海藻糖的提取与分离实验设计重点讲义资料
目录
海藻糖的提取与分离实验设计------------------------------------------ 2 前言----------------------------------------------------------- 2 关键词--------------------------------------------------------- 2
1、海藻糖的理化性质--------------------------------------------- 2
1.1密度----------------------------------------------------- 2
1.2熔点----------------------------------------------------- 2
1.3溶解热--------------------------------------------------- 2
1.4甜度----------------------------------------------------- 2
1.5溶解性、晶体析出性--------------------------------------- 2
1.6高玻璃化转变温度----------------------------------------- 3
1.7低吸湿性和保水性----------------------------------------- 3
1.8耐热、耐酸性--------------------------------------------- 3
1.9着色性--------------------------------------------------- 3
2、海藻糖的功效作用--------------------------------------------- 3
2.1保护功能------------------------------------------------- 3
2.2抑制淀粉老化--------------------------------------------- 4
2.3防止蛋白质变性------------------------------------------- 4
2.4抑制鱼腥味的产生----------------------------------------- 4
2.5抑制脂质氧化变质----------------------------------------- 5
2.6矫味作用------------------------------------------------- 5
3、海藻糖提取分离的原理和影响因素的预判------------------------- 5
3.1提取分离原理--------------------------------------------- 5
3.2海藻糖标准曲线的绘制原理--------------------------------- 6
3.3粉末活性炭脱色脱蛋白效果的表征--------------------------- 7
3.4离子交换树脂脱盐脱色效果的表征--------------------------- 7
3.5相关影响因素--------------------------------------------- 7
4、海藻糖提取分离的实验设计------------------------------------ 8
4.1实验原料与器材------------------------------------------- 8
4.2海藻糖提取与分离工艺流程--------------------------------- 9
4.2.1实验流程----------------------------------------------- 9
4.2.2相关因素对海藻糖提取效率的影响------------------------- 9
4.2.3相关因素对粉末活性炭脱色脱蛋白效率的影响-------------- 11
4.2.4相关因素对离子交换柱脱盐脱色效率的影响---------------- 15
5、总结------------------------------------------------------------ 17 参考文献----------------------------------------------------------- 18
海藻糖的提取与分离实验设计
化学132牟丽慧1301020414
前言海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性糖,广泛存在于海藻、酵母、霉菌、食用菌、虾、昆虫及生物体内，具有保湿性、抗寒抗旱性、耐热耐酸性等特殊的生物学功能，对生物大分子和生物体均有非特异性的保护作用。现如今，海藻糖已在生物制剂、化妆品、烘焙产品、水产畜产加工、米面制品、饮料和糖果以及农林种植等各个行业广泛使用。因此对于海藻糖的提取与分离的研究格外重要，本文将介绍海藻糖的理化性质、功效作用以及应用现状，并阐述对酵母中海藻糖的提取与分离工艺的实验设计。
关键词酵母、海藻糖、性质、功能、提取分离
1、海藻糖的理化性质
1.1密度：结晶海藻糖1.512cm3
/g。
1.2熔点：结晶海藻糖97℃,于130℃失水；无水海藻糖210.5℃。
1.3溶解热：结晶海藻糖57.8KJ/mol，无水海藻糖53.4KJ/mol。
1.4甜度：相当于蔗糖的45%，是一种甜味柔和的优质糖质。其温和的甜味比砂糖更为持久，可改善高砂糖含量食品的甜腻感，与其他的甜味料配合,能将食品素材特有的味感提升出来。
1.5溶解性、晶体析出性：海藻糖易溶于水、热乙醇、冰醋酸，
不溶于乙醚、丙酮。海藻糖在水中的溶解度随温度变化较为明显。低温时在水中的溶解度比砂糖低，与麦芽糖相同。此外，海藻糖易于结晶，结晶性能良好。
1.6高玻璃化转变温度：海藻糖具有双糖中最高的玻璃化转变温度，高达115℃，因而把海藻糖加入到其他的食品中时，能有效地提高其玻璃化转变温度，更容易形成玻璃化状态，可以发挥保持玻璃化，保持新鲜度的作用。
1.7低吸湿性和保水性：二水结晶海藻糖在相对湿度92%以下无吸湿性，而无水海藻糖在相对湿度30%以上有吸湿性。这一性质使其既具有低吸湿性,又具有高保湿性功能。
1.8耐热、耐酸性：于100℃加热24h海藻糖仍可保存99%以上。这种特殊的分子结构赋予了海藻糖分子极强的稳定性，是天然二糖中最稳定的分子。
1.9着色性：海藻糖不会引起美拉德反应。和甘氨酸于100℃反应90min不呈色，和聚蛋白胨120℃反应90min不呈色，有利于保持食品色泽，适合于须加热处理或高温保存的食品、饮料等[1]。
2、海藻糖的功效作用
2.1保护功能
海藻糖的功能最特别的地方是其生物学特性，在很多生物体内海藻糖不仅以游离糖的成分存在，还是各种糖脂的重要组成部分。常年生活热带沙漠中的一些植物和昆虫，在阳光暴晒之下几乎完全脱水，
但是仍然保持着生物活性，以极低的新陈代谢长期保持生存状态，一旦遇水就能恢复正常生命活动，就是因为体内存在着较高浓度的海藻糖。研究表明，许多物种在极端条件下，比如高温、高压、冷冻等条件下，可以通过调节体内海藻糖来抵御外界的影响。此外海藻糖还具有酒精耐受性，并具有较强的抗辐射的功效。
