人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用
王全凯1，杨全会2，郭静2，谢广云1，崔涛1，许荣焜2，许建宁1*
1. 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050
2. 中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005
摘要：目的建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物制剂疗效的观察。方法将人原发肝癌手术新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌组织裸鼠移植瘤动物模型；于同体移植后第15 天连续ig给予长科制剂（CKBM），通过观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，测定瘤体体积和质量、抑瘤率以及进行组织病理学观察，初步评价CKBM的抗肿瘤疗效。结果人肝癌组织裸鼠移植瘤保持了人肝癌组织特性，并能通过同体移植传代；观察发现CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤率达45.71%，对癌细胞生长有一定的抑制作用。结论在成功建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型基础上，观察发现CKBM具有一定的抗肿瘤疗效。
关键词：肝癌；裸鼠；移植瘤；动物模型；抑瘤率
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0398 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.018
Establishment and application of implantation model of human hepatocellular carcinoma in nude mice
WANG Quan-kai1, YANG Quan-hui2, GUO Jing2, XIE Guang-yun1, CUI Tao1, XU Rong-kun2, XU Jian-ning1
1. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing
100050, China
2. Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China
Abstract:Objective The human hepatocellular carcinoma model was established by implantation in BALB/c nude mice. Its characteristics were certified in the model which was used for the observation of antitumor efficacy. Methods Human hepatocellular carcinoma were sc implanted to BALB/c nude mice for the establishment of the implantation model of the human hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice. The nude mice were exposed to the pharmaceuticals from CK Life Sciences Limited by ig on day 15 after the implantation to find out its healing efficacy through the animal reflecting, the occurring time, volume, weight of tumors, the rate of tumor inhibited, and pathological histology. Results The characteristics of human hepatocellular carcinoma could be kept with passaging by autograft. The tumor inhibiting rate of the pharmaceuticals was 45.71%, showing the certain inhibitory effect on growth of tumor cells. Conclusion A certain antitumor efficacy of the pharmaceuticals made by CK Life Sciences Limited is found out on the basis on the human hepatocellular carcinoma model in nude mice established successfully.
Key words: hepatocellular carcinoma; nude mice; implanted tumor; animal model; tumor inhibitory rate
人类肝癌的基础和临床实验研究多数都借助于实验动物模型。目前，以人肝癌组织移植裸鼠建立的动物移植瘤模型是最接近人类肝癌的整体实验模型，是肝癌基础和临床实验研究理想的动物模型。人肝癌组织裸鼠移植瘤模型是指把人肝癌组织块接种于裸鼠皮下建立的实验动物模型，常用于筛选抗肿瘤药物和制剂、实验性治疗和抗肿瘤机制研究[1]。基于为肝癌实验和临床研究以及药物筛选提供体内实验系统的目的，本研究建立了人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物长科制剂（CKBM）疗效的观察。
1材料与方法
1.1实验动物
BALB/c（nu/nu）裸小鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。饲养于中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学部
收稿日期：2013-06-03
作者简介：王全凯（1977—），男，北京人，主管技师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132199 E-mail: kylewang@https://www.360docs.net/doc/114447408.html, *通信作者许建宁，硕士生导师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132592 E-mail: jnx999@https://www.360docs.net/doc/114447408.html,
