药物遗传毒性研究技术指导原则2018
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药物遗传毒性研究技术指导原则
一、概述
遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。
二、基本原则
（一）实验管理
药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。
（二）具体问题具体分析
遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验
方案，并试验结果进行全面的分析与评价。
（三）随机、对照、重复
遗传毒性试验应符合毒理学试验随机、对照、重复的基本原则。
三、基本内容
（一）受试物
中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。
化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。
受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。
应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。
在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。
（二）标准试验组合
对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价。
遗传毒性试验方法有多种，根据试验检测的遗传终点，可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤；根据试验系统，可分为体内试验和体外试验。由于没有任何单一试验方法能检测出所有的与肿瘤发生相关的遗传毒性机制，因此，通常采用体外和体内试验组合的方法，以全面评估受试物的遗传毒性风险。这些试验相互补充，对结果进行判断时应综合考虑。
1.标准试验组合应具备的特征
标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，应包含以下内容：
（1）应包含细菌回复突变试验（又称Ames试验）。该试验已证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的遗传毒性致癌剂。
（2）应包含哺乳动物细胞体外和/或体内试验。
哺乳动物细胞体外试验中，体外中期相染色体畸变试验、体外微核试验、体外小鼠淋巴瘤L5178Y 细胞Tk基因突变试验（简称小鼠淋巴瘤细胞试验，MLA）已经过充分验证并广泛应用，且同样适合于检测染色体损伤。若实验室对这些方法已进行了充分的验证，当用于标准试验组合中时，这几个试验
可互相替换。
体内试验具有考虑到如吸收、分布、代谢、排泄等因素的优势，并且可检出体外试验无法检出的某些遗传毒性物质（注释1），因此标准试验组合应至少包含一项体内试验。可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤试验（包括骨髓或外周血红细胞微核试验、骨髓中期相细胞染色体畸变试验）或其他合适的体内试验。
2.推荐的两种标准试验组合
组合一：
（1）一项细菌回复突变试验；
（2）一项检测染色体损伤的体外细胞遗传学试验（体外中期相染色体畸变试验或体外微核试验），或一项体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验；
（3）一项体内遗传毒性试验，通常为啮齿类动物造血细胞染色体损伤试验，用于检测微核或中期相细胞染色体畸变。
组合二：
（1）一项细菌回复突变试验；
（2）采用两种不同组织进行的体内遗传毒性试验，通常为一项啮齿类动物造血细胞微核试验和第二项体内试验。
以上两种试验组合同等适合（注释2），可根据受试物特点自主选择。
体内试验可采用单次给药或重复给药的试验设计。如果试验设计科学合理，采用重复给药时可将遗传毒性终点指标整合入一般毒性试验中；当在体内评价一项以上的遗传毒性终点指标时，也可将它们整合在一项试验中。但是，整合的前提条件是试验设计（例如剂量、采样）对于重复给药试验是合适的，并且需要获得充分的支持信息。
完成上述任何一种标准试验组合，若试验结果为阴性，通常可提示受试物不具有遗传毒性。对于标准试验组合结果为阳性的受试物，根据其治疗用途，可能需要进一步的试验。
标准试验组合不包含为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，检测中期相细胞染色体畸变的体外和体内试验可检测多种类型的染色体完整性方面的改变，微核试验具有检测某些非整倍体诱导剂的能力，小鼠淋巴瘤细胞试验也可检测染色体丢失（可能导致非整倍体）。
建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，用于对标准试验组合得到的遗传毒性试验结果的进一步研究。在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对于受试物不适合或因技术原因无法实施时，可采用其他经过验证的试验作
为替代试验，但应提供充分的科学合理性及依据。
附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，试验时应根据具体情况具体分析，合理设计。
3.标准试验组合的调整
标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。
（1）当受试物对细菌有高毒性时（如某些抗生素），仍应进行细菌回复突变试验，因为致突变性可能出现在较低的、毒性较小的浓度。同时，还应进行一项体外哺乳动物细胞试验，即采用标准试验组合一。
（2）标准试验组合通常可检出具有遗传毒性作用警示结构的受试物（注释3），因为大部分“警示结构”被定义为与细菌诱变性有关。但是，对于具有某些特殊警示结构的化合物，需要对标准组合方案进行调整（注释4）。附加试验的选择或方案的调整取决于这些具有警示结构受试物的化学性质、已知活性和代谢信息。
（3）某些特殊的受试物，如一些放射影像剂、抗酸铝合剂、一些吸入用药、一些皮肤或其他局部用药，毒代或药代动力学研究提示其不被全身吸收，因此在体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释5）。对于这些受试物，体内试验（尤其是骨髓、血液、肝脏）难以提供有用的信息。在改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露，且对暴露量最高的组织无合适的遗传毒性试验的情况下，仅根据体外试验进行评价可能是合适的。某些情况下，采用接触部位评价遗传毒性作用可能也是合理的，尽管这些试验尚未广泛应用（注释6）。
4.生殖细胞诱变剂的检测
遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。标准试验组合中不包含专门检测生殖细胞诱变剂的试验。但是，比较研究结果显示，从定性的角度，大多数生殖细胞诱变剂能在体细胞试验中检出，因此体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对生殖细胞无影响。体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。
（三）体外、体内试验基本要求
遗传毒性的体内外试验方法较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，试验时需具体情况具体分析。
无论体外、体内试验，方法学均应经过充分验证。各实验室应建立历史背景对照数据库（包括阴性和阳性对照数据库）。
1.体外试验基本要求
1.1 细菌回复突变试验中采用的菌株
细菌回复突变试验至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/ TA97a），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换与检测交联剂的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA （pKM101）。
1.2 体外试验中最高浓度的确定（注释7）
体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。
1.2.1最高浓度
对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物，细菌回复突变试验应达到的最高浓度为5mg/皿（液体受试物为5μl/皿），哺乳动物细胞试验为1mM 或0.5mg/ml（选用较低者）。
1.2.2要求达到的细胞毒性水平
在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又会影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。当哺乳动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性（如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果）会导致遗传毒性假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。
鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平（浓度不应超过1.2.1中的规定）：
（1）细菌回复突变试验中，进行评价的浓度应能显示明显的毒性，如回复突变菌落数目减少、背景菌苔减少或消失。
（2）哺乳动物细胞体外遗传学试验中，最高浓度产生的细胞毒性应约为50%。
（3）对于小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验，最高浓度产生的细胞毒性应为80%～90%。
1.2.3难溶受试物的检测
用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。建议采用以下策略检测相对不溶的受试物：
（1）对于细菌回复突变试验，如果沉淀不干扰计数，应对产生沉淀的浓度进行计数，且最高浓度不超过5mg/皿或5μl/皿。当未观察到细菌毒性时，应以产生沉淀的最低浓度作为计数的最高浓度；当观察到剂量相关的细菌毒性或诱变性时，应按上述细胞毒性的要求来确定最高浓度。
（2）对于哺乳动物细胞试验，若沉淀不干扰计数，最高浓度应是培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度。应通过肉眼观察或镜检等方法来观察记录沉淀在培养过程中持续存在或培养过程中出现
（至处理结束时）。
1.3 体外试验的重现性
