HPLC谱图的各种问题及相应的解决办法

HPLC谱图的各种问题及相应的解决办法

随着2005年版药典的施行，高效液相色谱仪在新版药典中得到极为广泛的应用。我们在平常的检验工作中，常常发现HPLC谱图会与理论上的有差别，出现各种各样的问题，一直是困扰着广大药品检验人员的一个主要因素。当出现某种现象时，又该如何去有针对性的解决问题呢，这也是广大药检人士所共同期待的事，如今参考多种文献资料，讲义，教材，结合自身的平常工作经验，将一些常见的，主要的现象，原因及解决措施进行了整理总结，以供专业人士查阅参考,也。这里所罗列的也只是一个大概内容。如何做到真正解决问题，我认为坚持几个原则：一具体问题具体对待原则；二先外设后内部原则；三由简而繁原则；四单一处理到综全处理原则。由于这方面所遇到的问题相对比较多，笔者打算做成几个系列化内容，分次发表。下面先介绍几个最常见，最主要的问题。（解决办法前的编号对应前面相应的原因编号，其他皆同。）

问题一：基线漂移

原因主要有：1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）；2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）；3、流通池被污染或有气体；检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）；4、流动相配比不当或流速变化；5、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；6、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成；7、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线；8、使用循环溶剂，但检测器未调整；9、检测器没有设定在最大吸收波长处。

针对上述原因，有一些基本的解决办法：1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器；2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气；3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）；4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗；5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速；6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗；7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂；8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相；将波长调整至最大吸收波长处。

问题二：基线噪音（规则的）

主要原因有：1、在流动相、检测器或泵中有空气；2、漏液；3、流动相混合不完全；4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）；5、在同一条线上有其他电子设备；6、泵振动

解决措施：1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；2、检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封；3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂；4、减少差异或加上热交换器；5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正；

6、在系统中加入脉冲阻尼器。

问题三：基线噪音（不规则的）

主要原因：1、漏液；2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成；3、流动相各溶剂不相溶；4、检测器/记录仪电子元件的问题；5、系统内有气泡；6、检测器

内有气泡；7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）；8、检测器灯能量不足；9、色谱柱填料流失或阻塞；10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常；

解决措施：1、检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液；2、检查流动相的组成；3、选择互溶的流动相；4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正；5、用强极性溶液清洗系统；6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器；7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池；8、更换灯；9、更换色谱柱；10维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置；

问题四：拖尾峰

造成拖尾峰的原因比较多，常见的主要原因有1、筛板阻塞；2、色谱柱塌陷；

3、干扰峰；

4、流动相PH选择错误；

5、样品与填料表面的溶化点发生反应。解决措施：1、反冲色谱柱、更换进口筛板、更换色谱柱；2、填充色谱柱；

3、使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱；

4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰；

5、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂、更改色谱柱。

问题五：前延峰

原因主要有：1、柱温低；2、样品溶剂选择不恰当；3、样品过载；4、色谱柱损坏；

解决措施：1、升高柱温；2、使用流动相作为样品溶剂；3、降低样品含量；4、反冲色谱柱、更换进口筛板、更换色谱柱；5、填充色谱柱。

问题六：分叉峰

主要原因：1、保护柱或分析柱污染；2、样品溶剂不溶于流动相。

解决措施：1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱；2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

问题七：变形峰

主要原因：1、样品过载；2、样品溶剂选择不恰当；

解决措施；1、减少样品载量；2、减少进样体积、运用低极性样品溶剂

问题八：早出的峰变形

主要原因：1、样品溶剂选择不恰当

解决措施：1、减少进样体积、运用低极性样品溶剂

问题九：酸性或碱性化合物的峰拖尾

主要原因：1、缓冲不合适

解决措施：1、使用浓度50-100mM的缓冲液、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

问题十：额外的峰

主要原因：1、样品中有其他组份；2、前一次进样的洗脱峰；3、空位或鬼峰解决措施：1、正常；2、增加运行时间或梯度斜率、提高流速；3、检查流动相是否纯净、使用流动相作为样品溶剂、减少进样体积。

问题十一：保留时间波动

主要原因：1、温控不当；2、流动相组分变化；3、色谱柱没有平衡。

解决措施：1、调好柱温；2、防止变化（蒸发、反应等）；3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。