SPF屏障系统动物室，鼠龄5～6周龄，体质量18～20 g，雄雌各半。
1.2药品
长科制剂（CKBM），香港长江生命科技有限责任公司研制，药物组成包括人参、五味子、酸枣仁、山楂、大豆、酵母菌等[2]。
1.3人肝癌组织
选用经病理确诊的肝癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织，立即置培养液中，尽快移植。
1.4癌组织移植[3]
在超净台中用培养液反复数次冲洗新鲜的癌组织，去除明显坏死或可疑坏死的组织，将其切成大小适宜（2～3 mm3）的小块，直接接种于裸鼠肩背部、腋下皮下部位。每例肝癌患者癌组织标本接种雄、雌性裸鼠各2只。尽可能缩短取得癌组织到移植的过程时间。裸鼠间传代方法依此同样进行。1.5动物体内肿瘤生长情况测定
癌组织移植完成后，每日观察动物的活动、进食及饮水情况，并记录异常情况；分别于实验开始、结束及每周称量动物体质量；详细观察记录移植部位有无感染，肿瘤/肿块出现的时间；每隔3～7天，用卡尺测量皮下移植瘤的最大长径（a）和横径（b），按公式计算瘤体积（V）＝ab2/2。
1.6血清甲胎蛋白（AFP）测定
采用上海科华生物工程股份有限公司生产的甲胎蛋白定量检测试剂盒（酶联免疫法）测定裸鼠全血中AFP的量。
1.7组织病理学检查
动物处死时进行大体解剖观察，肉眼观察移植瘤形态，以及有无腹水、胸水和各脏器表面有无转移瘤结节；取肿瘤、脑、肺、心、肝、脾、肾、胃、肠及区域淋巴结（双腋下、双腹股沟、颈前和肺门），以10%福尔马林固定、石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肿瘤转移和各脏器病理变化及淋巴结窦性组织细胞增生情况。
1.8模型初步应用[4]
应用第3代同体移植的荷瘤裸鼠模型，对CKBM的抗肿瘤疗效进行初步观察。同体移植雄、雌性各15只动物，分为模型组和给药组，移植部位为背部、一侧腋部皮下。给药组的雄雌各8只动物于同体移植后第15天开始每日ig给药20 mg/kg（临床拟使用剂量）的CKBM，每日观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，每周测定动物体质量、瘤
体大小2次，连续给药45 d，实验结束时测定瘤质
量和主要脏器质量，对瘤体和动物主要脏器进行组
织病理学检查，并计算抑瘤率。
抑瘤率＝1－给药组瘤质量/ 模型组瘤质量
2结果
2.1人肝癌组织原代移植
本研究用2例临床确诊的肝癌患者手术切除标
本（具体情况见表1）进行裸鼠皮下移植，每例接
种雄、雌性各2只动物，有1例获得移植成功，原
代移植成功率为12.5%，原代移植瘤潜伏期为56 d，
并可在同种动物连续传代。
2.2移植瘤传代
当动物皮下瘤体达1 cm3时，进行同种间移植
瘤传代，成功率达100%（表2）。移植瘤连续传代，
自第3代同体移植开始瘤体生长潜伏期为25 d；不
同代荷瘤裸鼠全血中AFP量均值高于检测灵敏度
20 ng/mL的100倍以上。
表12例人肝癌组织临床资料
Table1Clinical data of hepatocellular carcinoma in two cases
编号性别年龄肿瘤病理类型
AFP /
(ng·mL?1) 1*男59 肝右叶肝细胞肝癌99 940.0
2男57 肝右后叶中度分化肝细胞肝癌433.8
*移植成功
*implanted successfully
表2人肝癌移植瘤传代情况
Table2Passaging condition of human implanted
hepatocellular carcinoma
代数数量 / 只潜伏期 / d 出瘤率 / %
原代8 56 12.5
1 6 35 100
2 6 25 100
3 6 25 100 2.3病理学检查
对原代和不同代移植裸鼠均进行大体解剖观察
和病理组织学检查。移植瘤组织形态和病理组织学
检查与原人肝癌组织相似（表3）。
2.4人肝癌裸鼠移植瘤模型初步应用
2.4.1 CKBM毒性评价根据测定的动物体质量
的变化对药物毒性进行评价，即实验末体质量（FBW）/实验初体质量（IBW）≥0.80时为无毒性
反应，FBW/IBW＜0.80时为有毒性反应。从表4、5
表3肝癌组织病理学检查结果
Table3Histopathology of hepatocellular carcinoma
组织类型病理组织学检查结果
人肝癌组织肝脏正常组织结构消失，可见到形状似球腺泡状的癌巢，被周围的结缔组织包绕；癌巢由癌细胞组成，癌细胞形态大小不一，呈现圆形、椭圆形、锥形及不规则形，细胞界限模糊，癌细胞排列较为松散；
癌细胞的核仁较大，染色质浓染，胞浆所占比例小，可见到核分裂像
同体移植第1代癌组织癌组织破坏了肝脏的正常结构，可见到形似球腺状聚集的癌巢；癌巢由癌细胞组成，癌细胞形态各异，呈现圆形、椭圆形、锥形及不规则形，癌细胞大小不一；癌细胞的核仁较大，染色质浓染，胞浆所占比例小，可见到核分裂像
同体移植第2代癌组织肝脏正常组织结构消失，癌组织排列紧密，生长旺盛；可见有较大范围的出血现象；癌细胞的形态差异很大，有圆形、椭圆形、索形、多边形及不规则形等多种形态，细胞的大小差异很大；癌细胞染色质染色很深，核仁明显增大，胞浆部分较少，同时可以见到明显的核分裂像
同体移植第3代癌组织癌组织呈浸润式分布，排列紧密，生长旺盛；可见有较大范围的出血现象；癌细胞的形态差异大，有圆形、椭圆形、索形、多边形及不规则形等多种形态，细胞的大小差异也较大；癌细胞染色质染色很深，核仁明显增大，胞浆部分较少，可以见到明显的核分裂像
同体移植第4代癌组织肝脏正常组织结构消失，可见大片肝脏组织坏死；癌组织呈腺管状，排列紧密，生长旺盛，癌细胞的形态差异很大，有圆形、椭圆形、索形、多边形及不规则形等多种形态，细胞的大小差异大；癌细胞可见2个或多个核仁，染色质染色深，浓集，核仁明显增大，胞浆部分较少；同时可以见到较明显的核分裂像
表4雄性小鼠体质量变化情况(±
x s)
Table4Changes of body weight of male mice (±
x s)
移植不同时间小鼠体质量 / g
组别
第1天第4天第7天第11天第14天第17天第21天第25天第28天模型（n＝7） 20.67±1.0522.07±1.0323.67±1.6324.19±1.8224.23±2.0824.03±2.0524.07±2.24 23.79±2.45 24.56±2.46给药（n＝8） 19.81±0.9420.65±0.94*22.70±1.3923.74±1.9423.79±2.1323.74±2.4623.64±2.44 23.44±2.21 23.61±2.23
移植不同时间小鼠体质量 / g
组别
第32天第35天第39天第42天第46天第49天第53天第56天第60天模型（n＝7） 24.53±2.4123.04±2.7422.60±2.6022.61±2.4122.64±2.2721.76±2.3222.03±2.62 22.49±3.08 22.67±3.61给药（n＝8） 24.04±2.2622.20±2.5322.00±2.6021.63±2.8321.48±2.5520.93±2.4519.45±2.26 19.27±2.77 20.68±2.19与模型组比较：*P＜0.05，下同