海藻糖除了具有出色的生活学功效之外，在食品应用中也具有众多的功效，比如抑制淀粉老化、防止蛋白质变性、抑制鱼腥味的产生、抑制脂质氧化变质、矫味作用等。
2.2抑制淀粉老化
海藻糖在抑制淀粉老化方面比蔗糖以及麦芽糖等要有明显的优势。研究发现在含有淀粉和白砂糖的溶液中，用海藻糖部分替代白砂糖，能有效延缓淀粉老化的进程。
2.3防止蛋白质变性
牛奶、豆制品、蛋类以及鱼虾等海鲜类产品，在产品加工过程中，由于加热、冷冻或者干燥等工序的影响，化学性质会发生变化，产生沉淀现象，就是所谓的蛋白变性。实验证明，一些富含蛋白质的食品在添加海藻糖之后，有明显的防止蛋白变性的效果。
2.4抑制鱼腥味的产生
在鱼类食品加工过程，尤其是在加热处理时会产生三甲胺，这就是鱼类食品令人不快的腥味的主要成分，在加热前加入海藻糖能抑制三甲胺的生成，降低不快臭味的产生，添加海藻糖，也能减轻鸡、鸭、鹅肉等怪味。
2.5抑制脂质氧化变质
脂类物质氧化会产生过氧化物和挥发性醛等，使食品风味变差甚至失去食用价值，海藻糖对油脂构成成分中的脂肪酸分解具有很好的抑制作用。
2.6矫味作用
少量添加一些物质调整食品口味和香味，这种现象叫做矫味、矫香作用。若把海藻糖少量添加在食品材料里，就可起到广泛的矫味、矫香作用。
3、海藻糖提取分离的原理和影响因素的预判
3.1提取分离原理
从活性干酵母中提取海藻糖的原理是在高温和乙醇或水的共同作用下使酵母细胞破碎，海藻糖从破碎的细胞中释放出来。同时，酵母细胞内的蛋白质、色素等杂质也释放出来，分散在提取剂中，因此需要对提取液进行脱色脱蛋白质处理。本实验设计选用粉末活性炭直接处理提取液，脱色脱蛋白同步完成，操作条件水浴振荡。pH、温度、活性炭用量、脱色脱蛋白时间、搅拌速度、是影响活性炭脱色脱蛋白质的因素。经活性炭处理过后的海藻糖提取液中含有大量的的盐类及少量色素，因此可以用离子交换树脂进一步处理以除去盐类及少量色素。离子交换树脂有很强的离子交换能力,它能除去溶液中的阴阳离子杂质以及离子型的色素,尤其是大孔型离子交换树脂,不但能吸附离子型的杂质,还能吸附各种非离子型杂质，因此本实验设计选用大孔
离子交换树脂并组成离子交换柱对海藻糖提取液进行脱盐脱色精制。
3.2海藻糖标准曲线的绘制原理[2]
要想比较不同条件下海藻糖提取的效率，必须要找到一个可以测出海藻糖含量的方法，本实验设计引用蒽酮法和海藻糖标准曲线来测海藻糖含量。
(1)称取海藻糖标准样品l0mL，加蒸馏水定容至100mL得到标准液。分别取0.5mL，1mL，2mL,3mL,4mL,5mL, 6mL, 7mL, 8mL标准液置于己编号的l0mL容量瓶中，加蒸馏水定容。
(2)称取葱酮固体25mg加50mL浓硫酸配制成硫酸蕙酮溶液置于烧杯中(用时配制)。
(3)分别从上述l0mL容量瓶中各取1mL海藻糖溶液置于编号的试管中，各加4mL蕙酮溶液，另外取一个试管加1mL蒸馏水和4mL蕙酮溶液作为参比液。将它们混合均匀后放入冷水中，然后置于沸水浴中煮l0min后立即取出放入冷水中迅速冷却，等到各管溶液达室温后，用lcm厚度的比色皿，以参比液为空白，迅速测定其余各管的光吸收值。
(4)以各管海藻糖的浓度为横坐标(mg/mL)，吸光度(A620nm)为纵坐标，画出糖含量与A620nm值的相关标准曲线，用最小二乘法回归得标准曲线方程。
3.3粉末活性炭脱色脱蛋白效果的表征[4]
本实验用脱色率来表示蛋白质和色素的脱除效果。脱色率用
A A
A
12
1
计算(A1为海藻糖提取液脱色脱蛋白前于420nm下测量的吸光度，A2为海藻糖提取液在用活性炭脱色脱蛋白后于420nm下测量的吸光度)。
3.4离子交换树脂脱盐脱色效果的表征
脱盐效果的表征：利用电导率法测定溶液中的总离子含量。因海藻糖提取液中离子种类繁多，所以采用复合电极测定溶液的电导率来表征溶液中离子的含量。
脱色效果的表征：海藻糖提取液中的色素含量可用紫外分光光度法进行测定。
3.5相关影响因素
从液泡中释放出的海藻糖酶能将海藻糖水解为葡萄糖，本实验中海藻糖酶的活性是影响海藻糖提取率的关键因素，而乙醇能够抑制酶的活性，因此在本次实验设计中选择乙醇做提取剂。影响提取率的具体因素有乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间。影响脱色脱蛋白效率的因素有pH、温度、活性炭用量、脱色脱蛋白时间、搅拌速度。影响大孔离子交换树脂脱盐脱色的效率的因素有阴阳离子树脂的组装顺序、填充比例、提取液的流速(此时提取液的pH及温度取前
面实验得到的最佳提取pH和提取温度)。明确实验原理和相关影响因素有助于下一步的实验设计。
4、海藻糖提取分离的实验设计
4.1实验原料与器材
实验试剂
安琪活性干酵母（湖北安琪酵母股份有限公司）
95%乙醇（天津化学试剂有限公司）
98%硫酸（天津文达希贵试剂化工厂）
蕙酮（分析纯,江苏石浦试剂厂）
海藻糖标准品（上海恒信化学试剂有限公司）
实验仪器
旋转蒸发器RE-52A型(上海亚荣生化仪器厂)
LDZ-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)
PHSJ-4A型实验室pH计（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）FA1104电子天平(上海天平仪器厂)
752紫外光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)
SHB-III循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)
容量瓶(10ml,50ml,200ml,1000ml)
量筒(50ml)移液管(5ml,1ml,0.25ml)
锥形瓶、烧杯、试管若干、布什漏斗、抽滤瓶[3]
4.2海藻糖提取与分离工艺流程
4.2.1实验流程：活性干酵母→乙醇溶液高温提取→离心→上清液→粉末活性炭脱色脱蛋白→离子交换树脂脱盐脱色→清液→浓缩→结晶→过滤及干燥→成品
4.2.2相关因素对海藻糖提取效率的影响
4.2.2.1单因素实验——乙醇浓度
分别取10g活性干酵母依次加入体积分数为20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的100ml乙醇溶液中，在80℃下于旋转蒸发器内搅拌提取1小时得到海藻糖提取液，然后以3000r/min的速度离心20分钟，倒出上清液，将上清液稀释到适当倍数，利用分光光度计在620nm下测吸光度并根据海藻糖标准曲线方程计算出海藻糖含量，并填入表一，然后比较分析。
表一海藻糖提取单因素实验（乙醇浓度）实验结果
乙醇浓度2
%
30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
吸光度
海藻糖含量
通过比较分析，可以得出最优提取乙醇浓度A。
4.2.2.2单因素实验——料液比
分别取0.5g活性干酵母与浓度A的乙醇溶液按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50混合，在80℃下于旋转蒸发器内搅拌提取1小时。将提取液以3000r/min 离心20分钟，倾出上清液。将上清液稀释到适当的倍数，利用分光光度计在620nm下测吸光度并根据海藻糖标准曲线方程计算出海藻糖含量，并填入表二，然后比较分析。
表二：海藻糖提取单因素实验（料液比）实验结果
固液比1∶51∶101∶151∶201∶251∶301∶451∶50
吸光度
海藻糖含
量
经过比较分析，可以得出最优料液配比为B。