体外试验应关注重现性。当采用新方法或试验出现非预期结果时，有必要进行重复试验。但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有效的内部质量控制，得到明确的阳性或阴性结果，通常不需要重复试验。但是，若得到可疑结果，则需要进一步试验。
2.体内试验基本要求
2.1 检测染色体损伤的体内试验
采用骨髓细胞分析染色体畸变或检测含微核的嗜多染红细胞的体内试验方法均可用于检测染色体断裂剂。由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因此微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂（注释8）。
大鼠和小鼠均适用于骨髓微核试验。微核也可通过小鼠外周血中未成熟红细胞（如嗜多染红细胞）或大鼠血液新生网织红细胞测定（注释9）。同样，也可使用已证明了对检测断裂剂/非整倍体诱导剂具有足够灵敏度、来源于其他种属动物的骨髓或外周血的未成熟红细胞。除人工镜检方法外，若方法学经过了充分验证，也可采用自动化分析系统（如图像分析系统和流式细胞术）对微核进行检测。
啮齿类动物给药后，取外周血淋巴细胞进行体外培养，也可用于分析染色体畸变（注释10）。
2.2 其他体内遗传毒性试验
第二项体内试验可作为第二种标准试验组合的一部分，并可用作追加试验以在评价体外或体内试验结果时提高证据权重（注释11）。体内组织和试验的选择应根据多种因素来确定，例如受试物可能的作用机制、体内代谢特征或者被认为是相关的暴露组织等信息。由于肝脏的暴露和代谢能力，肝脏是代表性的首选组织。第二种体内试验经常以评价DNA损伤为终点指标作为替代终点。目前，已有大量应用经验的试验包括：DNA链断裂试验如单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）和碱洗脱试验、转基因小鼠体内突变试验、DNA共价结合试验。
2.3 体内试验的给药途径
一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。若不一致，应说明理由。但是，为获得全身暴露，在适当时可进行调整，如局部给药的受试物。
2.4 体内试验啮齿类动物性别的选用
短期给药（通常是给药1～3次）的体内遗传毒性试验一般可单用雄性动物。若已有的毒性、代谢或暴露资料提示在所用动物种属上存在毒理学意义的性别差异，则应采用两种性别的动物。
当遗传毒性试验整合在重复给药毒性试验中时，应对两种性别动物进行采样，如果毒性、代谢方面没有明显性别差异，可仅对单一性别进行评价。
如果受试物拟专用于单一性别，可选用相应性别的动物进行试验。
2.5 体内试验的剂量选择（注释7）
通常应对有代表性的三个剂量水平进行分析检测。
对于短期试验（通常是给药1～3次），推荐的最高剂量是：限度剂量2000mg/kg（若可耐受），或最大耐受量（为产生毒性的剂量，而基于同样的给药方案，比该剂量稍高即预期会出现死亡）。剂量选择时还应考虑骨髓红细胞生成的抑制。最高剂量之下的其他剂量一般剂量间距为约2～3倍。
对于多次给药试验，分为两种情况：
（1）当采用标准试验组合一时，若该试验整合在重复给药毒性试验中，如果该重复给药毒性试验符合支持人体临床试验的一个充分试验的标准，则通常认为对于遗传毒性评价剂量是合适的，该原则适用于体外哺乳动物细胞试验结果为阴性或不相关的阳性时。
（2）当进行追加试验或当采用标准组合二时，应对多种因素进行评价以确定高剂量是否适合用于遗传毒性评价。毒性试验（尤其是大鼠试验）的高剂量需满足以下任何一条标准，才可用于遗传毒性评价：
①最大给药量，基于受试物在溶剂中的理化性质。
②对于给药14天或更长时间的试验，如果能耐受，限度剂量为1000 mg/kg。
③最大可能暴露量，通过达到暴露峰值/稳态或受试物的蓄积来证明。若受试物的暴露量随给药时间增加而明显减少（如比起始暴露量减少≥50%），则不宜采用多次给药试验。
④高剂量≥急性给药试验所采用高剂量的50%，即接近最小致死量。
仅基于无毒性的暴露范围（高于临床暴露量的若干倍）来选择高剂量，不是充分合理的。
对于具有血液或骨髓毒性的受试物，进行遗传毒性评价的剂量应在具有严重红细胞系毒性（如具有明显的嗜多染红细胞或网织红细胞抑制）的高剂量之下、间距不超过约2倍。
（四）试验的阶段性
细菌回复突变试验可支持单次给药的临床试验；为支持多次给药的临床试验，应采用哺乳动物细胞进行一项评估染色体损伤试验；在Ⅱ期临床试验开始前完成完整的遗传毒性标准试验组合。
但是，为了减少药物开发风险、保护受试者安全，建议在临床试验开始前完成遗传毒性标准试验组合。
四、试验结果评价与追加研究策略
遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个重要组成部分，其最终目的在于预测受试物潜在的致癌性或其他遗传危害性。试验结果的分析与评价是试验的必要组成部分，应对研究结果进行科学和全面的分析与评价。在对遗传毒性试验结果进行评价时，应结合受试物的药学特点、药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果等信息进行综合分析。试验结果的评价最终应落实到临床试验受试者范围限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。
遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制的致癌物质（如绝大多数已知的人类致癌剂），不适用于检测非遗传毒性致癌剂。每种试验系统均可能产生假阴性或假阳性结果。一些试验条件，如有限的体外代谢活化能力，可能导致体外试验出现假阴性结果。试验组合方法的设计是为了减少具有潜在遗传毒性的受试物产生假阴性结果的风险。另一方面，任何一项遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人类真正具有遗传毒性或致癌性的危险。在对体内外试验结果进行评价时，对阳性或阴性的结果均应予以充分考虑，尤其是在有疑问时。
评价受试物的潜在遗传毒性时，应全面考虑各项试验结果、体内和体外试验方法的内在价值及其局限性，进行综合分析与评价。
（一）体外试验结果的评价
1.体外试验阳性结果
1.1 体外细菌回复突变试验阳性结果的评价
由于细菌回复突变试验的阳性结果提示DNA反应性，为评估对患者用药的潜在风险，需进行充分的追加试验以评价体内致突变和潜在致癌性，除非通过恰当的风险获益分析证明是合理的。
细菌回复突变试验出现阳性结果，应考虑受试物的纯度，以确定阳性结果是否污染物所致。氨基酸（组氨酸或色氨酸）污染可能导致菌落数的升高而出现假阳性结果，因此细菌回复突变试验不适合检测可能会降解的肽类。一些特殊情况下，细菌回复突变试验阳性结果并不提示对人体有遗传毒性潜力，例如当发生细菌特异性代谢时（如通过细菌硝基还原酶活化）。
1.2 体外哺乳动物细胞试验阳性结果的评价
对于体外哺乳动物细胞试验阳性结果，应采用下述的证据权重法进行分析，必要时进行追加试验。例如（包括但不限于）：①阳性结果是否归因于体内不存在的条件（如pH值、渗透压、沉淀物）；②阳性结果仅发生于产生最高细胞毒性的浓度：在小鼠淋巴瘤细胞试验中阳性结果发生于相对总细胞生长率（Relative total growth，RTG）减少≥80%时；在体外细胞遗传学试验中阳性结果发生于细胞生长抑制≥50%时。
对于以上情况，如果应用证据权重法分析提示缺乏潜在遗传毒性，可采用标准试验组合一，即一
个体内试验即可。
2.体外试验阴性结果
对于体外试验阴性结果，在一些特殊情况下需考虑进行进一步的试验，例如（包括但不限于）：受试物的化学结构或已知代谢特征提示标准的体外代谢活化技术（如啮齿类动物肝脏S9）可能不适用；受试物的化学结构或已知活性提示采用其他试验方法或系统更合适。
（二）体内试验结果的评价
与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的代谢系统更具有相关性。因此，体内试验在遗传毒性试验中具有更重要的意义。
如果体外与体内试验的结果不一致，对其结果差异应采用具体问题具体分析的原则进行分析与评价，如代谢差异、受试物在体内快速和高效排泄等。
1.体内试验阴性结果
体内试验结果的意义与受试物在靶组织（注释5）中是否有足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验为确定的阳性结果而体内试验结果为阴性时，或者是当未进行体外哺乳动物细胞试验时更为重要。受试物在靶组织中具有足够暴露的证据包括可疑组织的毒性，或下述的毒代动力学资料。如果受试物在靶组织中无法达到足够的暴露量，则常规的体内遗传毒性试验的意义较小。
对于体外遗传毒性试验结果为阳性（或未进行）而体内试验结果为阴性的受试物，应采用以下任何一种方法来反映受试物在体内/靶组织的暴露水平：
（1）细胞毒性
对于细胞遗传学试验，可通过微核试验中各剂量组和各采样时间点所用组织（骨髓或外周血）中未成熟红细胞数与红细胞总数的比例的显著变化，或通过染色体畸变试验中有丝分裂指数的显著降低，来间接反映受试物的暴露水平。
对其他体内遗传毒性试验，可通过肝脏或组织的毒性（如通过组织病理学检查或血液生化学指标）来间接反映受试物的暴露水平。
（2）暴露
通过测定血液或血浆中的受试物相关物质水平来反映受试物的体内暴露（注释12）；直接测定靶组织中的受试物相关物质；或通过放射自显影检测组织暴露水平。
体内暴露的评估应采用与遗传毒性试验相同的动物种属、品系和给药途径，在最高剂量或其他相关剂量中进行。
如果全身暴露与预期的临床暴露相似或更低，提示可能需要采用替代的方法，如采用不同的给药途径、采用具有更高暴露的不同种属、采用不同的组织或试验。
若体外试验未显示受试物有潜在遗传毒性，可采用上述任何一种方法，也可用啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄试验结果来确定体内暴露水平。
2.体内试验阳性结果
体内遗传毒性试验也可能出现假阳性结果，例如：未给予任何遗传毒性物质，但由于干扰了红细胞生成而导致微核升高；DNA加合物数据应根据内源性加合物的已知背景水平进行解释分析；与毒性相关的间接作用可能影响DNA链断裂试验（如彗星试验和碱洗脱试验）的结果。因此评价遗传毒性数据时应考虑所有的毒理学和血液学发现（注释13）。与毒理学改变相关的间接作用可能有一个安全范围，且可能不具有临床相关性。
（三）阳性结果追加研究策略
1.对体外哺乳动物细胞试验阳性结果的追加
以下讨论基于细菌回复突变试验结果为阴性。
1.1 追加机制/体内试验
体外哺乳动物细胞试验为阳性结果且无充分证据以排除生物学相关性时，建议进行追加试验以提供试验证据。可进行附加的体外试验或进行两种合适的体内试验，具体如下：
（1）进行附加的体外试验。
