0甲醇-四氯化碳
志贺毒性大肠杆菌 (STEC) 的临床实验室检验
志賀毒性大腸桿菌(STEC)的臨床實驗室檢驗 陳星宇1孫俊仁2* 1台北市立聯合醫院仁愛院區 2三軍總醫院臨床病理科 人類如果感染志賀毒性大腸桿菌 (shiga toxin–producing Escherichia coli ,STEC)會造成嚴重腹瀉。即時且適當的診治可以減少病人併發嚴重腎臟疾病及改善病人預後。所以實驗室如何正確診斷志賀毒性大腸桿菌就很重要。以群聚感染爆發與感染控制的角度而言，實驗室必須能區分所流行的志賀毒性大腸桿菌血清型。本篇文章為介紹臨床實驗室診斷志賀毒性大腸桿菌的檢驗流程。此流程包含腹瀉檢體的採集及運送、針對志賀毒性大腸桿菌的培養及非培養的相關鑑定試驗。在台灣，志賀毒性大腸桿菌所造成的群聚感染並不常見，主要是跟我們熟食的飲食習慣有關。但隨著生食主義及生機飲食的盛行，志賀毒性大腸桿菌感染的風險也相對提高。臨床實驗室了解如何快速檢測志賀毒性大腸桿菌感染就顯得格外重要。 關鍵詞：志賀毒性大腸桿菌、志賀毒素 志賀毒性大腸桿菌 (Shiga toxin–producing E. coli, STEC)簡介 志賀毒性大腸桿菌(Shiga toxin–producing E. coli, STEC)泛指會產生志賀毒素(shiga toxin)的大腸桿菌[1-3]。大腸桿菌的分型主要依據O抗原及H抗原進行血清分型。O抗原為表面抗原(Somatic Ag)而H抗原則為鞭毛抗原(Flagellar Ag)。STEC亦可以專一性抗血清針對其表面抗原及鞭毛抗原進行分型。舉例來說，STEC下最有名的E. coli O157:H7，別名為STEC O157:H7表示其所攜帶的表面抗原為O 157，而其所攜帶的鞭毛抗原為H7，並且可以產生志賀毒素。STEC 在分類上可以區分成O157 STEC及Non-O157 STEC 兩類。常見的STEC感染症主要是感染 E. coli O157:H7。但是至少還有150種STEC血清型證實與群聚感染或是人類疾病有關，這些血清型別可以被歸類為non-O157 STEC。在美國地區non-O157 STEC感染症與六株non-O157血清型(O26, O45, O103, O111, O121及O145)較為相關[4, 5]。志賀毒素的命名最早是因為其毒素結構與功能類似於Shigella dystenteriae 所分泌之Shigella dystenteriae type 1[6]。目前常見的Shiga toxin可以分成兩大類，分別為Shiga toxin 1 (Stx1)及Shiga toxin 2(Stx2) [7, 8]。其他常見名稱像是verocytotoxigenic E. coli則是指其所分泌的志賀毒素會使Vero細胞株產生細胞病變現象。因其會造成人類疾病主要是以腸道出血，所以又稱為enterohemorrhagic E. coli。STEC感染主要會造成急性腹瀉(diarrhea)，此外約8%病人在感染後會出現溶血性尿毒症候群(hemolytic uremic syndrome, HUS)的症狀。其他嚴症狀像是血小板減少症(thrombocytopenia)、溶血性貧血(hemolytic anemia)及腎衰竭(renal failure)等症狀。如果臨床上觀察到血栓性血小板低下性紫斑症(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)或是溶血性尿毒症候群伴隨腹泄癥候，則必須要懷疑為STEC感染[9, 10]。但是，並非每個感染STEC病人都會出現溶血性尿毒症候群，出現症狀輕重與否與菌種毒性及宿主免疫力有直接關係。而HUS 症狀則是無論是O157 STEC亦或是non-O157 STEC皆有可能造成[10]。STEC造成的感染症主要是因為食用被STEC所污染過的食物(未煮熟的絞肉、受汙染的果汁、生菜及牛奶)、飲用 收稿日期：100年10月12日 通訊作者：孫俊仁三軍總醫院臨床病理科 台北市內湖區成功路2段325號臨床病理科 電話：886-2-87923311 ext 88092 傳真：886-2-87927226 電子郵件：sun3342@https://www.360docs.net/doc/1015082981.html, 綜 論
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍[1]
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
实验室常用溶液及试剂配制(重新排版)
实验室常用溶液及试剂配制 一、实验室常用溶液、试剂的配制-------------------------------------------------------1 表一普通酸碱溶液的配制 表二常用酸碱指示剂配制 表三混合酸碱指示剂配制 表四容量分析基准物质的干燥 表五缓冲溶液的配制 1、氯化钾-盐酸缓冲溶液 2、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 3、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 4、乙酸-乙酸钠缓冲溶液 5、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液 6、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液 7、氨水-氯化铵缓冲溶液 8、常用缓冲溶液的配制 二、实验室常用标准溶液的配制及其标定-----------------------------------------------4 1、硝酸银（C AgNO3=0.1mol/L）标准溶液的配制 2、碘（C I2=0.1mol/L）标准溶液的配制 3、硫代硫酸钠（C Na2S2O3=0.1mol/L）标准溶液的配制 4、高氯酸（C HClO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 5、盐酸（C HCl=0.1mol/L）标准溶液的配制 6、乙二胺四乙酸二钠（C EDTA =0.1mol/L）标准溶液的配制 7、高锰酸钾（C K2MnO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 8、氢氧化钠（C NaOH=1mol/L）标准溶液的配制 三、常见物质的实验室试验方法 ----------------------------------------------------------6 1、柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2、钙含量测定（磷酸氢钙CaHPO4、磷酸二氢钙Ca（H2PO4）2·H2O、钙粉等） 3、氟（Fˉ）含量的测定 4、磷（P）的测定 5、硫酸铜（CuSO4·5H2O） 6、硫酸锌（ZnSO4·H2O） 7、硫酸亚铁（FeSO4·H2O） 8、砷 9、硫酸镁（MgSO4） 四、维生素检测--------------------------------------------------------------------------------8 1、甜菜碱盐酸盐 2、氯化胆碱