4.2.2.3单因素实验——提取温度
以料液比为B的比例混合海藻糖和乙醇溶液，分别在50℃, 60℃，70℃, 80℃, 90℃下于旋转蒸发器内搅拌提取1小时，将提取液以3000r/min离心20分钟，倾出上清液。将上清液稀释到适当的倍数，利用分光光度计在620nm下测吸光度并根据海藻糖标准曲线方程计算出海藻糖含量，并填入表三，然后比较分析。
表三：海藻糖提取单因素实验（提取温度）实验结果
提取温度/℃50 60 70 80 90 吸光度
海藻糖含量
通过比较分析，得出最优提取温度为C。
4.2.2.4单因素实验一提取时间
以料液比为B的比例混合海藻糖和乙醇溶液，在C℃下于旋转蒸发器内分别搅拌提取0. 5小时，1小时，1.5小时，2小时，3小时。将提取液以3000r/min离心20分钟，倾出上清液。将上清液稀释到适当的倍数，利用分光光度计在620nm下测吸光度并根据海藻糖标准曲线方程计算出海藻糖含量，并填入表四，然后比较分析。
表四：海藻糖提取单因素实验（提取时间）实验结果
提取时间0.5h1h 1.5h2h3h
吸光度
海藻糖含量
通过比较分析，得出最优提取时间为D。
4.2.3相关因素对粉末活性炭脱色脱蛋白效率的影响
前面已经提到，在用乙醇提取海藻糖的过程中，酵母细胞内的蛋白质、色素等杂质也释放出来，分散在提取剂中，因此需要对提取液进行脱色脱蛋白质处理。其中，pH、温度、活性炭用量、脱色脱蛋白时间、搅拌速度、是影响活性炭脱色脱蛋白质的因素。现设计实验研究上述各因素的最佳使用条件。
实验仪器及试剂
实验仪器
HZS-H水浴震荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);
752紫外光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)
实验试剂
海藻糖提取液(实验室制备);
粉末活性炭(北京某活性炭厂);[5]
4.2.3.1单因素实验-pH
分别将海藻糖提取液的pH调至3.0，3.2，3.5, 3.8, 4.1，4.5, 5.0，在420nm下测量的吸光度为A1,然后加入活性炭混合均匀，活性炭用量为1% (g/mL)，放入水浴振荡器中并将转速设为100r/min，时间为30分钟，温度40℃，再于420nm下测量吸光度为A2,记录在表一中，计算脱色率并分析实验结果。
表一：海藻糖提取液脱色脱蛋白单因素实验（pH）实验结果
pH 3.0 3.2 3.5 3.8 4.1 4.5 5.0 A1
A2
脱色率
经过比较分析，得出最佳脱色脱蛋白的pH为E。
4.2.3.2单因素实验一温度
取六组海藻糖提取液，将pH调至E，在420nm下测量的吸光度为A1，
加入活性炭混合均匀，活性炭用量为1% (g/mL )，放入水浴振荡器中并将转速设为100r/min，时间为30分钟，温度分别为20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃，再于420nm下测量吸光度为A2,记录在表二中，计算脱色率并分析实验结果。
表二：海藻糖提取液脱色脱蛋白单因素实验（温度）实验结果
温度20 30 40 50 60 70
A1
A2
脱色率
通过分析实验结果得出最佳脱色脱蛋白温度为F。
4.2.3.3单因素实验一时间
将海藻糖提取液的pH调至E，在420nm下测量的吸光度为A1，加入活性炭混合均匀，活性炭用量为1% (g/mL )，放入水浴振荡器中并将转速设为100r/min，温度为F，设定反应时间分别为10min, 15min, 20min, 30min, 40min，再于420nm下测量的吸光度为A2，记录在表三并计算脱色率。
表三：海藻糖提取液脱色脱蛋白单因素实验（时间）实验结果
时间/min 10 15 20 30 40
A1
A2
脱色率
通过分析实验结果，得出最佳脱色脱蛋白的时间为G
4.2.3.4单因素实验一活性炭用量
将海藻糖提取液的pH调至E，在420nm下测量的吸光度为A1，加入
活性炭混合均匀，改变活性炭用量为0. 5%. 1. 0%, 2. 0%, 2. 5%.3. 0%，放入水浴振荡器中并将转速设为100r/min,温度F ，时间G ，再于420nm 下测量的吸光度为A2，记录在表四并计算脱色率。 表四：海藻糖提取液脱色脱蛋白单因素实验（活性炭用量）实验结果
通过比较试验结果，得出活性炭最佳用量为H 。 4.2.3.5单因素实验一搅拌速度
海藻糖提取液的pH 调至E ，在420nm 下测量的吸光度为A1,加入活性炭，摇匀，活性炭用量为1% (g/mL)，放入水浴振荡器中并将转速分别调为50r/min, 80r/min, 100r/min, 120r/min, 140r/min ，时间为G 分钟，温度F ，再于420nm 下测量的吸光度为A2，记录于表五并计算脱色率。
表五：海藻糖提取液脱色脱蛋白单因素实验（搅拌速度）实验结果
经过分析实验结果得出最佳搅拌速度为I 。
活性炭用量/%
0.5 1 2 2.5 3 A1 A2 脱色率
搅拌速度/r/min
50 80 100 120 140 A1 A2 脱色率
4.2.4相关因素对离子交换柱脱盐脱色效率的影响
前面已经提到，经活性炭处理过后的海藻糖提取液中含有大量的的盐类及少量色素，本实验设计使用大孔离子交换树脂对海藻糖提取液进行脱盐脱色处理，在用离子交换树脂精制海藻糖时，阴阳离子交换树脂不仅对阴阳离子等带电物质有很强的静电吸附作用，同时海藻糖也会受到树脂的吸附力(共价键、氢键等)的吸附，但其吸附作用较前者弱，可以用蒸馏水洗脱。在吸附过程中，吸附量会受到阴阳离子树脂的组装顺序、填充比例、提取液的流速的影响，本次实验设计中，利用电导率法测定溶液中的总离子含量。因海藻糖提取液中离子种类繁多，所以采用复合电极测定溶液的电导率来表征溶液中离子的含量；海藻糖提取液中的色素含量可用紫外分光光度法进行测定
实验准备
1.实验材料：
海藻糖提取液(本实验提取并经活性炭脱色);
D201大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂；D151大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂。
2.实验仪器：
DDSJ-308A型电导率仪(上海雷磁仪器厂)；
752紫外光栅分光光度计(上海分析仪器总厂)
量筒
层析柱
4.2.4.1单因素实验—阴阳离子交换树脂组装顺序
取D201树脂与D151树脂各50mL，分别以先阳离子交换柱后阴离子交换柱和先阴离子交换柱后阳离子交换两种方式组成串联式离子交
换柱。控制恒流速使250mL海藻糖提取液以1mL/min-1.2mL/min流速匀速分别通过串联式离子交换柱，然后测量电导率和吸光度的值，记录在表一中并分析实验结果得出最佳方案。
表一：阴阳离子交换柱组装顺序的影响
顺序过柱前的电导率过柱后的电导率过柱前吸光度过柱后吸光度先阳离子后阴离
子
先阴离子后阳离
子
经过分析得出最佳组装顺序为X
4.2.4.2单因素实验—阴阳离子交换树脂填充比例
依次以阴阳离子体积比为2:8，3:7，4:6,5:5, 6:4,7:3,8:2的比例，按上述实验确定的顺序加入各层析柱中，然后控制恒流速使250mL海藻糖提取液以1mL/min-1.2mL/min流速匀速分别各离子交换柱，然后测量电导率和吸光度的值，记录在表二中并分析实验结果得出最佳方案。
表一：阴阳离子交换柱填充比例的影响
填充比例过柱前的电导率过柱后的电导率过柱前吸光度过柱后吸光度2：8