体外试验可为阳性结果缺乏生物学相关性提供机制信息，如小鼠淋巴瘤细胞试验中诱导染色体畸变或突变的受试物不是DNA损伤性物质的证据（如：除细菌回复突变试验外的其他突变/DNA损伤试验结果为阴性；化学结构上的考虑），或者体内可能不相关或可能具有阈值的间接机制的证据（如抑制DNA合成、仅在高浓度时产生活性氧簇等）。体外微核试验阳性结果的追加试验也可采用类似的试验，或者证据还可包含提示染色体丢失/非整倍体的已知机制、着丝点染色试验（注释14）提示染色体丢失。多倍体是体外染色体畸变试验中的一种常见现象。虽然非整倍体剂可诱导多倍体产生，但仅多倍体产生并不能提示受试物具有诱导非整倍体的潜力，而可能仅提示细胞周期紊乱；多倍体也常常与细胞毒性的升高有关。如果在体外试验中仅见多倍体，而未见结构上的染色体断裂，一个确保具有合适暴露的体内微核试验的阴性结果，通常可提供不具有潜在非整倍体诱导作用的充分证据。
如果上述机制信息和证据权重分析支持受试物不具有相关的遗传毒性，仅需要一个具有合适暴露证据的体内试验，以确定受试物不具有遗传毒性作用。通常采用体内细胞遗传学试验，而且，当对潜在染色体丢失进行追加研究时要求进行体内微核试验。
（2）进行两项合适的体内试验，通常采用不同的组织，并有支持暴露的证据。
如果无充分的证据或机制信息以排除相关的潜在遗传毒性，通常要求进行两项体内试验，需要采用合适的终点指标和合适的组织（通常是两种不同组织），且应在体内获得充分的暴露。
终点指标充分合理并且证明有暴露的合适的体内试验的阴性结果，足以证明受试物不具有遗传毒性风险。
1.2 依赖于S9的体外试验阳性结果的追加
当阳性结果仅见于S9代谢活化条件下，首先应确认是否是代谢活化的原因而非其他一些不同条件（如，与非代谢活化培养条件下的≥10%血清浓度相比，S9混合物中血清浓度低或无血清）。因此追加策略的目的是确定体外结果与体内条件的相关性，通常采用肝脏体内试验（注释15）。
2.对体内微核试验阳性结果的追加
若体内微核升高，应对所有的毒理学资料进行评价，以确定是否是由于非遗传毒性作用所致或非遗传毒性作用是其中的一个作用因素。如果怀疑存在干扰红细胞生成作用或生理学的非特异性因素（如体温偏低或过高），进行一项体内染色体畸变试验更为合适。如果怀疑一个升高的结果，应进行研究以证明该升高是否是由于染色体丢失或染色体断裂所致（注释14）。有证据显示非整倍体诱导作用，如纺锤体抑制剂，具有非线性剂量反应关系。因此，可能可确定该作用是否有阈值暴露（低于该暴露下预期不会有染色体丢失），以及确定与临床暴露比较是否存在合适的安全范围。
总之，受试物潜在遗传毒性的评价应考虑所有结果，并认识到体外与体内试验各自的内在价值及局限性。
（四）与致癌性试验的肿瘤发现有关的追加遗传毒性试验
在遗传毒性标准试验组合中呈阴性结果，但在致癌性试验中显示肿瘤发生率升高，而且无充分证据确定是非遗传毒性作用机制的受试物，应在合适的模型上进行附加的遗传毒性试验。为了帮助了解作用方式，附加试验可包括改变体外试验的代谢活化条件，或包括测定肿瘤诱导靶器官遗传学损伤的体内试验，如DNA链断裂试验（如彗星试验或碱洗脱试验）、DNA加合试验（如通过32P-后标记）、转基因突变诱导试验，或肿瘤相关基因遗传学改变的分子特征性分析。
（五）综合分析与评价
当遗传毒性试验结果为阳性时，对进入临床试验是否安全，应考虑所有的安全性资料，包括对所有遗传毒性资料的全面评价，以及拟进行的临床试验的性质。
对于遗传毒性试验出现阳性结果、但不直接与DNA发生作用的受试物，不全都会带来明显的体内给药的风险。因此，当遗传毒性试验出现阳性结果时，建议提供有关遗传毒性机制的证据以及这种机
制与预期体内暴露的相关性，或者通过试验排除为直接与DNA作用的机制，如证明受试物不使DNA 烷化或DNA链断裂，并提供未观察到遗传毒性的剂量水平。若确认受试物可直接损伤DNA，在极特殊情况下，可能会被允许用于危及生命的疾病（如晚期癌症），但不能在健康受试者中使用。
五、参考文献
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六、注释
注释1：尽管只有少数但仍有一定数量的遗传毒性致癌剂能被骨髓染色体损伤试验检出，而在标
准组合所列出的体外试验中却得到阴性、弱阳性或相互矛盾的结果。丙卡巴肼、对苯二酚、氨基甲酸乙酯、苯等致癌剂即为此类物质。
注释2：虽然两种标准试验组合同等适合，但是某些受试物的特异性信息提示应首选其中一种组合。例如，如果动物上的全身暴露与预期临床暴露相当或更低，应进行体外试验即组合一；当预期在肝脏产生短暂的活性代谢物时，推荐采用包含有一项肝脏体内试验的组合二。
注释3：某些具有遗传毒性警示结构的化合物被认为与致癌和/或致突变潜力有因果关系。警示结构包括烷化亲电子中心、不稳定过氧化物、芳香胺、偶氮结构、N-亚硝基基团、芳香硝基基团。
注释4：对有特殊警示结构的几类化合物，如含有偶氮基团的分子、糖苷类、活化需要还原硝基的化合物如硝基咪唑类、代谢活化需要不同的啮齿类动物S9的化合物如非那西汀，为最适合检测遗传毒性，采用特殊的方案调整或附加试验是非常重要的。
注释5：靶组织：此处特指体内试验的检测目标组织，如小鼠骨髓微核试验中的骨髓。
注释6：采用皮肤和结肠进行诱导微核的体内试验已有一些经验，而且在这些组织中进行DNA损伤试验也是一种合适的替代方法。
注释7：此处所指最高浓度的确定主要针对化学药物，因中药、天然药物所包含范围宽且情况复杂，在合适时可参考化学药物的最高浓度的确定原则进行设计，不合适时需根据具体情况进行合理的设计。
注释8：虽然微核的形成源于受试物与纺锤体相互作用导致整条染色体分裂的滞后，但微核试验无法检测所有非整倍体诱导剂。更特异的非整倍体诱导检测方法之一是采用快速、灵敏的技术分析个体（啮齿类动物）分裂间期核中的染色体，如荧光原位杂交（FISH）方法。
注释9：原则上，造血细胞的微核可采用任何动物种属的骨髓，以及循环系统中的含微核红细胞不会被脾脏清除的动物种属的外周血进行评价。在小鼠上，微核可通过血中的嗜多染红细胞进行测定，当小鼠持续给药约4周或更长时间时也可采用成熟红细胞进行测定。虽然大鼠可快速清除循环中的含微核红细胞，但是大鼠血液网织红细胞中可检测到由一系列断裂剂和非整倍体剂诱导的微核，因此大鼠外周血也可用于微核分析，但所采用方法学需确保能分析新生网织红细胞且方法学经过充分验证。
注释10：在某些情况下，动物单次或多次给予受试物后取外周血淋巴细胞进行培养，可检测中期相染色体畸变，就如同可采用骨髓中期相细胞一样。因为循环中的淋巴细胞是不可复制的，所以该试验系统无法检测需要通过细胞复制才能显示出遗传毒性作用的受试物（如某些核苷类似物）。由于一些淋巴细胞寿命相对较长，原则上它们具有体内蓄积未修复DNA损伤的潜力，这使得细胞在体外受到刺激进行分裂时畸变率升高。体内淋巴细胞试验可用于断裂剂指征的追加研究，但是，对于造血细
胞微核试验，采用其他组织（如肝脏）的试验通常可补充提供更多信息量，因为肝脏中药物和代谢物的暴露通常更高。
注释11：在标准试验组合中包含第二项体内试验，是为了通过一种对受试物和/或其代谢物具有良好暴露的组织来确证受试物不具有遗传毒性。另外，一小部分被认为有遗传毒性的致癌剂在肝脏试验中结果为阳性，但在体内骨髓细胞遗传学试验中结果却为阴性。这些案例很可能反映了缺乏合适的代谢活性或缺乏活性中间体传递至骨髓造血细胞。
注释12：骨髓是血液灌流性良好的组织，故血液或血浆中受试物相关物质的水平与骨髓中水平相似。无论何种给药途径，肝脏对于有全身暴露的受试物预期会有暴露。
注释13：微核升高可发生于未给予任何遗传毒性物质时，而是由于红细胞生成的干扰（如再生障碍性贫血、髓外造血作用）、应激、体温偏低或体温过高所致。脾脏功能的改变可影响含微核细胞从血液中的清除，可导致循环中的含微核红细胞数量轻微升高。
注释14：确定微核诱导是否主要由于染色体丢失或染色体断裂所致，试验应包括对体外或体内微核染色以确定着丝粒是否存在，例如，在着丝粒位置的DNA序列采用有探针的荧光原位杂交（FISH），或者采用抗着丝粒蛋白的标记抗体。如果大多数诱导的微核是着丝粒阳性，这提示有染色体丢失。但是，需要注意，强微管毒物如秋水仙碱和长春碱为一种特殊情况，它们虽然不会产生100%着丝粒阳性的微核，但典型的着丝粒阳性微核超过70%～80%，而在风险评估中却被公认为主要是非整倍体诱导剂。一种替代的方法是进行一项体外或体内中期相结构畸变试验，如果该试验结果是阴性，则提示微核诱导与染色体丢失有关。
注释15：标准诱导的S9混合物比人S9具有更高的活化能力，并且缺乏Ⅱ相解毒能力，除非添加特异性的辅助因子。此外，在体外测试底物浓度很高时可发生非特异的代谢活化作用。采用人S9或其他人类相关的代谢活化系统进行遗传毒性试验是有用的。分析遗传毒性试验中培养物的代谢产物特性，与非临床种属（非诱导的微粒体或肝细胞，或体内）或来自于人体样本的已知代谢产物特性进行比较，也可有助于确定试验结果的相关性。而且，追加试验通常采用肝脏的体内试验。在S9存在条件下体外试验得到阳性结果的受试物，在体内可能不诱导遗传毒性，因为不形成代谢产物或形成极微量，或被代谢性解毒或快速排泄，这种情况可提示缺乏体内风险。
注释16：小鼠淋巴瘤细胞试验为一种体外哺乳动物细胞Tk基因突变试验。除小鼠淋巴瘤L5178Y 细胞外，人淋巴母细胞TK6细胞也可用于检测Tk基因位点突变。目前，TK6试验已纳入OECD指导原则，但是，对于该试验，目前积累的试验经验较少，且未进行充分的方法学验证。在该试验经过充分的方法学验证后才可用于药物注册目的。
推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法
注：以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原则主要针对化学药物，中药、天然药物由于情况复杂，应综合考虑多方面因素，不能简单套用该原则，试验时应根据具体情况进行合理的设计。
（一）细菌回复突变试验（Bacterial reverse mutation test）
1.菌株
组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌，至少应包含下述五种菌株组合（除特殊说明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）：
（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大肠埃希杆菌WP2 uvrA或大肠埃希杆菌WP2 uvrA（pKM101）。
菌株特性鉴定需符合要求，－80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含5个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度：
（1）对于可溶性的无细菌毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为5mg/皿（液体受试物为5μl/皿）。
（2）对于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据细菌毒性情况确定最高浓度（详见正文1.2.2）。
（3）对于难溶性的受试物，若未观察到细菌毒性，一般以最小沉淀浓度为评价的最高浓度；若观察到浓度相关性的细菌毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文1.2.3）。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在S9混合液中的浓度一般为5%～30%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的菌株特异性的阳性致突变剂。