*P < 0.05 vs model group, same as below
表5雌性小鼠体质量变化情况(±
x s)
Table5Changes of body weight of female mice (±
x s)
移植不同时间小鼠体质量 / g
组别
第1天第4天第7天第11天第14天第17天第21天第25天第28天模型（n＝7）18.64±1.7018.21±0.6719.47±0.7219.36±0.8519.23±0.8919.60±1.1018.97±1.6218.30±1.6418.86±1.78给药（n＝8） 18.58±0.7818.85±0.8119.90±1.0620.43±1.8320.71±1.59*20.70±1.9119.30±1.5719.39±1.8720.19±1.95
移植不同时间小鼠体质量 / g
组别
第32天第35天第39天第42天第46天第49天第53天第56天第60天模型（n＝7）19.06±1.9218.06±2.0617.46±2.0517.57±2.0418.01±2.0317.63±2.1916.26±3.0518.17±2.0018.40±2.12给药（n＝8） 20.31±2.0219.43±1.9218.86±1.8519.01±1.9318.89±1.8818.33±1.6617.49±1.6617.12±2.3817.63±2.46
可见两组不同性别小鼠体质量增长无显著性差异（P＞0.05），且给药组FBW/IBW均大于0.80，表明CKBM对动物无毒性反应。
2.4.2肿瘤情况分析分析肿瘤在不同性别动物出现时间和部位。经Fisher精确概率法统计分析，给药组肿瘤发生动物数、出现肿瘤数量与模型组比较均无显著性差异（P＞0.05）。给药组动物瘤体积与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。
2.4.3抑瘤率两组小鼠瘤质量测定结果见表6。经计算可知，CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的总抑瘤率达45.71%；按性别分组的结果显示，对雄、雌性小鼠抑瘤率分别为50.30%和38.19%；按部位分组的结果显示，背部和腋下抑瘤率分别为24.88%、58.43%。
2.4.4病理组织学检查结果模型组实体样瘤组织，癌细胞弥散性生长，细胞大小一致，胞浆呈嗜酸性，癌组织血窦丰富；给药组实体样癌组织，癌细胞大小一致，癌细胞在血窦周呈腺体样排列，胞浆嗜酸，核嗜碱，核分裂相少，胞浆透明，嗜酸性，胞核嗜碱性；给药组癌组织基本结构和癌细胞形态与模型组比较未发现明显变化，所不同之处是癌组织多发生坏死，癌细胞核分裂相相对减少，这表明CKBM对癌细胞生长有一定的抑制作用。荷瘤裸鼠各脏器未见癌细胞转移灶。结果见图1。
表6两组小鼠瘤质量测定结果(±
x s)
Table6Weight of carcinoma in mice of two groups (±
x s)
雄性小鼠瘤质量 / g 雌性小鼠瘤质量 / g 组别
背部腋下背部腋下
模型（n＝7） 1.082±2.150 2.025±1.1050.611±0.283 1.092±0.740 给药（n＝8） 0.691±0.8140.800±0.503*0.603±0.511 0.465±0.079
图1模型组(A)与给药组(B)瘤组织病理学观察结果
Fig.1Observation of tumor histopathology in model group (A) and treatment group (B)
3讨论
自1976年Shimosato等[5]报道人肝癌组织在裸
鼠皮下移植成功后，由于该模型是体外最接近人类
肝癌的整体实验模型，且具备建立模型相对时间短、
成功率高、瘤组织保持原人肝癌的形态和功能等特
点，故被广泛应用于人肝癌实验和临床研究以及抗
肿瘤药物筛选。
不同的人组织类型肿瘤裸鼠皮下移植成功率不
同[6-8]，其中肝癌组织最不易移植成功。人肝癌组织
移植成功与癌组织分化程度、组织类型等密切相关，
肿瘤分化程度低、复发瘤或转移瘤的原代移植成功
率高。此外，瘤源组织的质量、切除组织处理和移
植皮下的时间、皮下移植方法（如直接组织块包埋、
直接组织块皮下注射、组织消化注射）、操作技术等
都对原代移植成功率有很大的影响。本研究考虑到
手术标本取材到裸鼠皮下移植时间可能会超过以往B
实体样瘤组织癌组织血窦癌细胞核分裂相癌巨细胞A
实体样瘤组织癌组织血窦癌细胞核分裂相癌巨细胞
文献报道1 h内的实际情况，将手术取的癌组织直接放入冰冷无菌细胞培养液中保存，接种前再用细胞培养液反复清洗新鲜组织，从而大大延长离体癌组织原代移植间隔时间，该法能使离体5 h人肝癌组织原代移植成功。另外，在进行移植传代时，选用瘤体达1 cm3左右以及较先达到此标准的作为下一代移植的瘤源，可人为选择，使生长较活跃的保持癌特性细胞群体传给下一代，并获得继续生长。
AFP是肝癌患者血清中检测出的一种糖蛋白,正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约2周后，AFP从血液中消失，故成人体内AFP的量通常低于20 ng/mL[9]。但当肝细胞发生癌变时，又恢复了产生这种蛋白质的功能，大量的临床统计资料表明，若以20 μg/L为阳性标准，则急性肝炎的阳性率为31%～52%，慢性肝炎的阳性率为15%～58%，肝硬化的阳性率为11%～47%。肝细胞癌（HCC）患者血清AFP与其肿瘤大小及病理分级有明显关系，肿瘤越小，AFP的阳性率越低。AFP在其他病理类型的原发性肝癌中也有不同程度的阳性率。其中，胆管细胞癌为3.6%～5.2%，混合细胞癌为17.1%～37.4%，纤维板层型肝癌通常只有低浓度的AFP。而84.6%～100%的肝母细胞瘤患者AFP则有可能高于1 000 μg/L[10]。
本研究使用的AFP检测试剂是一种一步法体外免疫层析试剂[11]，可直接用血浆定性地检测AFP，灵敏度为20 ng/mL，操作简便。选择该项指标高的癌源大大提高了移植成功率，也是建立模型后抗肿瘤药物筛选、药效评价等重要的参考指标。
人肝癌组织移植至裸鼠皮下，其肿瘤组织基本保存了原先人肝癌的形态、结构与功能特点，且裸鼠体内AFP指标同样升高，提示模型是一种最接近人的肝癌模型。一般皮下移植成功率低于原位移植，但就建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤而言，相对与原位移植模型操作简便，且模型肿瘤组织保留了人肝癌细胞特点。该模型缺点是不发生浸润及转移。
本研究应用人肝癌裸鼠移植瘤模型对CKBM抗癌效果进行了初步观察，结果进一步提示，受试物对肿瘤生长有一定抑制作用，且所建立的裸鼠移植瘤模型适用于抗肿瘤药物筛选、抑瘤效果评价。
参考文献
[1]叶翩, 张淑玲, 揭盛华, 等. 人肝癌裸鼠移植模型的
研究进展 [J]. 世界华人消化杂志, 2006, 14(36): 3500-3503.