3：7
4：6
5：5
6：4
7：3
8：2
经过分析得出最佳填充比例为Y
4.2.4.3单因素实验—提取液的流速
以上述最佳组装顺序及填充比例组装离子交换柱，然后使250ml海藻糖提取液以0.5ml/min、0.8ml/min、1mL/min、1.2mL/min、1.5ml/min 的流速分别通过离子交换柱，测量电导率及吸光度的值，记录在表三中并分析实验结果得出最佳方案。
表三提取液流速的影响
过柱前的电导率过柱后的电导率过柱前吸光度过柱后吸光度提取液流速
ml/min
0.5
0.8
1.0
1.2
1.5
经过分析得出最佳流速为Z
5、总结
以上分别对海藻糖用乙醇溶液提取、粉末活性炭脱色脱蛋白、大孔离子树脂脱盐脱色的影响因素进行了研究，通过实验结果，可以得出最优的海藻糖的提取分离方式，从而使人们更高效率地利用它。
参考文献
[1] 王乃强，张艳君，薛雅莺，栾庆民，杨海军。《海藻糖的性质及应用新产品开发》（2014年01期）
[2]张丽杰，《高产海藻糖菌株的诱变育种、培养基优化及提取纯化的研究》中国生化药物杂志2002，23（6）：278-280
[3]张雪莲，《从酵母中提取纯化海藻糖》河北工业大学2005-01-01
[4]王秀奇，秦淑媛等，《基础生物化学实验》高等教育出版社2002
[5]张雪莲，《从酵母中提取纯化海藻糖》河北工业大学2005-01-01
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
实验设计的统计学基本原则
第十一章实验设计的统计学基本原则 实验（Experiment）：指由研究者主动地决定给予部分实验对象某种处理，给予另部分对象某种对照处理的研究设计形式，这种处理的分配常常是随机的。 实验设计（Experimental design）：是通过良好地计划对象的选择、处理因素的分配、结果指标的测量和资料分析来保证比较组间对象和实验条件是均衡的，实验结果有较好的可比性，并且较好地控制误差以能用较小的样本获取可靠的结论。 一．实验设计的三要素：受试对象、处理因素和实验效应。 1．处理因素（treatment）：根据研究目的，对受试对象施加的某种措施，称为处理因素。 注意：①抓住主要因素。 ②控制混杂因素（“非处理因素”在各组中应尽可能相同）。 ③标准化（处理因素应该标准化，即研究过程中处理应该自始至 终保持一致，不能因任何原因中途改变。）
2．受试对象（subject）：动物——种类，品系，窝别 人——诊断，依从性 注意受试对象的同质性 (homogeneity) 3．实验效应（effect）： 指标选择：有效，客观，灵敏，精确。（头痛，发烧） 指标观察：对人的观察应注意避免偏性，提倡盲法。 主观指标的量化：如划记评分。 完全不满意完全满意 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 二．实验研究的分类：根据实验的对象不同，实验分成三类。 1. 动物实验（animal experiment） 2. 临床试验（Clinical trial） 3. 现场干预试验（Intervention trial）
三．实验中的变异及其来源： 在实验中，由于实验对象自身特点、实验条件的变化和实验结果测量的不确定性造成实验结果与真值的差别称实验误差，根据统计分析上的处理不同，实验误差分成两类： 1. 随机误差：由大量、微小的、偶然的因素的共同作用引起的不易控制的误差称随机误差。如在实验中，温度、湿度、风向、振动、试剂、仪器、操作员等都可能造成结果的偏差。 随机变异是没有倾向性的，在大量观察条件下，随机误差的分布呈标准N。随机误差的规律可以用统计方法分析。 正态分布()1,0 2.系统误差（systematic error）：由于在对象选择、处理因素分配的不随机、测量结果的不准确造成实验结果有倾向性地偏离真值称系统误差，或称偏倚（bias）。
实验设计的要素与原则
实验设计的要素与原则
第一节实验设计的基本要素 一个良好的科学实验设计是顺利进行科学研究和数据统计分析的前提，同时也是或得预期结果的重要保证。一个完善的统计学研究设计包括三个基本要素：受试对象、处理因素和试验效应。例如，研究某降压药对原发性高血压患者的降压效果，其中高血压患者即为受试对象，这种降压药为处理因素，血压的变化便是试验效应。科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，必须要制定完善的统计研究设计方案，如何选择这三个要素，是实验成败的关键。因此，任何实验研究在设计时，必须明确这三个要素。 一、受试对象 受试对象是处理因素作用的客体，应该根据研究目的来确定。受试对象的选择一般有以下几种情形：l、一般医学科研——常用动物、离体标本或人体内取得的某些样本作为受试对象；2、新药的临床前试验——一般用动物作为受试对象；3．新药的临床试验阶段——一般用人作为受试对象。新药临床试验一般分为4期，在1期临床试验阶段，通常用健康志愿者作为受试对象；而在其他各期临床试验阶段，常用患特定疾病的患者作为受试对象。选择什么样的患者，应有严格的规定。 选择受试对象应有明确的纳入标准和排除标准。首先，受试对象应满足两个基本条件：一是对处理因素敏感；二是反应必须稳定。其次是为是研究结果普遍性和推广价值，需保证受试对象的同质性和代表性。
二、处理因素 处理因素是研究者根据研究目的而施加的特定的实验因素，例如给予的某种降压药。实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。若在整个实验过程中影响观察结果的因素很多，就必须结合专业知识，对众多的因素做全面分析，必要时做一些预实验，区分哪些是重要的实验因素，哪些是非重要的实验因素，以便选用合适的实验设计方法妥善安排这些因素。水平选取的过于密集，实验次数就会增多，许多相邻的水平对结果的影响十分接近，不仅不利于研究目的的实现，而且将会浪费人力、物力和时间；反之，该因素的不同水平对结果的影响规律不能真实地反映出来，易于得出错误的结论。除此以外，处理因素应当标准化，在实验过程中同一处理组的处理因素应始终保持不变，包括处理因素的施加方法、强度、频率和持续时间等。在缺乏经验的前提下，应进行必要的预实验或借助他人的经验，选取较为合适的若干个水平，如药物的种类、处理方法的种类等。应结合实际情况和具体条件，选取质最因素的水平，千万不能不顾客观条件而盲目选取。 三、实验效应 实验效应是反映在处理因素的作用下，受试对象的反应或结局，它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高的客观指标。对一些半客观（如读取病理切片或X片上所获得的结果）或主观指标（如给某些定性实验结果人为打分或赋
医学科研实验设计的三大要素