5.方法
可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后48～72小时观察结果。每一浓度至少平行三皿。
结果中应描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况；结果表示为每皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。
至少在一个菌株上，在有或无代谢活化条件下，受试物所诱发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学分析有助于结果的评价。
（二）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（In vitro mammalian chromosomal aberration test）
1.细胞
可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、TK6细胞、人外周血淋巴细胞等，细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含3个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度。
（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1 mM或0.5 mg/ml （选用较低者）。
（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%但无需超过50%。对于哺乳动物细胞，可采用相对群体倍增数（Relative population doubling，RPD）和相对细胞增长数（Relative increase in cell count，RICC）的减少来反映细胞毒性；对培养的人外周血淋巴细胞，可通过有丝分裂指数（Mitotic Index，MI）的降低来反映细胞毒性。
（3）对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度。
对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度；在一些情况下，如具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度加至3个以上。
每一浓度一般平行2皿；若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当超过3个检测浓度时。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终
浓度一般为1%～10%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
处理及细胞收获时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，受试物和细胞作用3～6小时，在1.5个正常细胞周期时收获细胞；在非代谢活化条件下，受试物和细胞还应持续作用至1.5个正常细胞周期时收获细胞。对于某些受试物，与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个正常细胞周期。
读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察300个分散良好的分裂中期相细胞，若观察到大量染色体畸变细胞，分析细胞数可相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型，染色单体型与染色体型畸变应分别记录并记录亚型（断裂、交换）。裂隙应单独记录，但不计入畸变率中。同时应单独记录多倍体和内复制等数目畸变，但不计入畸变率中。
6.结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。
受试物在任一处理条件下至少一个浓度时染色体畸变率显著升高，升高具有浓度依赖性，且畸变率在阴性对照历史范围之外，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学分析有助于结果的评价。
如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。分析更多的细胞（当可行时），或者通过改变试验条件进行重复试验（如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件等）可能是有用的。
应单独记录多倍体和内复制的发生率。多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。
（三）体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验（In vitro mouse lymphoma cell Tk gene mutation assay，MLA）
1.细胞
通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- 3.7.2 C细胞（注释16）。细胞系需定期检查核型或有无支原体污染等，必要时进行自发突变细胞的清除。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含4个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：
（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1mM或0.5mg/ml （选用较低者）。
（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，最高浓度应能产生80%～90%的细胞毒性。通过相对总生长率（Relative total growth，RTG）来反映细胞毒性。
（3）对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小沉淀浓度作为最高浓度；即使细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，一般建议只检测1个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。
对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度；在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度反应关系，可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至4个以上。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1%～10%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
一般采用微孔法或软琼脂法进行试验。以微孔法为例：
处理时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，一般受试物与细胞作用3～4小时。如果作用3～4小时后结果为阴性，还需进行在非代谢活化条件下作用24小时的附加试验。
突变表达期：受试物与细胞作用结束后，去除受试物，将细胞重悬于培养液中，一般L5178Y细胞的突变表达期为2天。分别在处理结束后及表达期结束后测定平板接种效率以评价细胞毒性。
突变率测定：表达期结束后，将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷（TFT）的96孔板中进行TFT抗性突变集落的测定。如果受试物出现阳性结果，需要对至少一个受试物浓度组（一般为最高浓度）和阴性、阳性对照组分别记录含有大、小集落的孔数；如果为阴性结果，仅需要对阴性和阳性对照组分别记录含有大、小集落的孔数。
6.结果判定
结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况；结果表示为各浓度组的突变率（Mutant frequency，MF）。
MLA试验中阴性对照组和阳性对照组必须符合以下标准才可判定MLA试验成立。
阳性对照组的突变率、突变选择时的克隆率、悬液增长应满足以下条件：
表1 MLA成立的阴性对照组标准
阳性对照组应满足以下条件之一：
（1）总突变率绝对增加，比自发背景突变率增加[即诱导MF（IMF）]至少300×10 -6，至少40%的IMF应该在小菌落MF中。
（2）与同期阴性对照组比较，小菌落MF增加至少150×10-6。
MLA中突变率的增加具有生物学意义的评价标准为，在任何一种试验条件下，如果一个或多个浓度组的突变率增加超过总评价因子（Global evaluation factor，GEF）（GEF为诱导突变率，即高于同期阴性对照的突变率的增加。软琼脂法GEF为90×10-6，微孔法为126×10-6），且呈浓度依赖性，判定为阳性结果。如果在所有试验条件下各浓度组的突变率无浓度依赖性增加或突变率的增加未超过GEF，判定为阴性结果。
如果出现明确的阳性或阴性结果，不需要重复试验。如果结果不是明确的阳性或阴性结果，或者为了帮助确定结果的生物学意义，应对数据进行专家同行评议和/或进一步研究。在重复试验中改变试验条件（如改变试验浓度间距、改变代谢活化条件和处理时间等）可能是有用的。
（四）体外哺乳动物细胞微核试验（In vitro mammalian cell micronucleus test）
1.细胞
可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、TK6细胞、人外周血淋巴细胞等。细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。
2.浓度
至少应包含3个可用于结果分析的浓度。
最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度：
（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1mM或0.5mg/ml （选用较低者）。
（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%。无细胞松弛素B（Cyto B）时通过RICC、RPD的减少来反映细胞毒性，有细胞松弛素B时通过分裂阻滞增殖指数（cytokinesis-block proliferation index，CBPI）或复制指数（Replication index，RI）来反映细胞毒性。
