冰冻切片免疫荧光染色流程

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min

↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin

切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)

冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存

免疫荧光实验步骤大全(精华版)

免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。

免疫荧光非特异性染色的消除方法

免疫荧光非特异性染色的消除方法 一、非特异性染色的主要因素 组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点： （1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 （4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法 消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种： （一）动物脏器粉末吸收法 常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。 肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。 用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧

免疫荧光技术的实验方法及其分类

免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

石蜡切片免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020

对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

石蜡切片免疫荧光染色方法

对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

免疫荧光染色

荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：

冰冻切片的免疫荧光

免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。-20℃保存3月，-80℃长期保存。请勿保存于液氮。 2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存 3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（A液枸盐酸缓冲液PH6.0，B液EDTA-Na缓冲液PH8.0，C液枸盐酸缓冲液PH4.5）

6，室温封闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白 7，一抗4℃过夜 请用封闭液稀释一抗 8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min 9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5min 11, DAPI 染核5min， 12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14，干片后4℃保存 石蜡切片的免疫荧光 1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块 2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水：58℃20min-

石蜡切片免疫荧光染色方法

对于石蜡切片： 1、烤片：60C 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中I脱蜡15分钟—二甲苯H脱蜡15分钟—无水乙醇 I 5分钟 —无水乙醇H 5分钟—90%乙醇I 5分钟—90%乙醇H 5分钟—70%乙醇5分钟 —蒸馏水5分钟—蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l 柠檬酸钠，pH6.0（柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中），上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷 缸中缓慢冷却至室温。 2.去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%HO2 （2ml H 202加入 18ml蒸馏水中，现配现用，避光），室温孵育10分钟，PBS洗3次, 每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3.封闭（Blocking） 加10%E常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4C封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意 样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4.一抗孵育（Primary antibody incubation） 参考- -抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PB）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗，4 C过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5.二抗孵育（Secondary antibody inucubation）

按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗， 立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小 时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6.蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观 察。 7.复染 用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS中洗5分钟X 3次，封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合) 显微镜观察，染色后为蓝色荧光。 多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186) 进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。 0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方： NaHC03 3.7g Na2CO3 0.6g 双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5

免疫荧光实验步骤

免疫荧光实验步骤 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020

免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 （1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 （2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L， 荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 （3）实验步骤 ① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 ④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 （4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。 ② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

石蜡切片免疫荧光染色方法完整版

石蜡切片免疫荧光染色 方法 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins)

贴壁细胞的免疫荧光染色方法

贴壁细胞的免疫荧光染色方法 Materials: 1. PBS solution 2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative): Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃to dissolve; 3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution) 4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution) 5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot; 6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure: 1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate; 2. Remove medium, rinse with PBS twice; 3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes; 4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time; 5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes; 6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature; 7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37?C for 30 minutes; 8. Add primary antibody solution, incubate at 4?C overnight; 9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes; 10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour; 11. Wash with PBS three times, 5 minutes each; 12. Add anti-fade DAPI solution if needed; 13. Observation. 细胞免疫荧光步骤 1.细胞爬片； 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)； 3.PBS漂洗5min；

组织切片免疫荧光染色的具体步骤

组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检

免疫荧光双染

免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 服务说明 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂 1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆

盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保 持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫 外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯 Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精 5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走）， 在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，

免疫荧光染色实验步骤

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。

免疫荧光染色

免疫荧光一般步骤 固定液配制： 常用固定液为4%多聚甲醛，将40g多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于1000ml 0.1M PB溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过70℃，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节PH值至7.4，过滤后室温或4℃放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O 3.74g；Na2HPO4.12H2O45.11g（500ml:1.87g,22.55g） 灌注固定： 快速生理盐水冲净血液（约需要100ml即可），4%多聚甲醛灌注（快速充灌100ml 左右，再慢速滴150ml）。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。 取材 按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（３，４，５）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。 后固定及蔗糖脱水： 组织取材后切成小块放入4%多聚甲醛中，为后固定，建议4℃过夜，随后转入40%蔗糖溶液中脱水（不沉底），3天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过长。脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用0.1M PB配制（见附录）。 冰冻切片： 漂染时，脊髓片厚可以25~30微米，神经节片厚要30微米 免疫荧光染色： 1.TBS溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选） 2.封闭液（10％血清+1%BSA）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别 膜抗原外，都需要加triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-100 3.一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是１μｇ／ｍｌ。（一 抗稀释液见附录，建议用） 4.TBS溶液清洗组织片5分钟×3 5.二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。 6.TBS溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×3 7.暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢 脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以。 8.90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和