医学科研实验设计的三大要素[关键词] 医学科研要素健康网讯: 熊国强(湖南医科大学卫生统计学教研室长沙410078)贺石林(湖南医科大学生理学教研室长沙410078)科研的基本要素包括处理因素、受试对象和实验效应。如用某种传统西药或中成药治疗缺铁性贫血病人，观察比较两组病人血红蛋白的上升趋势，该研究中所用的两种药物称为处理因素，缺铁性贫血病人称为受试对象，血红蛋白称为实验效应。如何正确选择三大要素是科研中专业设计的关键问题。处理因素(受试因素) 通常指由外界施加于受试对象的因素，包括生物的、化学的、物理的或内外环境的。但是生物本身的某些特征(如性别、年龄、民族、遗传特性、心理因素等)也可作为处理因素来进行观察。因此，研究者应正确、恰当地确定处理因素。一般应注意以下几点：①抓住实验研究中的主要因素。研究中的主要因素是按以往研究基础上(本人或他人)提出的某些假设和要求来决定的。一次实验涉及的处理因素不宜太多，否则会使分组增多，受试对象的例数增多，在实施中难以控制误差。然而，处理因素过少，又难以提高实验的广度和深度。因此，需根据研究目的的需要与实施的可能来确定带有关键性的因素。②找出非处理因素。除了确定的处理因素以外，凡是影响实验结果的其他因素都称为非处理因素，所产生的混杂效应也影响了处理因素产生的效应对比和分析，这些非处理因素又称混杂因素。例如上述两种不同药物治疗缺铁性贫血病人的试验，非处理因素可能有年龄、性别、营养状况等。如果两组病人的年龄、性别、营养等构成不一，则可能影响药物疗效的比较。因此设计时便设法控制这些非处理因素，只有这样才能消除它们的干扰作用，减小实验误差。③处理因素必须标准化。处理因素的强度、频率、持续时间与施加方法等，都要通过查阅文献和预备试验找出各自的最适条件，然后订出有关规定和制度，并使之相对固定，否则会影响试验结果的评价。如处理因素是药物，必须正确选择批号，给药途径和时间也应标准化和相对固定化。受试对象(研究对象) 受试对象的选择十分重要，对实验结果有着极为重要的影响。大多数医学科研的受试对象是动物和人，也可以是器官、细胞或分子。但中药种植中培育品系的研究则将药用植物列为受试对象。在医学科研中，作为受试对象的前提是所选对象必须同时满足两个基本条件：①必须对处理因素敏感；②反应必须稳定。因此，在观察新药的临床疗效试验中，应当选择中等程度中青年患者，只有这样才能显示疗效率高低的差别。受试对象的疾病应诊断明确(依照国内或国际统一的诊断标准)，且表现具有典型性。研究者必须深知病人的心理状况、情绪起落、病情程度、病程长短、生活习惯、个人嗜好、家庭经济收入、食品种类等都不同程度地影响疗效，这些影响因素必须很好地加以控制，使组间均衡化。根据研究目的不同，对实验动物的选择要求也不同。动物的选择应有针对性地注意种类、品系、年龄(月龄)、性别、体重、窝别和营养状况等。为保证实验效应的精确性，某些动物的生活环境还有严格要求。 [!--empirenews.page--] 试验效应试验效应内容包括试验指标的选择和观察方法两个部分。指标的选择有以下要求：①指标的关联性，选用的指标必须与所研究的题目具有本质性联系，且能确切反映被试因素的效应。所选指标是否具有关联性，充分反映了研究者的专业知识与技术水平。②指标的客观性，指标数据来源决定它的主、客观性质。主观性指标来自观察者或受试对象，易受心理状态与暗示作用的影响，在科研中一般尽量少用。客观性指标是指通过精密设备或仪器测定的数据，能真实显示试验效应的大小或性质；排除了人为因素的干扰。③指标的灵敏度，通常是由该指标所能正确反映的最小数量级或水平来确定。如溶液中物质含量的测定，除测出下限值以外，还可测出最低改变浓度来反映灵敏度。一般要求其灵敏度能正确反映处理因素对受试对象所引起的反应就够了，并非灵敏度越高越好。④测定值的精确性，精确性具有指标的精密度与准确度双重含义。准确度是测定值与真实值接近的程度。精密度是重复测定值的集中程度。从设计角度来分析，第一强调准确，第二要求精密。既准确又精密最好，准确但精密度不理想尚可，而精密度高但准确度低则不行。应当强调指标的精确性除与检测指标的方法、仪器、试剂及试验条件有关外，还取决于研究者的技术水平及操作情况。⑤指标的
实验设计的三要素与六原则
实验设计的三要素与六原则 一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。 一、实验设计的“三要素” 1）实验对象。实验所用的材料即为实验对象。如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。样本过大或过小都有弊端。 2）实验因素。所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。研究者希望通过研究设计进行有计划的安排，从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素（如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等）；对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或称重要的非实验因素（如动物的窝别、体重等）；其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。最好通过一些预实验，初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合适，以免实验设计过于复杂，实验难以完成。 3）实验效应。实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高、准确可靠的客观指标。对一些半客观（比如读pH试纸上的数值）或主观指标（对一些定性指标的判断上），一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。 二、实验设计的“六原则” 1）随机原则：即运用“随机数字表”实现随机化；运用“随机排列表”实现随机化；运用计算机产生“伪随机数”实现随机化。尽量运用统计学知识来设计自己的实验，减少外在因素和人为因素的干扰。 2）对照原则：空白对照组的设立——只有通过对照的设立我们才能清楚地看出实验因素在当中所起的作用。当某些处理本身夹杂着重要的非处理因素时，还需设立仅含该非处理因素的实验组为实验对照组；历史或中外对照组的设立一一这种对照形式应慎用，其对比的结果仅供参考，不能作为推理的依据；多种对照形式同时并存。 3）重复原则：所谓重复原则，就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。一般认为重复5次以上的实验才具有较高的可信度。 4）平衡原则：一个实验设计方案的均衡性好坏，关系到实验研究的成败。应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。在实验设计的过程中要注意时间上的分配，只有在时间上分配好了，才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。 5）弹性原则：所谓空格，指的是在时间分配图上留有空缺。适当的空缺是非常必要的，只有这样才能富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。 6）最经济原则：不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件作基础的。
《物质的分离与提纯》教学设计