[2]庞锦江, 单惠敏, 许建宁, 等. 长科制剂增强试验动物
的免疫功能 [J]. 世界临床药物, 2004, 25(7): 444-448. [3]孙昉宪, 汤钊猷, 刘康达, 等. 裸鼠人肝癌原位移植模
型的生长特性剂转移潜能 [J]. 中华医学杂志, 1995, 75(11): 673-675.
[4]陈陵际, 丁健. 运用人癌裸小鼠移植瘤模型进行抗
癌新药评价 [J]. 上海实验动物科学, 2001, 21(4): 247-250.
[5]Shimosato Y, Kameya T, Nagai K, et al. Transplantation
of human tumors in nude mice [J]. J Natl Cancer Inst,
1976, 56: 1251-1260.
[6]张东兴, 颜登国, 赵丙波, 等. 人大肠癌裸鼠皮下移植
瘤模型的建立 [J]. 贵阳医学院学报, 2010, 35(3): 247-250, 254.
[7]白飞虎, 郭新宁, 杨力, 等. 人胃癌裸鼠胃原位移植
转移模型的建立 [J]. 第四军医大学学报, 2003, 24(10):
873-875.
[8]许玲, 陈亚琳, 苏晓妹, 等. 裸鼠人胃腺癌
SGC-7901原位移植模型的构建及其生物学特性 [J].
肿瘤防治杂志, 2003, 10(5): 476-478.
[9]常彬霞, 辛绍杰. 甲胎蛋白及其临床应用研究进展 [J].
世界华人消化杂志, 2010, 18(6): 576-580.
[10]钦伦秀. 肿瘤的分子诊断与预测 [M]. 上海: 上海科技
教育出版社, 2004.
[11]陈季武, 范培昌. 快速检测甲胎蛋白的免疫层析试条
的研制 [J]. 分析科学学报, 2002, 18(4): 273-276.
脑肿瘤动物模型的研究
脑肿瘤动物模型的研究 动物模型是研究肿瘤发病机制和检验各种治疗方法的有力武器，本文就脑肿瘤动物模型的历史发展和应用前景作一综述。 脑肿瘤目前仍是严重威胁人类健康和生命的疾病，而肿瘤实验动物模型的建立为研究其发病机制、生物学特性和检测各种治疗方法提供了一种高模拟性工具。自上世纪以来，先后建立了化学物质诱发脑肿瘤模型、病毒诱发模型、同种以及异种移植模型，随着现代分子生物学技术的发展，转基因动物模型又将成为人们研究的热点。 1.早期脑肿瘤动物模型及其局限性 1．1 自发性脑肿瘤动物模型 脑肿瘤在哺乳动物中的发病率不一，有报道狗为0.1-0.5%，SD大鼠（7803只）为0.44%，但另一组41000只SD大鼠中仅发现38例中枢神经系统肿瘤，在灵长类动物中更为罕见，曾解剖14000只恒河猴和1247只猕猴尸体，未发现一例脑肿瘤[1]。由于发病率低，加之自发瘤的隐匿性及荷瘤动物生存期短的特点，自发瘤模型难以用于临床。 1．2 化学物质诱发模型 早期使用甲基胆蒽注入鼠脑实质内可成功诱发出脑肿瘤，其中大部分为胶质瘤和脑膜肉瘤。在20世纪70年代，开始使用一种合成的致癌物质N-亚硝基脲及其衍生物乙基亚硝基脲（ENU）等进行肿瘤诱发实验。Kostener[2]等将50㎎/㎏的ENU给受孕20天的大鼠一次性静脉注射后，子代中均出现了中枢神经系统肿瘤，但ENU对成年鼠诱发脑肿瘤率较低。亚硝基脲类物质诱发的脑肿瘤在部位、类型、诱导时间以及恶性程度等方面均有很大差异。 1．3病毒诱发模型 由于发现病毒与脑肿瘤的发病存在一定的关系，一些学者试图使用病毒进行脑肿瘤诱发实验，核糖核酸病毒（Rous肉瘤病毒）和脱氧核糖核酸病毒（腺病毒）均可诱发脑肿瘤。Bigner[3]等把浓缩的Rous肉瘤病毒（0.01ml）注射到一种新生犬脑内，经一段潜伏期后全部发生胶质瘤或肉瘤，而且在动物体内并未发现子代病毒，这说明病毒的致瘤机理可能与其复制无关。中国生物治疗网https://www.360docs.net/doc/114447408.html,杨教授特别指出，肺癌的早期症状也有人将AD12病毒直接注入到出生后24小时的鼠脑实质内，经过数月的潜伏期后就能发生脑肿瘤，其中大部分为髓母细胞瘤。Tabuchi[4] 则把感染Rous病毒的纤维母细胞接种到猴的右额叶内，73%发生了肿瘤，主要是肉瘤。病毒诱发的脑肿瘤可在同种动物中连续传代，经过克隆后可制成生物特性稳定的模型，但其致瘤周期不一，诱发瘤性质差别较大，而且病毒不宜保存，对人也有一定的伤害作用，从而限制了其应用。 2．脑肿瘤移植模型 同种移植模型较多用于胶质瘤的研究。将诱发的鼠脑胶质瘤进行体外细胞培养，形成稳定的细胞系，如C6，9L，BT4A等，再将这些细胞植入同种大鼠脑内，可得到同种移植胶质瘤模型。脑肿瘤同种移植模型虽能提高肿瘤的模拟性和统一性，但动物脑瘤与人脑瘤相比，在遗传学、细胞动力学和生物学方面均存在显著的差异，因而人们将目光更多地投向脑肿瘤异种移植模型。 由于免疫排斥反应的存在，早期多将肿瘤移植于动物免疫缺陷区，如豚鼠眼前房、仓鼠颊囊、兔角膜和鸡胚绒毛膜等，还有学者采用药物、X线照射等方法抑制动物免疫反应[5]。直到1968年由于免疫缺陷动物的发现，才真正开创了脑肿瘤异种移植动物模型的时代，这些动物包括T淋巴细胞功能缺陷的裸小鼠、裸大鼠，B淋巴细胞功能缺陷的CBA/N小鼠以及T、B淋巴细胞联合缺陷的Lasat小鼠、SCID小鼠等。目前对于脑肿瘤移植的方法还存在不同意见，主要包括：脑内移植、肾包膜下移植和皮下移植。脑内移植最接近肿瘤的人体生长环境，但其操作复杂，动物感染及死亡率高。近来有学者[6]采用立体定向技术将浓缩的肿瘤
裸鼠胶质瘤模型
（1）丁香园总结： 瘤子长不出无非两方面原因，老鼠或者细胞。关于裸鼠，楼上已有描述，接种部位和接种年龄。一般来说，左侧前肢靠近心脏，血供会比较丰富，容易生长新血管。 虽然文献都报道在腋窝注射，但如果局部皮下组织致密，会相对容易形成浓聚的小包块，容易达到有效的细胞浓度。裸鼠周龄不要小于四周，否则动物可能不能耐受，过 早死亡，也不可大于六周，否则免疫力会增强，不容易形成肿瘤。如果以上都不能成瘤，实验室之前又没有固定protocol，动物可以尝试NOD/SCID。细胞数量每个细胞株不同而有不同剂量，恶性程度高，有些胶质瘤，4次方就已经足够了，有些难长的， 恐怕7次方都嫌不够。但一般达到2×10的7次方就不能再往上加，因为细胞悬液已 经达到饱和状态，再往上增加细胞可能在注射时针管会对细胞有物理损伤。细胞悬液 大概是一个注射点150微升左右。另外，还可以添加matrigel，理论上可以促进成瘤。 裸鼠种植瘤需注意： 1、肿瘤细胞的状态 2、细胞的数量:每只注射 2X106-107 3、裸鼠的选择：5-8周龄 4、种植部位：血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。 （2）具体操作解析： 1、能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问题，但最高不要超过 1*107 2、接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1 小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错 的 3、成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也 不大好摸出来。
原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型
World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.360docs.net/doc/114447408.html,/journal/wjcr https://www.360docs.net/doc/114447408.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.360docs.net/doc/114447408.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/114447408.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。
人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立