问题十二：保留时间不断变化

主要原因：1、流速变化；2、泵中有气泡；3、流动相选择不恰当

解决措施：1、重新设定流速；2、从泵中除去气泡；3、更换合适的流动相、选择合适的混合流动相。

问题十三：宽峰（是指峰形变宽，变胖，也称胖峰）

主要原因：1、流动相组成变化；2、流动相流速太低；3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）；4、检测器设定不正确；5、柱外效应影响、柱子过载、检测器对反应时间或池体积响应过大、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大、记录仪响应时间太长；6、缓冲液浓度太低；7、保护柱污染或失效；8、色谱柱污染或失效，塔板数较低；9、柱入口塌陷；10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰；11、柱温过低；12、检测器时间常数太大。

对应的解决措施：1、重新制备新的流动相；2、调节流速；3、检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封；4、调整设定；5、小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品、减少响应时间或使用更小的流通池、使用内径为0.007-0.01的短管路、减少响应时间；6、增加浓度；7、更换保护柱；8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果；11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃；12、使用较小的时间常数。

问题十四：分离度降低

主要原因：1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）；2、保护柱或分析柱阻塞。

解决措施：1、重新配置流动相；2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

问题十五：所有的峰面积都太小（大）

主要原因：1、检测器衰减（或灵敏度）设定过高；2、检测器时间常数设定太大；3、进样量太少；4、记录仪连接不当；5、检测器衰减（或灵敏度）设定过低；6进样过多；7记录仪连接不正确

解决措施：1、减少衰减（灵敏度）的设定；2、设定较小的时间常数；3、增大进样量；4、使用正确的连接；5、采取较大的衰减（灵敏度）；6、减少进样量；

7、正确连接记录仪。

问题十六：进样阀出问题

现象：进样阀转动不灵

主要原因：1、转子密封损坏；2、转子太紧

解决措施：1、更换或调整转子密封；2、调整转子的松紧度。

现象：手动用样阀载样困难

主要原因：1、进样阀安装不当；2、定量环阻塞；3、进样器污染；4、管路阻塞。

解决措施：1、重新安装；2、清洗或更换定量环；3、清洗或更换进样器；4、

清洗或更换管路。

现象：自动进样阀不能转动

主要原因：1、无压力（或电源）；2、转子太紧；3、进样阀安装不当。

解决措施：1、检查电源连接，以提供恰当的压力（电源）；2、调整转子的松紧度；3、重新安装。

现象四：自动进样阀的其他问题

主要原因：1、阻塞；2、机械故障；3、控制器故障。

解决措施：1、清洗或更换阻塞部件；2、参阅随机维修手册；3、维修或更换控制器。

笔者结合常年从事药检工作的经验，参考相关资料，从基线、峰形、保留时间、机械故障等四个主要方面对高效液色谱图中出现的常见问题进行了现象概述、原因剖析、解决方法选择的介绍。尽管这里罗列了些主要常见现象，但这里只是一部分。随着HPLC法在药品检验过程中的运用，还会遇到许多各种各样的新问题，因此希望在给广大同仁们带来方便之际，也请多指教，补充，以便我们能够共同学习提高

高效液相色谱仪的几个使用问题

1. 色谱柱中的流动相会排干吗？

不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。

2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？

如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会

使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。

3. 如何预防液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:

1).用高质量试剂和HPLC级溶剂；

2）、过滤流动相和溶剂；

3）、脱气；

4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；

5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；

6）、定期更换垫圈；

7）、需要时加润滑油；

8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。

处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。

为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具

基线不稳可能的原因和解决方法

基线不稳可能的原因和解决方法如下：

1 流动相中可能有溶解气体。用超声脱气15～30分钟或用氮气脱气。

2 系统中可能有漏液处。检查病确定漏液的位置并排除。

3 泵的密封可能损坏，使泵压不稳。更换泵的密封。

4 柱子平衡胶慢，特别是更换流动相时。用中等强度的溶剂冲洗柱子。一般更换流动相时，先用10到20倍体积的新流动相冲洗。

5 单向阀可能堵塞。取下单向阀，用超声在纯水中清洗30分钟。

6 检测器没有设定在最大吸收波长处。

7 柱子中有气泡。

8 泵中有气泡

梯度洗脱

对于组分复杂的样品，采用一种色谱体系，很难得到理想的分离结果。要么分离时间太长，要么分离度太差。

液相色谱中采用梯度洗脱,目的：缩短的时间；提高分离效果。

梯度洗脱：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。

梯度洗脱特点：

提高柱效

改善检测器的灵敏度

当样品中的一个峰的k'值和最后一个峰的k'值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。

梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。

梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。

梯度范围：指流动相中强溶剂分别在起始液和终止液中的浓度。

调节梯度范围对得到最佳的梯度分离起重要作用。

最佳梯度范围：第一个峰处分时间大约为2倍的t0，梯度结束时把最后一个峰洗脱出来。

梯度洗脱的形式

线形梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化与梯度时间成线性比例。在一定时间内流动相强度越大，直线斜率越大。