160;食品安全风险解析：解读产志贺毒素大肠杆菌O26160;
食品安全风险解析：解读产志贺毒素大肠杆菌O26 2016年01月13日 近日，媒体报道美国墨西哥风味连锁餐厅Chipotle食物中毒引发的产志贺毒素大肠杆菌O26疫情在美国蔓延，导致20人住院。美国疾病预防和控制中心宣称近两年来由产志贺毒素大肠杆菌O26引发的食物中毒事件明显增多，在未来可能引发更多的疫情，尤其是引发溶血性尿毒综合症的病例数量可能会远超过产志贺毒素大肠杆菌O157。针对产志贺毒素大肠杆菌O26事件，国家食品药品监督管理总局发布2016年第1期《食品安全风险解析》，组织专家进行解读，并提醒消费者注意培养良好的消费和生活习惯。 一、产志贺毒素大肠杆菌是全球最重要的新发高致病性食源性病原菌 产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，简称STEC）是一类携带了前噬菌体编码一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌，包括大肠杆菌O26，以及O157、O45、O103、O104、O111、O121、O145等150多种其它血清型的大肠杆菌。该菌为革兰氏阴性杆菌，无芽胞，有鞭毛，可以在10—65℃生长，最适生长温度为33—42℃，具有较强的耐酸性（pH 2.5—3.0），可以抵抗胃酸的消化作用。 据不完全统计，美国1983—2002年发生的非O157的STEC感染者中，70%是由O26、O45、O103、O121、O111 和O145血清型所致；2011年9月，美国农业部食品安全检验局曾发布通告，强调大肠杆菌O26是美国最常
见的非O157STEC。爱尔兰对肉和乳制品中非O157 STEC的分布特征研究发现，血清型O26也是引起人类食源性疾病最主要的非O157血清型。STEC O26已逐渐成为美国、日本及部分欧盟发达国家引起暴发事件的主要病原菌。 二、肉制品是引发食源性STEC感染的主要高危食品 牛、羊等经济型动物是STEC的天然宿主，国际相关研究发现牛和羊中STEC 携带率可高达71%甚至以上。美国农业部（USDA）和欧盟食品安全局（EFSA）也证实养殖场中存在高风险污染的STEC，并且可以通过环境、粪便、野生动物、土壤等在一定范围内循环存在，最终造成肉制品等污染。1982—2006年多个国家STEC暴发事件的归因分析表明，最主要原因是肉制品污染（42.2%），其次是乳制品（12.2%）。除此之外，生鲜果蔬及其制品等也可能是STEC O26重要的传播介质。通过对美国1992—2002年期间24起STEC暴发事件统计发现，67%的疫情是由牛肉制品导致的，其中O26是最主要致病血清型。 三、国际组织及部分国家和地区已对肉制品中的STEC污染高度重视 1999年第32届食品卫生法典委员会（CCFH）会议上，各国政府对食品中的微生物风险应按“食品—病原”组合进行风险管理达成共识，其中就包括“牛肉中大肠杆菌O157”。联合国粮农组织/世界卫生组织食品微生物风险评估联合专家组于2011年发布了风险评估会议报告，为如何控制生牛肉及牛肉制品中的出血性大肠杆菌提供了科学建议。但是，迄今CCFH尚未对如何应用食品卫生通则控制牛肉中的出血性大肠杆菌制定相关科学导则，也未制定相关产品的限量标准。
水中大肠杆菌的检测方法
附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水 样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
实验室常用溶剂的化学位移
NMR Chemical Shifts of Common Laboratory Solvents as Trace Impurities Hugo E.Gottlieb,*Vadim Kotlyar,and Abraham Nudelman* Department of Chemistry,Bar-Ilan University, Ramat-Gan52900,Israel Received June27,1997 In the course of the routine use of NMR as an aid for organic chemistry,a day-to-day problem is the identifica-tion of signals deriving from common contaminants (water,solvents,stabilizers,oils)in less-than-analyti-cally-pure samples.This data may be available in the literature,but the time involved in searching for it may be considerable.Another issue is the concentration dependence of chemical shifts(especially1H);results obtained two or three decades ago usually refer to much more concentrated samples,and run at lower magnetic fields,than today’s practice. We therefore decided to collect1H and13C chemical shifts of what are,in our experience,the most popular “extra peaks”in a variety of commonly used NMR solvents,in the hope that this will be of assistance to the practicing chemist. Experimental Section NMR spectra were taken in a Bruker DPX-300instrument (300.1and75.5MHz for1H and13C,respectively).Unless otherwise indicated,all were run at room temperature(24(1°C).For the experiments in the last section of this paper,probe temperatures were measured with a calibrated Eurotherm840/T digital thermometer,connected to