（3）对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，一般建议只检测1个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。
对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖产生细胞毒性的范围，并且包括具有中度或少/无细胞毒性的浓度；在一些情况下，如受试物具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小浓度间距或将检测的浓度增加至3个以上。
每一浓度一般平行2皿；若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当受试物超过3个检测浓度。
3.代谢活化
一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1%～10%（v/v）。
4.对照
代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性诱变剂。
5.方法
处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作用3～6小时，加或不加细胞松弛素B（Cyto B）在1.5～2.0个正常细胞周期时收获细胞；在非代谢活化条件下，加或不加Cyto B受试物和细胞还应持续作用至1.5～2.0个正常细胞周期时收获细胞。对于某些受试物，与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个正常细胞周期。
读片分析：每个浓度应至少观察2000个双核细胞（加Cyto B）或单核细胞（不加Cyto B），分析微核率。应至少观察500个细胞，加Cyto B时通过CBPI或RI来评价其细胞毒性，不加Cyto B 时通过RICC或RPD来评价细胞毒性。
也可采用已经过充分验证的自动化分析系统（如流式细胞术、激光扫描细胞计数仪、图像分析系
第二类体外诊断试剂临床试验指导原则
北京市第二类体外诊断试剂临床试验 指导原则 由于体外诊断试剂产品具有发展快、专业跨度大、临床使用目的各异的特点，不同使用目的的产品，临床研究方法及内容不尽相同。申请人应在完成产品分析性能评估，拟定产品标准后，方可申请体外诊断试剂产品的临床评价。临床评价开始前，申请人应根据产品特点及使用目的，确定临床评价的项目、方法，制定合理的临床评价方案，合理、系统地评价申报产品的临床性能。本方案仅用于指导体外诊断试剂检测方法一致性临床研究，并对临床试验机构的选择、样本要求、检测前的准备、临床试验数据的分析等具体操作提出了一般性要求。 申请人应根据国家法律、法规、标准及技术指导原则的要求建立更加可靠、可重复的临床评价方案，合理评价产品的安全性、有效性。 一、临床试验机构的选择 临床评价开始前，申请人应根据申报产品特点选择临床试验机构。临床试验机构应当具有与申报产品相适应的人员、场地、设备、仪器和管理制度，试验机构的选择应符合以下标准要求：
本方案将申报产品的检测系统称为试验系统，所选择的对照检测系统称为对照系统。 （一）应选择至少2家（含两家）省级卫生医疗机构，特殊使用的产品可在市级以上的疾病控制中心、专科医院或检验检疫所、戒毒中心等临床机构。临床机构的检验实验室（简称实验室）应符合《医疗机构临床实验室管理办法》要求；应优先考虑经CNAS-CL02《医学实验室能力认可准则》(ISO 15189:2007)认可或GB17025标准认可的实验室。 （二）实验室所釆用的检测系统应为完整、有效的, 检测系统包括申报产品的检测系统和所选择的对照检测系统。对照检测系统的试剂、校准品、仪器等应是经注册批准的；其主要分析性能指标（如准确性、精密度、线性范围、参考区间、测量范围等）满足临床要求。 申报产品的检测系统与所选择的对照检测系统最好为同一类型的检测方法（如同为酶联免疫反应、同为化学发光免疫反应等），如为非同一类型的检测方法，尽可能选择分析性能较近似的方法。 （三）实验室应有完善的室内质控程序；应优先选择连续两年以上室间质量评价结果为满意的实验室。 （四）实验室的该项目检测人员应具有相应资质（项目
药物遗传毒性研究技术指导原则
附件四 则
药物遗传毒性研究技术指导原则 一、概述 遗传毒性研究（Genotoxicity Study）就是药物非临床安全性评价得重要内容，它与其她毒理学研究尤其就是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切得联系，就是药物进入临床试验及上市得重要环节。拟用于人体得药物，应根据受试物拟用适应症与作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。 遗传毒性试验就是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤得受试物得体外与体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤得固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组与染色体数目改变形式出现得DNA损伤得固定，一般被认为就是可遗传效应得基础，并且就是恶性肿瘤发展过程得环节之一（这种遗传学改变仅在复杂得恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。在检测此类损伤得试验中呈阳性得化合物为潜在致癌剂与/或致突变剂，即可能诱导癌与/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了某些化合物得暴露与致癌性之间得关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似得关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但就是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应得化合物与可能引起癌症得化合物应引起同样得关注；此外，这些试验得结果可能还有助于解释致癌性得机制与试验结果。因此，在药物开发得过程中，遗传毒性试验得目得就是通过一系列试验来预测受试物就是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者与药品上市后使用人群得用药风险方面发挥重要作用。 本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验得基本原则，并
介绍标准试验组合方案，以及对试验结果得综合分析及评价。 本指导原则适用于中药、天然药物与化学药物得遗传毒性试验研究。 二、基本原则 （一）实验管理 药物得遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共与国药品管理法》得规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。 （二）具体问题具体分析 遗传毒性试验得设计，应该在对受试物认知得基础上，遵循“具体问题具体分析”得原则。应根据受试物得结构特点、理化性质、已有得药理毒理研究信息、适应症与适用人群特点、临床用药方案选择合理得试验方法，设计适宜得试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面得分析评价。 （三）随机、对照、重复 遗传毒性试验应符合毒理学试验得基本原则，即随机、对照与重复得原则。 三、基本内容 （一）受试物 1、中药、天然药物 受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定得样品，一般用中试样品，并注明受试物得名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分得理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒与/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。
《已上市化学药品变更研究的技术指导原则(一)》
已上市化学药品变更研究的技术指导原则 （一） 二OO八年一月
目录 一、概述 (2) 二、已上市化学药品变更研究工作的基本原则 (3) 三、变更原料药生产工艺 (7) 四、变更药品制剂处方中已有药用要求的辅料 (15) 五、变更药品制剂的生产工艺 (24) 六、变更药品规格和包装规格 (31) 七、变更药品注册标准 (37) 八、变更药品有效期和／或贮藏条件 (41) 九、变更药品的包装材料和容器 (44) 十、改变进口药品制剂的产地 (50) 十一、变更进口药品制剂所用原料药的产地以及单独改变 进口的原料药的产地 (54) 十二、变更国内生产药品制剂的原料药产地 (58) 附录一、药物溶出/释放比较研究基本方法 (63) 附录二、免除人体生物等效性研究的一般考虑 (72) 附录三、属于治疗窗窄的部分药物目录 (75) 参考文献 (77) 名词解释 (80) 著者 (81)
一、概述 本指导原则主要用于指导药品生产企业开展已上市化学药品的变更研究。变更是指对已获准上市化学药品在生产、质控、使用条件等诸多方面提出的涉及来源、方法、控制条件等方面的变化。这些变化可能影响到药品的安全性、有效性和质量可控性。变更研究是针对拟进行的变化所开展的研究验证工作。 目前本指导原则涵盖的变更及变更研究包括以下项目：原料药生产工艺变更、药品制剂处方中已有药用要求的辅料和制备工艺变更、注册标准变更、规格变更、有效期和贮藏条件变更、药品的包装材料和容器变更、进口药品产地变更、进口原料药产地和进口药品所用原料药产地变更、变更国内生产药品制剂的原料药产地等研究。 本指导原则仅从技术角度阐述对产品进行变更时，应进行的相关研究验证工作。药品生产企业需按照本指导原则的相关技术要求，开展变更研究验证工作，在完成相关工作后，应根据《药品注册管理办法》中的有关要求，向各级食品药品监管部门提出补充申请。 为便于把握变更可能对产品安全性、有效性和质量可控性产生的影响，本指导原则对所述及的变更划分为三类：I类变更属于微小变更，对产品安全性、有效性和质量可控性基本不产生影响；II类变更属于中度变更，需要通过相应的研究工作证明变更对产品安全性、有效性和质量可控性不产生影响；III类变更属于较大变更，需要通过系列的研究工作证明变更对产品安全性、有效性和质量可控性没有产生负面影响。变更类别划分考虑了目前药品注册管理对补充申请的有
第五章 药物遗传毒性 2015.10.23