指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度岁梯度时间变化称指数关系。

凹形：梯度起始阶段强度变化缓慢，随时间增加，强度变化加快。

凸形：起始阶段梯度速度变化快，终止阶段梯度速度变化慢。

折线形：

选择适当的A,B溶剂

强度：A溶剂为低强度；

B溶剂为高强度，B溶剂的强度应能够在梯度过程中使所有欲测谱带都能被洗脱，并使各谱带的k’值在2-10之间。

初步分离

选择好A、B两种溶剂，先按中等强度进行配比，在此恒定强度下进行初步分离。A、B混合溶剂强度应使所有谱带的k’值在1-10之间。

梯度形式选择

经过初步分离，一般可能得到3种分离色谱图：

①前半部峰重叠，后半部峰分离度过大，保留时间太长；

可选择线形梯度，或凹形梯度。

②前半部分离良好，后半部峰重叠；

可选择凸形梯度。

③前后两部分分离良好，中间部分峰重叠。

可选择折线梯度。

梯度洗脱一般应给出下列条件：起始液（A液）、终止液（B液）、起始时间（min）、终止时间（min）、梯度速度（B% /min）。

手性液相色谱柱介绍

随着科学发展，在医药、农药等领域越来越讲究有效体的作用，因此提高有效体的含量，降低无效体，减少环境污染，就成为研究的方向。在同一种有机化合物中，往往存在结构异构体和光学异构体，尤其是光学异构体，一般会表现出外消旋现象。目前，大量的商品药物化合物均含有一种或多种手性成分，光学异构体的存在极大的影响了药物的效能。为了能够分析光学异构体，因此人类开始了手性色谱柱的研究。

一、什么是手性色谱柱

手性色谱柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。

在手性拆分中，温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力，但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响，确定最优柱温。

二、手性色谱柱的分类及应用

迄今为止，尚没有一种类似十八烷基键合硅胶（ODS）柱的普遍适用的手性柱。不同化学性质的异构体不得不采用不同类型的手性柱，而市售的手性色谱柱通常价格昂贵，因此如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。

根据手性固定相和溶剂的相互作用机制，Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系：

第1类：通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。

第2类：既有类型1中的相互作用，又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。

第3类：基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色谱柱也属于此类。

第4类：基于形成非对映体的金属络合物，是由Davankov开发的手性分离技术，也称为手性配位交换色谱（CLEC）。

第5类：蛋白质型手性色谱柱。手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。

但是，随着由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多，此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。因此参考Irving Wainer的分类方法，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种：

刷（Brush）型或称为Prikle型

纤维素（Cellulose）型

环糊精（Cyclodextrin）型

大环抗生素（Macrocyclic antibiotics）型

蛋白质（Protein）型

配位交换（|Ligand exchange）型

冠醚（Crown ethers）型

1、刷型：

刷型手性色谱柱的出现和发展源于Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代，Bill Prikle将手性核磁共振中的成果运用到手性HPLC固定相研究中，通过不断实践，发明了应用范围较广、柱效很好的手性色谱柱。刷型手性色谱柱是根据三点识别模式设计的，属于Irving Wainer分类中的第一种类型。

刷型手性固定相分为π电子接受型和π电子提供型两类。最常见的π电子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到γ-氨丙基硅胶上的

制成。此类刷型手性色谱柱可以分离许多可提供π电子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后进行手性分离。

π电子供给型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物，这种固定相要求被分析物具有π电子接受基团，例如二硝基苯甲酰基。醇类、羧酸类、胺类等，可以用氯化二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后，用π电子供给型固定相达到手性分离。

刷型固定相的优势在于其易于合成。合成方法在Bill Prikle的著作中有详细的说明。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的选择因子。它的不利之处在于它仅对芳香族化合物有效，有时不得不进行衍生化反应。但值得一提的是，这种衍生化反应是非手性衍生反应，所以不存在手性衍生的问题。刷型手性色谱使用的流动相基本是极性弱的有机溶剂，这对于制备色谱来讲未必是缺点。