苏教版化学必修1专题1第2单元（第1课时） 《物质的分离与提纯》教学设计 一、教学设计思路 化学实验是化学科学的基础之一，与其它自然学科相比，化学与实验的联系应更为紧密，化学原理、定律以及规律的发现都与化学实验密不可分，可以说离开化学就没有这些发现。本单元教学设计重在要让学们在实验中亲身体验化学实验室研究物质的重要方法，从中掌握相关的化学实验操作技能和化学实验方法，并在全课教学中进行启发式教学，通过情境设计、引导学生回忆已有知识对问题进行分析，得出物质分离的几种常用方法，并通过自己设计实验方案达到对知识运用、迁移的能力，这样既能提高学生学习积极性，也能全方位地提高学生的能力。本节课的教学设计安排了大量的实验，为学生的自主探究提供了直接观察和动手操作的平台。 二、学习任务分析 1、《课程标准》、《学科教学指导意见》对本课教学内容的要求 《课程标准》的要求：①初步学会物质分离、提纯等实验技能；②学习必要的化学实验技能，体验和了解化学科学研究的一般过程和方法，认识实验在化学学习和研究中的重要作用；③体验科学探究的过程，学习运用以实验为基础的研究方法；④能够独立或与同学合作完成实验，记录实验现象和数据，完成实验报告，并能主动进行交流。 《学科教学指导意见》的基本要求：了解蒸馏、萃取、分液、过滤、结晶等实验方法。 2、本课内容的组成成分和在模块学习中的地位和作用 （1）本课内容的组成成分 本节教材主要介绍了几种常用的物质分离与提纯的方法，以物质分离的物理方法→化学方法→仪器方法为暗线，首先简单温习了初中已经介绍过的几种物质分离方法：过滤、蒸发、结晶。然后以溴的萃取为例介绍了“萃取”这种分离方法以及分液，又以蒸馏自来水获取少量纯净自来水为例介绍了“蒸馏”，最后以“拓展视野”的形式简单介绍了层析法的发展与应用。 （2）在模块学习中的地位和作用 本节课编排在专题1第二单元《研究物质的实验方法》中，又从化学家要研究一种物质，首先考虑的是怎样从混合物中把这种物质分离出来，怎样提纯这种物质，再进行分析、检测，研究它的结构和组成这样一个科学探究过程入手，因此把本节课作为本单元的第一课时，以化学家研究物质的一般思路来进入物质研究的学习，能引导学生了解物质研究的一般步骤，首先是从物质的分离和提纯开始的，为学生建立起一种科学探究的思维方式，也为之后对物质的检验、溶液的配制等其它实验方法和操作的学习打下基础。化学实验也是高中化学学习的重要内容，学生较系统地学习实验方法旨在强调化学实验的重要性，让学生形成这种意识，这也是新课程教材与传统教材最重要的不同点。 教学重点：过滤、蒸发、结晶、萃取、分液、蒸馏等常用物质分离和提纯的方法 教学难点：萃取、蒸馏操作的掌握及应用
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
实验设计的三要素与四原则
实验设计的三要素与四原则 众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢? 完善的设计方案需具备六个条件 一般来说，应具备以下条件：人力、物力和时间满足设计要求;实验设计的“三要素”和“四原则”均符合专业和统计学要求;重要的实验因素和观测指标没有遗漏，并做了合理安排;重要的非实验因素(包括可能产生的各种偏性)都得到了很有效的预防和控制;研究过程中可能出现的各种情况都已考虑在内，并有相应的对策和严格的质量控抗对操作方法、实验数据的收集、整理、分析等均有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和四原则”，无疑是其设计方案科学严谨的象征。 实验设计的“三要素” 实验设计三要素应着重考虑： 一、受试对象的种类问题。这里面包含以下几种情形：l、一般医学科研——常用动物、离体标本或人体内取得的某些样本作为受试对象;2、新药的临床前试验——一般用动物作为受试对象;3.新药的临床试验阶段——一般用人作为受试对象。新药临床试验一般分为4期，在1期临床试验阶段，通常用健康志愿者作为受试对象;而在其他各期临床试验阶段，常用患特定疾病的患者作为受试对象。选择什么样的患者，应有严格的规定。 二、实验因素。实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。若在整个实验过程中影响观察结果的因素很多，就必须结合专业知识，对众多的因素做全面分析，必要时做一些预实验，区分哪些是重要的实验因素，哪些是重要的非重要的实验因素，以便选用合适的实验设计方法妥善安排这些因素。水平选取的过于密集，实验次数就会增多，许多相邻的水平对结果的影响十分接近，不仅不利于研究目的的实现，而且将会浪费人力、物力和时间;反之，该因素的不同水平对结果的影响规律不能真实地反映出来，易于得出错误的结论。在缺乏经验的前提下，应进行必要的预实验或借助他人的经验，选取较为合适的若干个水平。所谓质量因素，就是因素水平的取值是定性的，如药物的种类、处理方法的种类等。应结合实际情况和具体条件，选取质最因素的水平，千万不能不顾客观条件而盲目选取。 三、实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高的客观指标。对一些半客观(如读取病理切片或X片上所获得的结果)或主观指标(如给某些定性实验结果人为打分或赋值)，一定要事先规定读取数值的严格标准，必要时还应进行统一的技术培训。 实验设计的“四原则” 实验设计四原则的实施主要包括：
卵磷脂的提取
生命科学与技术系 生化技术综合实验报告 设计（论文）题目鸡蛋中卵磷脂的提取与鉴定 姓名 学号 所属系 专业年级 电子邮箱 指导教师 电子邮箱 年月 摘要 卵磷脂是甘油、胆碱、磷酸、饱和及不饱和脂肪酸组成的一种磷脂类物质，
它是构成细胞膜、核膜、质体膜等生物膜的本成份、研究发现卵磷脂具延缓衰老、促进神经传导、提高大脑活动、增强记忆力，促进脂肪代谢、防止出现脂肪肝、降低血清胆固醇等方面的作用。被英国科学家喻为“健脑的黄金、养心的极品”。在西方国家卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。卵磷脂在动植物体内分布广泛．其中以蛋黄中含量最为丰富。 卵磷脂按照其纯度的高低，一般分为PC50、PC 60 、PC 70、PC80、PC 90、PC95等产品形式。最高可以提纯到98%，因为其纯度越高，氧化性能越强，故提纯到98%的卵磷脂需要做氢化处理。然后保存。未经过氢化处理的卵磷脂，一般要求在充氮的密封容器中。 纯净的卵磷脂常温下为一种无色无味的白色固体，由于制取或精制方法、储存条件不同而呈现淡黄色至棕色。 利用95％乙醇在蛋黄溶液里进行浸提取，再加入乙醚过滤，加入一定量的丙酮在旋转干燥仪器中把乙醇蒸发出来，取溶胶性的物质，加入丙酮冲洗除杂，冲洗多次取得粗品，让后再加入无水乙醇溶解，加入金属沉淀剂进行精提取，取出少量精品，在碱性条件下溶解，分别用钼酸铵，斐林试剂，滤纸，氢氧化钠，对卵磷脂进行定性检测 关键词：蛋黄卵磷脂；提取；纯化；鉴定。
卵磷脂的提取与鉴定 卵磷脂(lecithin) 是一种含磷的类脂类生理活性物质, 同时又是一种天然表面活性剂 [1～2], 化学名称为磷脂酰胆碱，它是构成细胞膜、核膜、质体膜等生物膜的基本成份，空间结构的卵磷脂分子是由一个极性的“头部”(甘油和胆碱磷酸脂部分) 和两条非极性的“尾巴”(两个依附于甘油主框架上的脂肪酸) 组成, 它是典型的两性电解质 [3]主要集中在大脑、神经系统、免疫系统及心、肝、肾、生殖腺等重要器官内) ,是人体必需的胆碱和必需脂肪酸的重要来源 [4] 纯净的卵磷脂常温下为一种无色无味的白色固体，由于制取或精制方法、储存条件不同而呈现淡黄色至棕色。 目前, 我国已经有10余家企业生产大豆卵磷脂, 而且均是小规模的生 产装置, 还未形成工业化生产规模, 技术水平也落后于世界先进水平[5], 生产蛋黄卵磷脂的厂家则更少。国内的卵磷脂产量远远不能满足市场需要, 因此大部分卵磷脂特别是高纯度卵磷脂仍然依靠进口。动物性原料中蛋黄 含卵磷脂最多, 达干物质总重的8%～10%。 一．实验目的意义： 1.1掌握卵磷脂的提取方法及其鉴定方法，对卵磷脂进行定性 检测，了解卵磷脂的性质， 1.2掌握离心干燥技术，熟练应用提纯技术 1.3 掌握抽滤等的基本操作 二．实验原理 1.1卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶剂，可利用此溶剂提取。由于卵磷脂不溶于丙酮，可以用丙酮多次冲洗除去一部分杂质，金属离子复合沉淀法进行精提纯，新提取的卵磷脂为白色蜡状物，新提取的卵磷脂为白色，当与空气接触后，其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。