第一节基本概念 （1）药物遗传毒性：指药物引起生物细胞基因组分子结构特异改变或使遗传信息发生变化的有害效应； 如：抗肿瘤药噻替派（Thiotepa，三胺硫磷），可造成染色体的断裂； 第一节基本概念 （2）药物的致突变性：指药物对DNA或染色体结构或数目的损伤并能传递给子细胞的作用； 药物遗传毒性（致突变作用）评价，是药物非临床安全性评价的重要内容； 第一节基本概念 （3）突变：是一种遗传状态，是指可以通过复制而遗传的DNA结构的永久性改变； 突变主要包括：基因突变和染色体畸变；两者没有本质区别，只是DNA损伤程度不同；凡能引起染色体畸变的化学药物，大部分能引起基因突变。 基因突变 基因突变：指一个染色体的一个或几个碱基发生变化，这种变化不能用光学显微镜直接观察； 基因突变可分为点突变和移码突变； 基因突变－点突变 点突变：又称“碱基取代型突变”；分为“转换型突变”和“颠换型突变”； 结果：在DNA转录时引起一个RNA密码子的改变，在翻译时可使多肽链中的一个氨基酸发生变更； 点突变-转换型点突变 转换型点突变：指DNA多核苷酸链上的碱基中，嘌呤互相取代（鸟嘌呤G置换腺嘌呤A或相反）或嘧啶相互取代（胞嘧啶C取代胸腺嘧啶T或相反）；如：亚硝酸可引起这种突变； 点突变-转换型点突变 点突变-颠换型点突变 颠换型点突变：指DNA多核苷酸链上的碱基中嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤所引起的突变；如：二乙基亚硝胺等某些烷化剂； 基因突变－移码突变 移码突变：可导致较多遗传信息改变； 如：多环芳香烃类、芳香胺类、嘧啶类化合物和黄曲霉毒素B1等可与DNA形成大加合物而引发； 例：溴化乙啶（EB），含可嵌入堆积碱基之间的一平面基团，致该染料与DNA结合现荧光；可导致基因移码突变；常用于电泳检测DNA。 突变－染色体畸变
药物临床试验的一般考虑指导原则
药物临床试验的一般考虑指导原则 一、概述 药物临床试验的一般考虑指导原则（以下称指导原则），是目前国家食品药品监督管理总局关于研究药物在进行临床试验时的一般考虑。制定本指导原则的目的是为申请人和研究者制定药物整体研发策略及单个临床试验提供技术指导，同时也为药品技术评价提供参考。另外，已上市药品增加新适应症等进行临床试验时，可参照本指导原则。本指导原则主要适用于化学药物和治疗用生物制品。 二、临床试验基本原则 （一）受试者保护 1．执行相关法律法规 药物临床试验必须遵循世界医学大会赫尔辛基宣言，执行国家食品药品监督管理总局公布的《药物临床试验质量管理规范》等相关法律法规。 2．应具备的安全性基础 开展任何临床试验之前，其非临床研究或以往临床研究的结果必须足以说明药物在所推荐的人体研究中有可接受的安全性基础。 在整个药物研发过程中，应当由药理毒理专家和临床专家等动态地对药理毒理数据和临床数据进行评价，以评估临床试验可能给受试者带来的安全性风险。对于正在或将要进行的临床试验方案，也应进行必要的调整。 参与药物临床试验的有关各方应当按各自职责承担保护受
试者职责。 （二）临床试验基本方法 1．临床试验一般规律 药物研发的本质在于提出有效性、安全性相关的问题，然后通过研究进行回答。临床试验是指在人体进行的研究，用于回答与研究药物预防、治疗或诊断疾病相关的特定问题。通常采用两类方法对临床试验进行描述。 按研发阶段分类，将临床试验分为Ⅰ期临床试验、Ⅱ期临床试验、Ⅲ期临床试验和Ⅳ期临床试验。 按研究目的分类，将临床试验分为临床药理学研究、探索性临床试验、确证性临床试验、上市后研究。 两个分类系统都有一定的局限性，但两个分类系统互补形成一个动态的有实用价值的临床试验网络（图1）。 图1. 临床研发阶段与研究类型间的关系 （实心圆代表在某一研发阶段最常进行的研究类型，空心圆代表某些可能但较少进行的研究类型）概念验证（Proof of Concept，POC）是指验证候选药物的药理效应可以转化成临床获益，一般在早期临床研究阶段进行，用以探索安全耐受剂量下有效性的信号，降低临床开发风险。 本指导原则采用以研究目的分类为主线对临床试验进行描述。 临床药理学研究的目的是评价耐受性，明确并描述药代动力学及药效学特征，探索药物代谢和药物相互作用，以及评估药物活性。 探索性临床试验的研究目的是探索目标适应症后续研究的给药方案，为有效性和安全性确证的研究设计、研究终点、方法
遗传毒性试验-动物中心
致突变试验：根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点（基因突变和染色体畸变）的不同。要求新药必须做下列三项试验。（１）微生物回复突变试验 菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Ｓｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）四株（ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２），亦可采用大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＷＰ２若干株（大肠杆菌试验）。 剂量：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。一般最大剂量可达５ｍｇ／皿。受试物至少应有五种不同剂量否则应说明选定剂量的理由。 代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（Ｓ９）进行体外代谢活化试验，即在加Ｓ９混合物和不加Ｓ９混合物平行的条件下测试。 对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。 结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。 （２）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。 剂量：至少应用三种不同剂量，高剂量以５０％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选定剂量的理由。
标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后２４和４８小时制作染色体标本。 代谢活化：应用适当的代谢活化法。 对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。 镜检：每种浓度至少观察１００个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。 结果判定：受试物诱发的染色体畸变的出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频度和种类。 （３）体内试验 一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。ａ．啮齿类动物微核试验 动物：一般用小鼠，每组１０只性成熟动物（雌雄各半）或至少６只性成熟雄性动物。 给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量从１／２ＬＤ５０为基准，腹腔和／或口服一次给药，必要时可连续给药。否则应说明选定剂量的理由。 对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发微核阳性的物质作阳性对照。标本制作：给药后１８—３０小时或１２—７２小时处死动物，取骨髓，离心、涂片，Ｇｉｅｍｓａ染色或吖啶橙染色。 镜检：每只动物至少观察计数１０００个多染红细胞，观察其微核出
遗传毒性试验指导原则
药物遗传毒性研究技术指导原则 （第二稿） 二○○六年十月
药物遗传毒性研究技术指导原则 一、概述 (3) 二、基本原则 (4) （一）实验管理 (4) （二）具体问题具体分析 (4) （三）随机、对照、重复 (4) 三、基本内容 (4) （一）受试物 (4) 1、中药与天然药物 (3) 2、化学药物 (3) （二）试验设计的总体考虑 (5) 1、体外试验基本要求 (6) 2、体内试验基本要求 (9) （三）标准试验组合 (10) 1、标准组合试验应具备的特征 (11) 2、推荐的标准试验组合 (8) 3、标准试验组合的调整 (12) （四）与致癌试验相关的附加遗传毒性试验 (9) 四、结果分析与评价 (14) （一）体外试验结果的评价 (15) 1、体外试验阳性结果 (15) 2、体外试验阴性结果 (15)
（二）体内试验结果的评价 (16) 1、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原则 (16) 2、生殖细胞诱变剂的检测 (18) （三）综合分析与评价 (18) 五、遗传毒性研究进行的时间 (12) 六、参考文献 (19) 七、著者 (20) 八、相关注释 (21) 九、附录 (26)
一、概述 遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。 遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的化合物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般认为是可遗传效应的基础，且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了特殊化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖系统细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性试验的结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。 本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并介
抗肿瘤药物临床试验技术指导原则
抗肿瘤药物临床试验技术指导原则 一、概述 恶性肿瘤是严重威胁人类生命的一类疾病，尽管现有治疗手段取得了一定疗效，但多数肿瘤患者生存时间有限，缺乏有效的可以治愈的药物，亟需开发新的药物来满足需要。在抗肿瘤药物的风险效益评估中，医护人员和患者可能愿意承受相对较大的安全性风险，所以抗肿瘤药物的临床研究除遵循一般药物临床研究原则外，还应考虑其特殊性。由于肿瘤生物学研究的进展，一些新的作用机制、作用靶点的抗肿瘤药物不断涌现，呈现出不同于以往传统细胞毒类药物的安全性和有效性特点；肿瘤疾病的药物治疗也从以往的单纯追求肿瘤缩小向延长患者的生存期、提高生存质量转变，这些改变使抗肿瘤药物临床疗效评价终点指标也出现较大改变。因此，传统的抗肿瘤药物开发模式已经变得不适宜，需要更多地探索能加快和促进开发进程的临床研究策略。 本指导原则将对抗肿瘤药物临床研究一般考虑进行阐述，重点阐述在不同临床研究阶段中需要重点考虑的问题，旨在为抗肿瘤药物临床研究的设计、实施和评价提供方法学指导。申请人在进行临床研究时，还应当参照国家食品药品监督管理局（以下简称SFDA）既往发布的相关指导原则和《药物临床试验质量管理规范》（GCP）要求进行，对于一般药物临床研究需要遵从的原则以及与其他指导原则重复内容在本文中不再赘述。 本指导原则主要适用于抗肿瘤新化合物的临床研究，抗肿瘤生物制品也可参考部分内容，不适用于中药制剂。药物类别上主要针对细胞毒