人胃腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 动物：／c(／)裸小鼠，鼠龄6～1 0周，体重l5～25 g，雄性。饲养在无特殊致病菌、空气洁净的净化工作台内，室内恒温、恒湿，定期消毒。笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸气灭菌，并在无菌条件下适时更换。 方法：收集培养的823细胞(癌细胞在含10% 小牛血清的1640 培养液中，于2恒温孵育箱中培养，常规传代。)在细胞培养至对数期时，用1640制成约2×l07个／细胞悬液，取0．2(4x106个823细胞/只)注入裸小鼠颈部皮下或者背部皮下，每组接种3只鼠，当皮下移植瘤长至直径为l 3左右时取出移肿瘤（大约在10d左右），及时放入含无血清培养液的平皿中，A再在超净工作台内修剪肿瘤组织，去除脂肪，结缔组织及坏死肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤2次，将瘤组织切成约l ×l ×2的小块，加入适量的备用。 以戊巴比妥经腹腔注射麻醉裸鼠，常规消毒背部肩胛区，（切开局部皮肤）用无菌套管针抽吸准备好的23大小瘤块，将其接种于裸鼠背部肩胛区皮下，建立祼鼠皮下移植的人体胃癌祼鼠模型。作鼠间传代(2只／代)。 移植瘤生长特性：胃癌细胞接种后的第三天即可见到裸鼠接种处皮下出现结节，直径约1．5，质地较硬，在以后的几天中，上述皮下结节没有继续增大，此阶段为肿瘤细胞生长的潜伏期(7-10d左右)。随后，裸鼠皮下的肿瘤结节开始缓慢生长．体积逐渐增大。大概(25-30d)传代后荷瘤鼠皮下移植瘤的生长情况与初代移植瘤相近。 A具体操作： 1一般要求 需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后，用新吉尔灭(1∶1000)或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因，应予注意在高温季节操作时，应注意降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。 常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位；肌肉接种则用大腿肌肉；腹水型接种于腹腔。2瘤块的制备 接种用的瘤块应选择接种后7－10d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤(消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内，剪成2－33的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其它营养液，以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块，接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短，从一个瘤块所取的材料一般应在30内接种完。 3瘤细胞悬液的制备 如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种。具体方法为，在无菌操作下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1∶3－1∶4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2。整个操作应在30内完成。 停止给予受试物之次日(或停止给予受试物后1－5d)处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重。如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。应当减少剂量重新试验。
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用 王全凯1，杨全会2，郭静2，谢广云1，崔涛1，许荣焜2，许建宁1* 1. 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050 2. 中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005 摘要：目的建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物制剂疗效的观察。方法将人原发肝癌手术新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌组织裸鼠移植瘤动物模型；于同体移植后第15 天连续ig给予长科制剂（CKBM），通过观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，测定瘤体体积和质量、抑瘤率以及进行组织病理学观察，初步评价CKBM的抗肿瘤疗效。结果人肝癌组织裸鼠移植瘤保持了人肝癌组织特性，并能通过同体移植传代；观察发现CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤率达45.71%，对癌细胞生长有一定的抑制作用。结论在成功建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型基础上，观察发现CKBM具有一定的抗肿瘤疗效。 关键词：肝癌；裸鼠；移植瘤；动物模型；抑瘤率 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0398 - 05 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.018 Establishment and application of implantation model of human hepatocellular carcinoma in nude mice WANG Quan-kai1, YANG Quan-hui2, GUO Jing2, XIE Guang-yun1, CUI Tao1, XU Rong-kun2, XU Jian-ning1 1. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 2. Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China Abstract:Objective The human hepatocellular carcinoma model was established by implantation in BALB/c nude mice. Its characteristics were certified in the model which was used for the observation of antitumor efficacy. Methods Human hepatocellular carcinoma were sc implanted to BALB/c nude mice for the establishment of the implantation model of the human hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice. The nude mice were exposed to the pharmaceuticals from CK Life Sciences Limited by ig on day 15 after the implantation to find out its healing efficacy through the animal reflecting, the occurring time, volume, weight of tumors, the rate of tumor inhibited, and pathological histology. Results The characteristics of human hepatocellular carcinoma could be kept with passaging by autograft. The tumor inhibiting rate of the pharmaceuticals was 45.71%, showing the certain inhibitory effect on growth of tumor cells. Conclusion A certain antitumor efficacy of the pharmaceuticals made by CK Life Sciences Limited is found out on the basis on the human hepatocellular carcinoma model in nude mice established successfully. Key words: hepatocellular carcinoma; nude mice; implanted tumor; animal model; tumor inhibitory rate 人类肝癌的基础和临床实验研究多数都借助于实验动物模型。