设计性实验：三组分混合物(环己醇,苯酚,苯甲酸)的分离
1.实验目的 （1）学会分离三组分混合物（环己醇，苯酚，苯甲酸）的方法; (2).学会根据自己设计的实验方案组装实验装置，并独立完成实验操作。 2.实验原理 混合液（25ml）与NaHCO3（约1.6g）反应后，苯酚和环己醇不与其反应处于分液漏斗中上层的有机相中，下层水相中为苯甲酸钠溶液，分液后，将苯甲酸钠溶液用6mol/L的浓盐酸酸化可还原成苯甲酸沉淀，然后进行抽滤即可得到苯甲酸。再将分离过的有机相加到干燥的分液漏斗中，先配制一定量的NaOH溶液（最好质量为4.0g，便于计算），因为环己醇不与其反应，则可在分液漏斗中的上层有机相直接分出环己醇，用蒸馏的方法干燥环己醇，在下层的水相中得到苯酚钠，同理，可用浓盐酸酸化得到苯酚，然后进行抽滤。 相关的化学方程式：由上述可知。 3.实验仪器及试剂 玻璃管，分液漏斗，玻璃棒，抽滤装置，烧杯 NaOH,NaHCO3,浓盐酸（6mol/L），环己醇·苯酚·苯甲酸的混合物。 装置：分液装置，抽滤装置，蒸馏装置 4.实验步骤 1）.先量取混合液于干烧杯中，将配制好的NaHCO3溶液加到混合液中，搅拌至无气泡产生则停止加入； 2）.将混合液倒入分液漏斗中，静置分层； 3）.去下层溶液于烧杯中，加入浓盐酸，静止后进行抽滤，则得到苯甲酸； 4）.将步骤3分液漏斗中上层液体倒入分液漏斗中，加入刚配制好的NaOH溶液，震荡后静置分层； 5）.再取下层溶液与烧杯中，加入浓盐酸，待反应充分后进行抽滤，得到苯酚； 6）.取上层有机相进行蒸馏干燥操作，得到环己醇； 7）.称量并计算相关物理量； 8）.整理装置，回收试剂； 9）.检测：苯酚，（1）Fe的溴水溶液，显色；（2）液溴，三溴苯酚沉淀 苯甲酸，与NaHCO3反应，用澄清石灰水检测变浑浊 环己醇，与卢卡斯试剂反应 也可以应用物理方法来检测，比如，用物理仪器测出物质的熔沸点，在与标准物质的熔沸点对照，即可检测三种物质。5.产物外观与产率计算 略 6.结果与讨论
简单生物实验设计方案
简单生物实验设计方案 简单生物实验设计方案范文 1 土壤中分离产生-淀粉酶的菌种 一.实验目的 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握微生物的鉴定方法。 3、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定 二.实验原理 -淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多;蔬菜牛奶
中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养(又称丰富培养) 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 三.实验材料 1、器材： 小铁铲和无菌纸或袋(可省)、培养皿8个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支(每支4.5mL水)、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪(枪头10个)、天平、滤纸、pH试纸等。 2、试剂： 配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料(牛肉膏0.9g、
医学科研实验设计的三大要素
医学科研实验设计的三大要素 医学科研实验设计的三大要素 医学科研实验设计的三大要素 2006-11-26 基础医学论文 熊国强(湖南医科大学卫生统计学教研室长沙 410078)贺石林(湖南医科大学生理学教研室长沙 410078) 科研的基本要素包括处理因素、受试对象和实验效应。如用某种传统西药或中成药治疗缺铁性贫血病人，观察比较两组病人血红蛋白的上升趋势，该研究中所用的两种药物称为处理因素，缺铁性贫血病人称为受试对象，血红蛋白称为实验效应。如何正确选择三大要素是科研中专业设计的关键问题。 处理因素(受试因素) 通常指由外界施加于受试对象的因素，包括生物的、化学的、物理的或内外环境的。但是生物本身的某些特征(如性别、年龄、民族、遗传特性、心理因素等)也可作为处理因素来进行观察。因此，研究者应正确、恰当地确定处理因素。一般应注意以下几点：①抓住实验研究中的主要因素。研究中的主要因素是按以往研究基础上(本人或他人)提出的某些假设和要求来决定的。一次实验涉及的处理因素不宜太多，否则会使分组增多，受试对象的例数增多，在实施中难以控制误差。然而，处理因素过少，又难以提高实验的广度和深度。因此，需根据研究目的’的需要与实施的可能来确定带有关键性的因素。②找出非处理因素。除了确定的处理因素以外，凡是影响实验结果的其他因素都称为非处理因素，所产生的混杂效应也影响了处理因素产生的效应对比和分析，这些非处理因素又称混杂因素。例如上述两种不同药物治疗缺铁性贫血病人的试验，非处理因素可能有年龄、性别、营养状况等。如果两组病人的年龄、性别、
营养等构成不一，则可能影响药物疗效的比较。因此设计时便设法控制这些非处理因素，只有这样才能消除它们的干扰作用，减小实验误差。③处理因素必须标准化。处理因素的强度、频率、持续时间与施加方法等，都要通过查阅文献和预备试验找出各自的最适条件，然后订出有关规定和制度，并使之相对固定，否则会影响试验结果的评价。如处理因素是药物，必须正确选择批号，给药途径和时间也应标准化和相对固定化。 受试对象(研究对象) 受试对象的选择十分重要，对实验结果有着极为重要的影响。大多数医学科研的受试对象是动物和人，也可以是器官、细胞或分子。但中药种植中培育品系的研究则将药用植物列为受试对象。 在医学科研中，作为受试对象的前提是所选对象必须同时满足两个基本条件：①必须对处理因素敏感；②反应必须稳定。因此，在观察新药的临床疗效试验中，应当选择中等程度中青年患者，只有这样才能显示疗效率高低的差别。受试对象的疾病应诊断明确(依照国内或国际统一的诊断标准)，且表现具有典型性。研究者必须深知病人的心理状况、情绪起落、病情程度、病程长短、生活习惯、个人嗜好、家庭经济收入、食品种类等都不同程度地影响疗效，这些影响因素必须很好地加以控制，使组间均衡化。根据研究目的不同，对实验动物的选择要求也不同。动物的选择应有针对性地注意种类、品系、年龄(月龄)、性别、体重、窝别和营养状况等。为保证实验效应的精确性，某些动物的生活环境还有严格要求。 试验效应试验效应内容包括试验指标的选择和观察方法两个部分。指标的选择有以下要求：①指标的关联性，选用的指标必须与所研究的题目具有本质性联系，且能确切反映被试因素的效应。所选指标是否具有关联性，充分反映了研究者的专业知识与技术水平。②指标的客观性，指标数据来源决定它的主、客观性质。主观性指标来自观察者或受试对象，易受心理状态与暗示作用的影响，在科研中一般尽量少用。客观性指标是指通过精密设备或仪器测定的数据，能真实显示试验效应的大小或性质；排除了人为因素的干扰。③指标的灵敏度，通常是由该指标所能正确反映的最小数量级或水平来确定。如溶液中物质含量的测定，除测出