a thermocouple which was introduced into an NMR tube filled with mineral oil to ap-proximately the same level as a typical sample.At each temperature,the D2O samples were left to equilibrate for at least 10min before the data were collected. In order to avoid having to obtain hundreds of spectra,we prepared seven stock solutions containing approximately equal amounts of several of our entries,chosen in such a way as to prevent intermolecular interactions and possible ambiguities in assignment.Solution1:acetone,tert-butyl methyl ether,di-methylformamide,ethanol,toluene.Solution2:benzene,di-methyl sulfoxide,ethyl acetate,methanol.Solution3:acetic acid,chloroform,diethyl ether,2-propanol,tetrahydrofuran. Solution4:acetonitrile,dichloromethane,dioxane,n-hexane, HMPA.Solution5:1,2-dichloroethane,ethyl methyl ketone, n-pentane,pyridine.Solution6:tert-butyl alcohol,BHT,cyclo-hexane,1,2-dimethoxyethane,nitromethane,silicone grease, triethylamine.Solution7:diglyme,dimethylacetamide,ethyl-ene glycol,“grease”(engine oil).For D2O.Solution1:acetone, tert-butyl methyl ether,dimethylformamide,ethanol,2-propanol. Solution2:dimethyl sulfoxide,ethyl acetate,ethylene glycol, methanol.Solution3:acetonitrile,diglyme,dioxane,HMPA, pyridine.Solution4:1,2-dimethoxyethane,dimethylacetamide, ethyl methyl ketone,triethylamine.Solution5:acetic acid,tert-butyl alcohol,diethyl ether,tetrahydrofuran.In D2O and CD3OD nitromethane was run separately,as the protons exchanged with deuterium in presence of triethylamine. Results Proton Spectra(Table1).A sample of0.6mL of the solvent,containing1μL of TMS,1was first run on its own.From this spectrum we determined the chemical shifts of the solvent residual peak2and the water peak. It should be noted that the latter is quite temperature-dependent(vide infra).Also,any potential hydrogen-bond acceptor will tend to shift the water signal down-field;this is particularly true for nonpolar solvents.In contrast,in e.g.DMSO the water is already strongly hydrogen-bonded to the solvent,and solutes have only a negligible effect on its chemical shift.This is also true for D2O;the chemical shift of the residual HDO is very temperature-dependent(vide infra)but,maybe counter-intuitively,remarkably solute(and pH)independent. We then added3μL of one of our stock solutions to the NMR tube.The chemical shifts were read and are presented in Table 1.Except where indicated,the coupling constants,and therefore the peak shapes,are essentially solvent-independent and are presented only once. For D2O as a solvent,the accepted reference peak(δ)0)is the methyl signal of the sodium salt of3-(trimeth-ylsilyl)propanesulfonic acid;one crystal of this was added to each NMR tube.This material has several disadvan-tages,however:it is not volatile,so it cannot be readily eliminated if the sample has to be recovered.In addition, unless one purchases it in the relatively expensive deuterated form,it adds three more signals to the spectrum(methylenes1,2,and3appear at2.91,1.76, and0.63ppm,respectively).We