近来，刷型固定相出现了π电子供给和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分适用于β-阻断剂的手性分离。典型的流动相为二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例为85：10：5。加入10mM醋酸铵可以调整保留时间。SS BLAMO Ⅱ，同时具有π电子供体区和受体区，形成手性裂缝，因此对于某些分子具有很高选择性。

2、纤维素型：

纤维素型手性色谱柱的分离作用包括相互吸引的作用及形成包埋复合物。它们属于Wainer分类中的第2种类型。市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸盐纤维素固定相。很多化合物可通过此类型的色谱柱得到分离。这种类型的手性色谱柱种类也很齐全。流动相使用低极性溶剂，典型的流动相为乙醇-己烷混合物。但特别要注意由于氯可以使纤维素从硅胶上脱落，因此要确保流动相中无含氯溶剂。

这种类型的手性色谱柱主要的制造商之一是日本的Daicel公司，他们生产的纤维素酯和氨基甲酸纤维素柱可以分离多种生物碱和药物。特别值得一提的是OD 柱。在某手性化合物异构体的分离中，分离度超过了25，这意味着载样量可以

很高，对于制备十分有利。

纤维素固定相的每个单元都为螺旋型，而且这种螺旋结构还存在极性作用、π-π作用及形成包埋复合物等手性分离因素。淀粉代替纤维素制成的此类手性柱显示了和纤维素柱不同的选择性，但是稳定性较差。因为淀粉是水溶性的，因此流动相中必须绝对无水才能保证柱子寿命。目前此类型的柱子能分离80%左右可能面临到的所有手性化合物。此类柱子通常用于正相系统，用正己烷-乙醇，

正己烷-异丙醇混合溶剂为流动相。OD柱也可用于反相的情况，但流动相必须含有高浓度的高氯酸盐缓冲液，以防止固定相溶解。即使这样，使用较长时间以后色谱柱也难免要受到损害，但是在某些情况下使用反相系统分离效果要优于使用正相系统。

3、环糊精型：

环糊精是通过Bacillus Macerans 淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。通过控制环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。市售的环糊精主要是α、β、γ三种类型，分别含6、7、8个吡喃葡萄糖单元。环糊精分子成锥筒型，构成一个洞穴，洞穴的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目决定。环糊精类型及洞穴的孔径等见下表：

环糊精糖元数目洞穴孔径可进入洞穴的分子类型，手性中心数目α 6 4.5-6.0 5-6元环的芳香族化合物，30

β 7 6.0-8.0 联苯或萘，35

γ 8 8.0-10.0 取代芘和类固醇，40

2，3位仲羟基分布在环糊精洞口，6位伯羟基在环糊精分子的外部，这意味着洞穴内部是相对疏水的区域。用环糊精手性固定相产生手性识别要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊精洞穴中，形成可逆的、稳定性不同的包合物，环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团相互作用。

由于形成包合物速度较慢，因此可能导致色谱峰峰形较差，同样也影响了其在制备色谱中的应用。环糊精固定相的选择性取决分析物的分子大小；α-环糊精只能允许单苯基或萘基进入，β-环糊精允许萘基及多取代的苯基进入，γ-环糊精仅用

于大分子萜类。β-环糊精手性固定相应用范围最广。Ibuprofen通过β-环糊精色谱柱得到分离，说明了pH值对氢键的影响。当流动相的pH=7时，观察不到拆分的迹象。pH=4时，可达到好的分离效果。通常分离氨基酸时，常采用低的p H值，以抑制酸性基团的离子化，同时也增强氨基的质子化。磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对β-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。通常缓冲液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸调节到合适的pH值。高的流速会降低形成复合物的能力，低流速分离效果较好，0.5-1ml/min的流速最好。另外，增加缓冲液的浓度可以克服流速的影响，因为它可以增加环糊精洞穴和流动相的吸引力。

常用缓冲液及其使用浓度如下表所示：

缓冲液浓度目的

TEAA（乙酸三乙胺盐） 0.01-2%

NH4NO3 10-500mM (用于减小包埋)

柠檬酸盐 10-200mM (特别适合于酸性化合物)

醋酸铵 10-200mM

pH值选择见下表:

缓冲液 pH值目的

醇和胺 pH4 (加强NH的离子化)