类抗肿瘤药物临床研究，由于非细胞毒类药物（如信号传导抑制剂，生物反应调节剂，激素类等）是目前新药开发的主要方向，本指导原则也将尽可能对此类别药物临床研究的不同之处进行阐述。 本指导原则中的观点仅代表SFDA当前对抗肿瘤药物临床研究的一般性认识，不能涵盖在新药研发中遇到的所有情况，申请人在研究中应始终坚持具体问题具体分析的原则。尤其应注意的是，抗肿瘤药物研究理论和技术的快速发展，很可能对将来抗肿瘤药物开发模式产生影响，因此申请人可以积极探索更为科学合理的研究方法，并及时寻求SFDA 药品注册部门的建议。 二、临床研究的总体考虑 抗肿瘤药物的临床研究过程通常分为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验。Ⅰ期临床试验主要目的是对药物的耐受性、药代动力学进行初步研究，为后期研究给药方案的设计提供数据支持；Ⅱ期临床试验主要是探索性的研究，如给药剂量探索、给药方案探索、瘤肿有效性探索等，同时也观察安全性；Ⅲ期临床试验则在Ⅱ期基础上进一步确证肿瘤患者临床获益情况，为获得上市许可提供足够证据。 需要指出，这种临床研究的分期并不是固定的开发顺序。在本指导原则中，尽管对Ⅰ、Ⅱ期探索性试验和Ⅲ期确证性试验区别对待，但统计假设的建立和检验也可以成为Ⅱ期临床试验的一部分，同样，部分探索性研究也可能成为Ⅲ期临床试验的一部分。 由于Ⅲ期临床试验需要提供生存获益的疗效数据，试验周期较长，因此可以采用探索的开发模式，按照预定的中期分析计划，依据不断积累的信息，对临床试验方案进行调整。
药物遗传毒性研究技术指导原则2018
附件 药物遗传毒性研究技术指导原则 一、概述 遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。 遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。 本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 （一）实验管理 药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。 （二）具体问题具体分析 遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验
药物I期临床试验管理指导原则(试行)
药物Ⅰ期临床试验管理指导原则（试行） 第一章总则 第一条为加强药物Ⅰ期临床试验（以下简称I期试验）的管理，有效地保障受试者的权益与安全，提高Ⅰ期试验的研究质量与管理水平，根据《中华人民共和国药品管理法》、《药品注册管理办法》、《药物临床试验质量管理规范》等相关规定，参照国际通行规范，制定本指导原则。 第二条本指导原则适用于Ⅰ期试验，旨在为Ⅰ期试验的组织管理和实施提供指导。人体生物利用度或生物等效性试验应参照本指导原则。 第二章职责要求 第三条申办者应建立评价药物临床试验机构的程序和标准，选择、委托获得资格认定的I期试验研究室进行Ⅰ期试验。 第四条申办者应建立质量保证体系，对I期试验的全过程进行监查和稽查，确保临床试验的质量，保障受试者的权益与安全。 第五条申办者可以委托合同研究组织（CRO）执行I期试验中的某些工作和任务。委托前对合同研究组织的研究条件、能力、经验以及相应的质量管理体系进行评价。当合同研究组织接受了委托，则本指导原则中规定的由申办者履行的责任，合同研究组织应同样履行。申办者对临床试验的真实性及质量负最终责任。
第六条Ⅰ期试验研究室负责Ⅰ期试验的实施。研究者应遵循临床试验相关法律法规、规范性文件和技术指导原则，执行临床试验方案，保护受试者的权益与安全，保证临床试验结果的真实可靠。 第七条药物临床试验生物样本分析应在符合《药物临床试验生物样本分析实验室管理指南》（以下简称《实验室管理指南》）的实验室进行。从事药物临床试验生物样本分析的实验室均应接受药品监督管理部门的监督检查。 第八条伦理委员会应针对Ⅰ期试验的特点，加强对受试者权益与安全的保护，重点关注：试验风险的管理与控制，试验方案设计和知情同意书的内容，研究团队的人员组成、资质、经验，受试者的来源、招募方式，实施过程中发生的意外情况等。 第三章实施条件 第九条Ⅰ期试验研究室应设有足够的试验病房，也可以设有临床试验生物样本分析实验室（以下简称实验室）。试验病房应符合本指导原则的要求，实验室应符合《实验室管理指南》的要求。均应具备相应的组织管理体系、质量管理体系及能满足I期试验需要的场所和设施设备等。 第十条I期试验研究室应配备研究室负责人、主要研究者、研究医生、药师、研究护士及其他工作人员。所有人员应具备与承担工作相适应的专业特长、资质和能力。实验室人员应符合《实验室管理指南》的要求。 （一）研究室负责人。研究室负责人总体负责I期试验的管理工作，保障受试者的权益与安全。研究室负责人应具备医学或药学本科以上学历并具有高级职称，具有5年以上药
药物生殖毒性研究技术指导原则
【 Z H 】 G P T 1 - 1 指导原则编号： 药物生殖毒性研究技术指导原则 (第二稿) 二○○六年一月 目录 一、概述 (3) 二、基本原则 (3) （一）实验管理 (3) （二）具体问题具体分析 (4) （三）随机、对照、重复 (4) 三、基本内容 (4) （一）总体考虑 (4) 1、受试物 (4) 2、受试物药代动力学研究 (5) 3、试验系统 (5) 3.1 试验动物 (5) 3.2 其他试验系统 (6) 4、给药 (6) 4.1 剂量选择 (6) 4.2 给药途径 (7) 4.3 给药频率 (7) 4.4对照组 (7)
（二）试验方案 (7) 1、试验方案选择的一般考虑 (7) 2、常用的试验方案 (8) 2.1生育力与早期胚胎发育毒性试验（I段） (8) 2.1.1试验目的 (8) 2.1.2动物选择 (9) 2.1.3 给药期 (9) 2.1.4 动物处理 (9) 2.1.5 观察指标 (9) 2.2胚胎-胎仔发育毒性试验（II段） (10) 2.2.1试验目的 (10) 2.2.2动物选择 (10) 2.2.3 给药期 (10) 2.2.4 动物处理 (11) 2.2.5 观察指标 (11) 2.3 围产期毒性试验（III段） (12) 2.3.1试验目的 (12) 2.3.2动物选择 (12) 2.3.3 给药期 (12) 2.3.4 动物处理 (12) 2.3.5 观察指标 (12) 3、其他试验方案 (13) 3.1 单一（全程）试验设计（啮齿类动物） (14) 3.2 两段试验设计（啮齿类动物） (14) （三）毒代动力学 (14) 四、结果分析与评价 (15) （一）统计分析 (15) （二）数据报告 (16) （三）结果分析 (16) 1、生殖毒性 (16) 2、发育毒性 (17) 3、其他 (17)
化学药物制剂研究基本技术指导原则
指导原则编号： 【H】G P H4-1化学药物制剂研究基本技术指导原则 （第二稿） 二ΟΟ四年三月十八日
目录 一、概述 (3) 二、制剂研究的基本内容 (3) 三、剂型的选择 (5) 四、处方研究 (7) （一）、原料药 (7) （二）、辅料 (7) （三）、处方设计 (10) （四）、处方筛选和优化 (11) （五）、处方的确定 (13) 五、制备工艺研究 (14) （一）、工艺设计 (14) （二）、工艺研究 (14) （三）、工艺放大 (16) 六、药品包装材料的选择 (17) 七、质量研究和稳定性研究 (19) 【附录】 (20) 【参考文献】 (22) 【起草说明】 (23) 【著者】 (28)
一、概述 药物必须制成适宜的剂型才能用于临床。制剂研发的目的就是要保证药物的药效，降低毒副作用，提高临床使用的顺应性。如果剂型选择不当，处方、工艺设计不合理，对产品质量会产生一定的影响，甚至影响到产品疗效及安全性。因此，制剂研究在药物研究与开发中占有十分重要的地位。 本指导原则是在参考国内外有关制剂研究的技术指导原则的基础上，根据药品研究开发的自身规律，结合国内药物研发实际状况，并考虑到目前制剂研究中容易被忽视的影响制剂质量、有效性、安全性的重点问题进行制订的。 由于制剂的剂型及生产工艺纷繁复杂，且各种新剂型和新工艺也在不断出现，制剂研究中具体情况差异很大。本指导原则主要阐述制剂研究的基本思路和方法，为制剂研究提供基本的技术指导和帮助。关于各种剂型研究的详细技术要求，不在本指导原则中详述，药物研发者可参照本指导原则阐述的制剂研究的基本思路开展相应的研究工作。 二、制剂研究的基本内容 制剂的剂型种类繁多，生产工艺也有着各自的特点，研究中会面临许多具体情况和特殊问题。但制剂研究的总体目标是一致的，即通过一系列研究工作，保证制剂剂型选择依据充分，处方合理，工艺稳定，生产过程得到有效控制，适合工业化生产。制剂研究的基本内容是相同的，一般包括以下方面：
遗传毒性试验
遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。 根据检测的遗传学终点分为4种类型: 1检测基因突变（比如：Ames试验）; 2检测染色体畸变（比如：微核试验）; 3检测染色体组畸变（比如：体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验）; 4检测DNA原始损伤（比如：单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)）。以上检测结果为呈阳性（除外假阳性）的化合物，为潜在人类致癌剂和/或致突变的物质。 FDA于2006年制定了遗传毒性试验结果的综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetict oxicologystudyresults） 对遗传毒性试验的阳性结果评价和处理： ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。 目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。 1 现行组合试验方案，用一组试验配套进行试验。200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。 2 各类遗传毒性试验方法的研究进展 2.1 检测基因突变 2.1.1 Ames试验Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如 YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。为了克服S9制备上的困难和不稳定性,Josephy等将沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P-450基因Cyp1A2引入细胞,构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如DJ4501A2[7]。 2.1.2 TK基因突变试验TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。TK基因编码胸苷激酶,该酶催化胸苷的磷酸化反应,生成胸苷单磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶类似物,则产生异常的TMP,掺入DNA中导致细胞死亡。如受检物能引起TK基因突变,胸苷激酶则不能合成,而在核苷类似物的存在下能够存活。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及