海藻糖的提取与分离实验设计重点讲义资料
目录 海藻糖的提取与分离实验设计------------------------------------------ 2 前言----------------------------------------------------------- 2 关键词--------------------------------------------------------- 2 1、海藻糖的理化性质--------------------------------------------- 2 1.1密度----------------------------------------------------- 2 1.2熔点----------------------------------------------------- 2 1.3溶解热--------------------------------------------------- 2 1.4甜度----------------------------------------------------- 2 1.5溶解性、晶体析出性--------------------------------------- 2 1.6高玻璃化转变温度----------------------------------------- 3 1.7低吸湿性和保水性----------------------------------------- 3 1.8耐热、耐酸性--------------------------------------------- 3 1.9着色性--------------------------------------------------- 3 2、海藻糖的功效作用--------------------------------------------- 3 2.1保护功能------------------------------------------------- 3 2.2抑制淀粉老化--------------------------------------------- 4 2.3防止蛋白质变性------------------------------------------- 4 2.4抑制鱼腥味的产生----------------------------------------- 4 2.5抑制脂质氧化变质----------------------------------------- 5 2.6矫味作用------------------------------------------------- 5 3、海藻糖提取分离的原理和影响因素的预判------------------------- 5 3.1提取分离原理--------------------------------------------- 5 3.2海藻糖标准曲线的绘制原理--------------------------------- 6 3.3粉末活性炭脱色脱蛋白效果的表征--------------------------- 7 3.4离子交换树脂脱盐脱色效果的表征--------------------------- 7 3.5相关影响因素--------------------------------------------- 7 4、海藻糖提取分离的实验设计------------------------------------ 8 4.1实验原料与器材------------------------------------------- 8 4.2海藻糖提取与分离工艺流程--------------------------------- 9 4.2.1实验流程----------------------------------------------- 9 4.2.2相关因素对海藻糖提取效率的影响------------------------- 9 4.2.3相关因素对粉末活性炭脱色脱蛋白效率的影响-------------- 11 4.2.4相关因素对离子交换柱脱盐脱色效率的影响---------------- 15 5、总结------------------------------------------------------------ 17 参考文献----------------------------------------------------------- 18
初中生物学实验设计方案
一、实验名称:临时装片、切片、涂片的制作、观察与指导 二、实验目标:让学生通过独立自主的制作临时装片、切片、涂片的方法来感知细胞的形态与结构,从而使学生对细胞达到一定的认识,为以后的教学作下铺垫。制作临时装片的成功,对提高学生的生物学兴趣与生物科学素养都起着重要的作用。同时,这样锻炼了学生的动手能力,也培养了学生的自己动脑思考的能力。 三、实验方法及步骤: (一)实验材料:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、解剖针、毛笔、滴管、擦镜纸;清水、碘酒溶液;西红柿、空心莲子草、洋葱;创可贴(切片时可能会有人受伤) (二)实验步骤: 1、临时装片的制作 ⑴准备 擦用擦镜纸把载玻片与盖玻片擦拭干净 改进:将洁净的纱布改为擦镜纸,擦拭玻片时要注意用左手的拇指与食指 夹住玻片的两端,右手的拇指与食指衬垫上洁净的纱布后,夹在玻片两面,同时擦拭,以防将玻片损坏, 滴用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水 改进:在制片时至少滴2滴清水,这样加盖玻片时,盖玻片下的空间中水 较充盈,气泡就少,细胞的活性也较好 取用刀片在洋葱表面上划“井”字(大约0、5cm2),用镊子撕取外表皮 问题:由于叶表皮皱缩、学生不熟练等,导致撕下的表皮薄膜过厚,在显微 镜视野中难以找到理想的观察对象,致使实验效果较差。 改进:首先将洋葱鳞片叶切成宽1、0-1、5 cm 的纵向窄条,再用刀片将 洋葱鳞片叶内侧表皮划成小块(切忌划透),然后用镊子夹住所划表皮的 边缘,将其轻轻取下(洋葱鳞片叶内侧表皮易与叶肉分离,操作简便)即 可。这一改进降低了实验操作难度,提高了制片质量。 放把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中,并展平 ⑵盖盖玻片 盖用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的水滴,然后缓缓地 放下,盖在要观察的材料上 ⑶染色 染:将玻片倾斜10度左右,从高的一侧滴入碘液,让其自己流入玻片。 问题: 染色时书中要求就是把1-2滴碘液滴在盖玻片的一侧,然后用吸 水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。然而,部分同学可 能将盖玻片下所有水全部吸干,做出的装片会有很多的大气泡,且气泡将 细胞掩盖了,或者有人将气泡误认为细胞。 改进:染色时不用吸水纸吸水,而就是将玻片倾斜10度左右,这个角度一