suggest that the re-sidual HDO peak be used as a secondary reference;we find that if the effects of temperature are taken into account(vide infra),this is very reproducible.For D2O, we used a different set of stock solutions,since many of the less polar substrates are not significantly water-soluble(see Table1).We also ran sodium acetate and sodium formate(chemical shifts: 1.90and8.44ppm, respectively). Carbon Spectra(Table2).To each tube,50μL of the stock solution and3μL of TMS1were added.The solvent chemical shifts3were obtained from the spectra containing the solutes,and the ranges of chemical shifts (1)For recommendations on the publication of NMR data,see: IUPAC Commission on Molecular Structure and Spectroscopy.Pure Appl.Chem.1972,29,627;1976,45,217. (2)I.e.,the signal of the proton for the isotopomer with one less deuterium than the perdeuterated material,e.g.,C H Cl3in CDCl3or C6D5H in C6D6.Except for CHCl3,the splitting due to J HD is typically observed(to a good approximation,it is1/6.5of the value of the corresponding J HH).For CHD2groups(deuterated acetone,DMSO, acetonitrile),this signal is a1:2:3:2:1quintet with a splitting of ca.2 Hz. (3)In contrast to what was said in note2,in the13C spectra the solvent signal is due to the perdeuterated isotopomer,and the one-bond couplings to deuterium are always observable(ca.20-30Hz). Figure1.Chemical shift of H DO as a function of tempera-ture. https://www.360docs.net/doc/1015082981.html,.Chem.1997,62,7512-7515 S0022-3263(97)01176-6CCC:$14.00?1997American Chemical Society
(整理)大肠杆菌及其检验.
大肠杆菌及其检验 大肠杆菌的生物学特性 ?简介： 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属 大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。 ?形态与染色 大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。 革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片 最新：大肠杆菌革兰氏染色照片 ?培养特性 由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。 最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为 15-46℃。 在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：
（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。 （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。 （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。 此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。 附：菌落形态有什么用处？菌落形态学 生化反应 大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。 IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。 ?抗原构造 比较复杂，主要由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。 ?抵抗力 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。 致泻性大肠杆菌简介 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道 外感染。 某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulent E. coli ）。 一般包括四种： 肠毒素性大肠杆菌（ETEC） 致病性大肠杆菌（EPEC）
实验室常用的细菌作用及其选择
第一篇：JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号：114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟
大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂
2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。 2.81mol/L 盐酸（HCI ) ：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。3检验程序 4.样品稀释