目前，以人肝癌组织移植裸鼠建立的动物移植瘤模型是最接近人类肝癌的整体实验模型，是肝癌基础和临床实验研究理想的动物模型。人肝癌组织裸鼠移植瘤模型是指把人肝癌组织块接种于裸鼠皮下建立的实验动物模型，常用于筛选抗肿瘤药物和制剂、实验性治疗和抗肿瘤机制研究[1]。基于为肝癌实验和临床研究以及药物筛选提供体内实验系统的目的，本研究建立了人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物长科制剂（CKBM）疗效的观察。 1材料与方法 1.1实验动物 BALB/c（nu/nu）裸小鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。饲养于中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学部 收稿日期：2013-06-03 作者简介：王全凯（1977—），男，北京人，主管技师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132199 E-mail: kylewang@https://www.360docs.net/doc/114447408.html, *通信作者许建宁，硕士生导师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132592 E-mail: jnx999@https://www.360docs.net/doc/114447408.html,
肝癌动物模型的建立_徐静
共识.中华肝脏病杂志,2004,12∶425～428 11 Perrillo RP ,Lai CL ,Liaw YF ,et al .Predictors of HBeAg loss after lamivudine treatment for chronic hepatitis B .Hepatotogy ,2002,36∶186～194 12 Rizzetto M ,Tassopoulos NC ,Goldin RD ,et al .Extended lamivu -dine treatment in patients with HBeAg -negative chronic hepatitis B .J Hepatol ,2004,41∶1070～1076 13 Ryu SH ,Chung YH ,Choi MH ,et al .Long -term additional lamivu -dine therapy enhances durability of lamivudine -induced HBeAg loss :a prospective study .J Hepatol ,2003,39∶641～619 14 Chien RN ,Yeh CT ,Tsai SL ,et al .Determinants for sustained HBeAg response to lamivudine therapy .Hepatology ,2003,38∶1267～1273 15 党红星,何瑞,马跃东.拉米夫定致小儿锥体外系反应二 例.中华儿科杂志,2004,42∶436 16 Lok ASF ,Zoulim F ,Locarnini S ,et al .Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus (HB V )-infected patients durin g lamivud ine therapy :evaluation of performance of INNO -LiPA HBV DR assay .J Clin Microbio ,2002,40∶3729～3734 17 Suzuki F ,Suzuki Y ,Tsubota A ,et al .Mutations of polymerase , precore and core promoter gene in hepatitis B virus during 5-year lamivudine therapy .J Hepatol ,2002,37∶824～830 18 Qaq ish RB ,Pharm D ,Mattes KA ,et al .Ad fovir dipivoxil :A new antiviral agent for the treatment of hepatitis B virus infection .Clin Therapeut ,2003,25∶3084～3099 19 Bozdayi AM ,E yigun CP ,Turkyilmaz AR ,et al .A novel pattern (sW195a )in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S )mutation selected during lamivudine therapy and success -ful treatment with adefovir dipivoxil .J Clin Virol ,2004,31∶76～77 20 Qarugan RB ,Gomez LC ,Serrano PL .Use of adefovir in the treat -ment of the chronic hepatitis B virus infection with res istance to lamivudine .Transplant Proc ,2003,35∶1841～1843 21 Villeneuve JP ,Durantel D ,Durantel S ,et al .Selection of a hepati -tis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation pa -tient .J Hepatol ,2003,39∶1085～1089 22 梁扩寰,主编.肝脏病学.第1版,北京:人民卫生出版社, 1995.520 23 张瑞琪,缪晓辉,倪武.膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例. 中华传染病杂志,2002,20∶180～181 (收稿:2004-12-10) (校对:郭顺明) 肝癌动物模型的建立 徐 静 综述 李 旭 审校 作者单位:230022 合肥市 安徽医科大学附属医院感染科 自20世纪初获得小鼠自发性肝癌动物模型以来,人们对肝癌动物模型的研究不断深入,逐渐建立了诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型及转基因动物肝癌模型。下面就各类肝癌动物模型的建立方法和特点作一简述。 一、自发性肝癌动物模型 是指实验动物未经任何有意识的人工处置,在自然情况下所发生的肿瘤。实验动物多选用近交系小鼠,由于实验动物种属、品系的不同,肿瘤发生类型和发病率有很大差异。14月龄以上的C3Hf 系雄鼠、C3H 系雄鼠和C3He 雄鼠的发生率分别为72%、85%和80%[1]。 自发性肝癌动物模型最大的优点是,系完全在自然条件下发生的疾病,排除了人为因素,肝癌的发生、发展与人类肝癌相似,反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度,但其发生率低且不稳定,发生时间较长、难预测且参差不齐,荷瘤动物个体在动物(性别、体重、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大,造模有一定的困难。该模型主要用于病理学研究和作为移植性肿瘤的瘤源。 二、诱发性肝癌动物模型 诱发性肝癌模型是指用化学、物理、生物的致癌因素在实验条件下诱发动物发生肝癌,它是 进行实验肿瘤学研究的常用方法。其中化学性致癌物最常见,如亚硝胺类(DEN )、黄曲霉素类(AFB1)、氨基偶氨燃料类(3′-Me -DAB )、芳香胺类化合物(2-AAF )等。最常用的实验动物为大鼠,多选用敏感性高的纯系大鼠。目前常用的品系有:Wistar 、Spraque -Dawley 和Fischer344,前两者在国内应用更为广泛。大鼠的年龄和性别均对致癌性有影响。一般认为幼年雄性大鼠对致癌的敏感性较高,但有时也可出现幼年雌性大鼠诱癌成功。鼠龄以3个月以内、体重120克以下的大鼠诱癌启动率高于月龄大的大鼠,而体重200克以上或1岁以上的大鼠的肝癌启动率低,很难诱发肝癌。这与其组织中的肝细胞或幼稚细胞的状态以及细胞的增殖水平有关。 诱发性大鼠肝癌的给药途径主要有经口给药法和注射给药法。经口给药法又分为自动口服给药和强制灌胃两种,前者是将水溶性致癌物溶于水中或将非水溶性致癌物混于饲料中让大鼠自动摄取,此法简单方便,但由于动物饮水和饲料的摄取量不同,不能保证给准确药量;后者是将溶于水或悬浮于载体的诱癌剂通过特制的灌胃针头给大鼠灌胃,此法能准确掌握给药量,但强制性操作和定时给药会对动物造成一定程度的机械性损伤和心理上的影响。注射法也是一种常用的方法,可将 诱癌剂溶于可溶性液体中或悬浮于载体中,通过各种部位注射