药物非临床药代动力学研究技术指导原则
附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要 作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的 基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血
药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较
药物遗传毒性研究技术指导原则
附件四 药物遗传毒性研究技术指导原则
药物遗传毒性研究技术指导原则 一、概述 遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。 遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。 本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并
介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。 二、基本原则 （一）实验管理 药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。 （二）具体问题具体分析 遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面的分析评价。 （三）随机、对照、重复 遗传毒性试验应符合毒理学试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。 三、基本内容 （一）受试物 1、中药、天然药物 受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。
第六章遗传毒性的类型及其形成机制
p147 第六章遗传毒性的类型及其形成机制 突变是遗传物质中不是由于遗传重组产生的任何可遗传的改变。突变按发生原因又分为自发突变和诱发突变。遗传毒理学主要研究理化因素的致突变作用，即诱发突变。已知， 理化因素对DNA的损伤如果不能及时正确地修复，DNA序列将改变并导致突变。由于突 变是单个基因和基因组信息结构的改变，因此常常引起基因功能的丧失或改变。如果这些 损伤是非致死的，将导致可遗传改变。因此，遗传毒性(genotoxicity)通常被定义为损伤DNA 和改变DNA序列的能力。即遗传毒性是指遗传学的改变(或损伤)，而与一般毒性的概念有 所不同，不是指遗传损伤的生物学后果如遗传病、肿瘤等。鉴于此，本章所指的遗传毒性类 型是指遗传学改变的类型，同样其形成机制也是指遗传学损伤的形成机制。 第一节遗传毒性的类型 遗传毒性的类型依分类方法而异可分为不同的类型，至今尚无一致的意见。从机制 角度，可分为以DNA为靶的损伤和不以DNA为靶的损伤，前者包括基因突变(gene mu— tation)和染色体结构畸变(structural chromosome aberration)，后者主要指染色体数目畸变(numerical chromosome aberration)，包括整倍体(euploidy)和非整倍体(aneuploidy)改变。 从遗传损伤能否为光学显微镜所见分为细胞水平和分子水平两类损伤。从遗传学角度或 突变角度可分为基因突变、染色体结构改变和染色体数目改变三类。从遗传毒性上来分， 除三类遗传学改变外还包括DNA损伤(DNA damage)。另外，Thilly于1986年认为整倍 性改变与人类遗传病的关系极微，故主张分为基因突变作用(mutagenesis)、断裂作用(clastogenesis)和非整倍体作用(aneuploidization)。 须注意的是，近年来国外(包括国内分子遗传学界)常将mutation和mutagenesis狭义 地指基因突变，而遗传毒性仅指DNA损伤。在毒理学和预防医学中，通常采用广义的概 念：如将染色体结构畸变和染色体数目畸变统称为染色体畸变；突变既包括基因突变也包 括染色体畸变。同样，诱变剂(mutagen)狭义的指能引起基因突变或增加突变速度的物 质，而将引起染色体结构畸变和染色体数目异常的物质分别称为断裂剂和非整倍体诱变 剂(见下述)。广义的诱变剂则既包括引起基因突变的物质，也包括了引起染色体结构或 数目异常的物质。 一、基因突变[1,2,4,6] (一)基因突变和突变体的概念 基因是遗传信息的贮藏、传递与实现单位。基因的主要信息内容包含在其核苷酸碱 基的线性序列中，由于核苷酸的增加或缺失，或在DNA复制和修复过程中一种核苷酸和 p148 另一种核苷酸的替换，都可导致DNA序列的改变，任何一种引起单个基因功能改变的上 述分子变化称为基因突变。简言之，基因突变是指基因在结构上发生了碱基对组成和排 列顺序的改变。这种改变可发生于生殖细胞或体细胞，发生于生殖细胞的突变可以遗传 给下一代，发生于体细胞的突变可以遗传给该细胞有丝分裂而产生的子代。 携带突变的生物个体或群体（或株系），称为突变体( mutant)。正是由于突变体中 DNA碱基序列的改变，因而产生了突变体的表型。突变位点可能存在于基因内，该基因 称为突变基因(mutant gene)。没有发生突变的基因称为野生型(wild type)基因。例如， 负责细菌合成Arg的基因arg为野生型基因(wild type gene)。如果该基因突变而失去了 合成Arg的能力，就必须由外界供应Arg，否则细菌就不能生长。细菌的这种表型就称为 Arg -表型，即精氨酸合成缺陷表型，其基因型写作arg -。由此可见，突变体是指有机体
国家标准化学药品研究技术指导原则
已有国家标准化学药品研究技术指导原则（第二稿草稿） 二OO 五年三月 1 目录 一、前言 (2) 二、已有国家标准药品研究的基本原则 (2) （一）安全、有效和质量可控原则 (2) （二）等同性原则 (3) （三）仿品种而不是仿标准原则 (5) 三、质量控制研究 (7) （一）制备工艺研究 (8) （二）结构确证研究 (9) （三）制剂处方筛选及工艺研究 (10) （四）质量研究与质量标准 (13) （五）稳定性研究 (18) 四、安全性、有效性研究 (20) （一）口服给药制剂 (22) （二）注射给药制剂 (25) （三）局部给药制剂 (27)
五、参考文献 (29) 六、已有国家标准化学药品研究技术指导原则起草说明 (30) 七、著者 (35) 2 一、前言 根据《药品注册管理办法》（试行），已有国家标准药品的申请是指境内注册申请人提出的生产国家食品药品监督管理局已经颁布正式标准的药品的注册申请。 我国已经颁布的化学药物研究技术指导原则，涵盖了已有国家标准药品研究的一般性技术要求。本指导原则在此基础上，结合我国已有国 家标准药品研制的现状，针对其不同于新药的特点，较为系统地提出了 已有国家标准药品研究过程中有关安全性、有效性和质量控制研究的一 般性原则，并重点阐述了在已有国家标准药品研制中相关技术要求之间 的内在联系及其科学内涵，旨在指导注册申请人在研制已有国家标准药 品时，能够科学、合理地运用已有的化学药物研究技术指导原则，达到 研究的系统性、科学性要求。
本指导原则适用于已有国家标准药品申请中的化学药品。在已有国家标准药品研发和评价中，需要在本原则指导下，以科学性为根本，对 具体问题作具体分析。 二、已有国家标准药品研究的基本原则 在已有国家标准药品的研究中应注意遵循如下原则，以保证研究的科学性。 （一）安全、有效和质量可控原则 无论创新药还是已有国家标准药品，对其安全性、有效性和质量可3 控性的要求是一致的，研发的根本原则都是要围绕安全、有效和质量可 控进行充分的研究。而已有国家标准药品的研究有别于创新药之处在于， 可以利用已上市产品的可获得资料，因此有可能减少相应部分的研究工 作。 如果研制的已有国家标准药品与已上市产品的药学基础相同，即原料药的合成路线、工艺条件以及所用原材料、试剂和溶剂的来源、规格 等均一致；制剂的处方工艺相同，包括其中所用原料药、辅料的来源、规格等一致；并经验证研制产品与已上市产品质量一致、生物等效，
ICH关于遗传毒性结果评价和追加试验策略指导原则--人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍(三)
发布日期20080729 栏目化药药物评价>>综合评价 ICH关于遗传毒性结果评价和追加试验策略指导原则--ICHS2（R1）人用药物遗传标题 毒性试验和结果分析指导原则介绍（三） 作者黄芳华 部门 正文内容 审评二部黄芳华 遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效 应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性 肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。染色体数目的改变还与肿瘤发生有关和可提 示生殖细胞发生非整倍体的潜在性。在检测这些类别损伤的试验中呈阳性的化合物 为潜在人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌 性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要 用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能 引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些 试验的结果可能还有助于致癌性试验分析。 遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。但是遗传毒性的假阳性和 假阴性结果难以避免，尤其是近年来体外哺乳动物细胞试验系统阳性结果（该结果 与人用危险不相关）过高的问题已引起的广泛关注。因此对结果进行综合分析尤为 重要。FDA于2006年出台了推荐的遗传毒性试验结果综合分析法指导原则 （Guidance for industy and review staff: Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results），对遗传毒性试验出现阳性结果如何评价和处 理进行了讨论。现介绍ICH S2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。 对比试验已明确显示，在预测药物对啮齿类动物致癌性时每种体外检测系统均可产生假阴性和假阳性结果。遗传毒性试验组合（包括体内和体外试验）检测的是 被认为主要通过直接的遗传损伤机制的致癌剂，如绝大多数已知的人类致癌剂。因