移植性肿瘤动物模型
移植性肿瘤动物模型 目前临床所使用的抗肿瘤药物，大多数是通过动物移植性肿瘤实验法筛选而被发现的，移植性肿瘤动物模型是现代肿瘤研究中应用的最广最有价值的模型。其优点包括：（1）可使一群动物被同时接种同样量的瘤细胞，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活率近100%；（2）对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效；（3）可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用；（4）试验周期一般较短，试验条件易于控制等。但是这类肿瘤生长速度快、增殖比高、体积倍增时间短、肿瘤生命性质简单，与人类肿瘤具有明显不同；特别是与人类的致死性实体恶性肿瘤生命性质、与生长发生机制差异更大。存在着能够为现代肿瘤基础生命科学研究模拟人类恶性肿瘤综合生命性质的局限性、片面性。现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway 骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，同样敏感株对抗癌药的疗效水
裸鼠移植瘤方法建立
1.细胞准备： 1.1用PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次， 然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得200μL 悬浮液里面含有1×107个细胞。总共需要细胞: 18（只）*200ul*1.2=4.32ml×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。 2.裸鼠准备： 2.1 3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞1×107/200μ L。每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2 )/2(D表示肿瘤的长径, d 表示肿瘤的短径)。（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G） 2.2 当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。对照组，TO901317组，DADS组。 每天（每天给药？会不会太频繁？可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有TO901317 的蓖麻油200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。连续注射两周。（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了） 腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。 2.3每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。照相结束后，用剪刀将每个肿瘤分成 3 份，一份用来提取总RNA，一份用来提取组织内总蛋白质，这两份组织放到冻存管里，冻于液氮罐中，第三份用来做免疫组化，因此，该样本须置于4%的多聚甲醛（有毒，小心配置）固定剂中进行固定。 备注： 1. 裸鼠饲养情况裸鼠有专门的SPF饲养动物房，买裸鼠前动物住的盒子、垫料、水和饲料要消毒。提前准备好，一般送裸鼠的单位会配备专门的SPF箱子，接到裸鼠后在专门裸鼠动物房进行交接。这个有个通风台也要提前消毒预备好。裸鼠到达目的饲养地后一般是饲养1-2周才开始试验，这也是国际上的通行规定。盒子要每2-3天消毒一次，根据裸鼠的排泄情况而定，所以要有替换的盒子。一般来说各个医院的动物房这些盒子比较紧缺，需要提前计算好。别到时候需要更换的时候找不到盒子。 2.动物接种数量根据你离心后细胞计数的数量。然后是用多少的液体稀释，一般是PBS。如果你培养后经 过离心收集到的细胞总数是1*108次方。也就是10*107次方/5×106个= 20个。那你可以稀释到4ml，每次给予0.2ml，正好可以接种20只裸鼠。根据肿瘤细胞的类型和你所给予的干预情况，一般接种3周瘤子可以达到0.5-1.2cm左右。 用左手揪起来一块皮，然后在揪起来的皮和身体之间那里注射，就是皮下而不是皮内了 先把针头插进去，然后挑起来，看清楚不是体内而是皮下，也没有戳穿皮肤，然后再开始注射 裸鼠的皮皱皱的，很容易揪起来一块，如果不麻醉就是用手拎着注射针头很容易戳到别的地方 放在4度30~40分钟对细胞活力影响不大。用哪种液体悬浮细胞也都行，用无血清培养基效果可能会好一点点。 应该是用PBS或HANKS液处理的,建议不要用无血清培养基或者其他培养液.里头成分复杂: 1,虽然裸鼠免疫缺陷,但是培养基成分复杂,有时还会有致敏原什么的,引起不必要的麻烦. 2,只要能够维持一定的渗透压,持续一个小时肯定是没有问题的,这点PBS或HANKS液就够了,而且影响因素少. 裸鼠对于实验环境又很敏感，特别是在给予药物处理之后。 不知道大家给药的灌胃器或注射器是否消毒？药液是否无菌过滤？ 3、操作是否严格
【CN110004109A】一种肝癌类器官模型的体外构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910255261.0 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 南通大学附属医院 地址 226001 江苏省南通市西寺路20号 (72)发明人 郑文杰 姚登福 张捷 金云峰 倪温恺 徐育青 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/09(2010.01) (54)发明名称 一种肝癌类器官模型的体外构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种肝癌类器官模型的体外 构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮 细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天， 半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连 续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明基于肿 瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均 一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增 培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝 癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强， 适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高 通量筛选等， 具有产业化意义。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 110004109 A 2019.07.12 C N 110004109 A
1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤： （1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基； 所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。 3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100μL。 4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。 5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50μL培养基，并加入等量培养基A。 6.根据权利要求书5所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100μL培养基B，隔日吸弃50μL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。 7. 根据权利要求书6所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第14天，使用1000μL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500μL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min，离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。8. 根据权利要求书1、2、3或4所述的一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养基A包括：100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、2~10μg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol/mL谷氨酰胺、4~8%胎牛血清、10~50ng/mL表皮生长因子、10~50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2~10μg/mL转铁蛋白、1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10~100 ng/mL肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110004109 A
人CHG_5胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析
文章编号:100025404(2003)0420287204论著人CHG25胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析 徐承平,卞修武 (第三军医大学附属西南医院病理学研究所,重庆400038) 提 要:目的 建立人脑胶质瘤裸鼠脑内原位移植动物模型并探讨其生物学特性。方法 采用瘤细胞悬液接种法,将人脑CHG25胶质瘤细胞接种于裸鼠大脑实质内。分别于接种后8、14、19、24和30d处死动物并行病理检查、胶质纤维酸性蛋白免疫组化、染色体核型分析及透射电镜检查。结果 肿瘤移植成瘤率为100%,肿瘤生长稳定,肿瘤病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型。结论 本移植瘤模型能作为研究胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。接种后14d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。 关键词:胶质瘤;动物模型;原位移植;裸鼠 中图法分类号:R2332;R732352;R730.264 文献标识码:A Establishment of orthotopic implantation model of human CHG25glioma cell line in nude mice and analysis of its biological features X U Cheng2ping,BI AN X iu2wu(Institute of Pathology,S outhwest H ospital,Third Military Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o establish an orthotopic im plantation m odel of human glioma in nude mice and investi2 gate its biological features.Methods The human CHG25glioma cells were inoculated into brains of nude mice.The animals were sacrificed at day8,14,19,24and30after inoculation.The tum ors were examined with light micro2 scope,electron microscope,kary otype analysis and immunohistochemical stain for glial fibrillary acidic protein.Re2 sults G liomas were formed in100%in nude mice,and the growth of tum ors was stable.The tum ors showed the m orphological of human glioma with the immunophenotype.Conclusion The glioma m odel in nude mice is a reliable animal m odel for the study of the tum origenesis and biological characteristics and therapy.The14th day af2 ter inoculation might be suitable for experimental study. K ey w ords:glioma;animal m odel;orthotopic im plantation;nude mice 恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一,其侵袭性强、发病率高、位置特殊、预后差,严重威胁着人类健康。建立一个可靠的胶质瘤异种移植瘤模型,是研究胶质瘤生物学特性和各种体内实验研究的基础。近年研究表明,肿瘤的原位移植(Orthotopic im2 plantation)动物模型是目前最为理想而可靠的肿瘤模型[1],但在脑部进行胶质瘤的原位移植瘤实验难度较大。为此,我们采用本室已建立的人脑恶性胶质瘤细胞系CHG25细胞接种于免疫缺陷动物裸鼠脑内,建立了一种人脑胶质瘤原位移植动物模型。 1 材料与方法 111 胶质瘤细胞来源及培养 人脑间变性星形细胞瘤细胞系CHG25由本室建立[2],按本 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970268) 作者简介:徐承平(1972-),男,重庆市涪陵人,硕士研究生,医师,主要从事肿瘤诱导分化治疗和血管生成方面的研究。电话:(023)68752246 通信作者:卞修武,E2mail:bianxiu wu@https://www.360docs.net/doc/114447408.html, 收稿日期:2002203212;修回日期:2002208209室常规方法培养,即用含10%小牛血清(河南郑州产品)的RP2 MI1640(Hyclone公司)完全培养基,另添加适量HEPES、双抗(100UΠml青霉素及100μgΠml链霉素)、3%谷氨酰胺,置37℃、5%C O2混合气体孵箱中培养,细胞换液时间为1～2d,每3～5d传代1次,传代前用0125%胰酶消化。 112 瘤细胞悬液的制备 取对数生长期的单层培养CHG25细胞以0125%胰酶消化,收集细胞,离心去上清,用无菌生理盐水离心洗涤2次,将细胞悬浮于生理盐水中,台盼蓝染色细胞活力测定大于90%,并进行细胞记数,调整细胞浓度为2×106Πml,置于冰上备用。接种细胞量1×104Π只。 113 实验动物和接种方法 使用本校实验动物中心引进的近交系雌性BA LBΠc nuΠnu 无胸腺裸小鼠14只,体重15～20g。鼠龄5～7周,饲养于SPF 级无菌净化室内。接种部位为裸鼠右侧大脑尾状核。整个接种过程在层流超净台中进行。裸鼠经1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,俯卧位固定头颅,75%酒精消毒头顶部皮肤后,接种部位的确定参照文献[3]并作适当修改,即在裸鼠额部距颅中线右侧215mm,冠状缝前1mm处先用直径为1mm的牙科钻小心钻穿颅骨,然后用吸有5μl瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑实质中,进针深度为针尖距颅骨表面315mm,注射前 782 第25卷第4期2003年2月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.25,N o.4 Feb.2003