酸 pH7

优化手性分离条件要考虑的方面有：pH值对分离度的影响；流速对分离度的影响；柱温、有机相比例、缓冲盐浓度对分离度的影响。

环糊精的修饰：最近，对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分离更多的化合物，并可用于气相手性色谱分离。衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精洞穴表面的羟基上。衍生化反应包括乙基化、S-羟基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸盐、3，5二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。这些新型的环

糊精固定相有许多优点，它们可以分离更多化合物，价格上也有竞争力，由于改进了手性识别能力使其更适用于制备色谱。

4、配位交换型：

手性配位交换色谱（Chiral Ligand Exchange Chromatography，CLEC）由Davankov发明，是通过形成光学活性的金属络合物而达到手性分离，属于Irvi ng Wainer分类中的第4类手性固定相，主要用于分离氨基酸类。

由于此类固定相是由手性氨基酸—铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形

成，因此流动相中必须含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。其它的过渡金属元素也已用于手性配位交换色谱，但铜离子应用最广。形成络合物的过程十分缓慢，因此有时需提高柱温，最佳温度约50℃。

手性配位交换色谱仅对α- 氨基酸和其类似物有效。β- 氨基酸很难用手性

配位交换色谱得以分离。手性配位交换色谱可用于制备，由于流动相中存在铜离子，虽然铜离子能用离子交换柱除去，但增加了样品处理的困难。

5、大环抗生素型：

大环抗生素型手性色谱柱是最近发展起来的，通过将大环抗生素键合到胶

上制成的新型手性色谱柱。大环抗生素型手性色谱柱的出现归功于Dan Armstr on 的贡献。此类色谱柱常用的大环抗生素主要由三种：利福霉素（Rifamycin），万古霉素（Vancomycin），替考拉宁（Ticoplanin）。利福霉素作为手性添加剂在毛细管电泳分离手性化合物方面得到了成功运用。万古霉素和替考拉宁分子结构中存在“杯”状结构区和糖“平面” 结构区。此类色谱柱性质稳定，可用于多种分离模式。手性分离基于氢键、π-π作用、形成包合物、离子作用和肽键等。

替考拉宁分子量为1885，结构中存在20个手性中心，3个糖基和4个环。酸性基团在多肽“杯”/ “裂层”的一端，碱性基团在它的另一端。酸性基团和碱性基团提供了离子作用点。糖基在三个平面上，可折叠起来将化合物分子包埋在多肽

“杯”中。

万古霉素分子量为1449，结构中存在18个手性中心，3个环。万古霉素具有“篮状”结构，它的附近还有一个可弯曲的糖平面，可将分析物分子包埋在“篮子”中。羧基和仲氨基分布在“篮子”的边缘，参与和分析物分子产生离子作用。万古霉素手性色谱柱可用于反相模式、正相模式和极性模式。万古霉素手性色谱柱可以分离胺类、中性酰胺、脂类。但对于酸性化合物选择性较低。在反相模式中，有机相常用四氢呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸缓冲液。色谱柱适用的pH 范围为4-7。通常优化碱性化合物手性分离条件时，选择pH=7 为起点比较好。另外四氢呋喃、乙腈有最好的选择性。有时采用纯的甲醇和乙醇作流动相也可达到好的分离效果。万古霉素手性色谱柱也可用正相模式，采用正己烷/乙醇为流动相。

万古霉素手性色谱柱载样量可以很大，非常适用于制备色谱。

6、蛋白质型：

蛋白质型手性色谱柱属于第5种类型。分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用。已经有多种蛋白质用于此类手性色谱柱。目前使用较多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵类粘蛋白（Ovomucoid，OV）。

α-酸性糖蛋白分子由181个氨基酸残基和40个唾液酸（sialic acid）残基构成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等电点为2.7。含有两个二硫键，性质很稳定。α-酸性糖蛋白分子可以共价键合到硅胶上，制成手性色谱柱，可以分离许多化合物。α-酸性糖蛋白手性色谱柱使用的流动相通常为pH 4-7的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。有机相首选异丙醇，如达不到分离要求，可以尝试乙腈，乙醇，甲醇或四氢呋喃。有机相的改变导致蛋白结构发生暂时的改变。色谱柱的负载量至关重要，典型的负载量为0.02mg/ml的浓度样品，进样20μl。pH 的改变对手性选择性起关键作用，尤其是胺类化合物。pH降低导致蛋白质负电荷的降低，引起胺类化合物保留时间减小，然而这意味着可以减小有机相比例，使选择性增加，峰形改善。

通过调节有机相比例仍无法达到分离效果时，有时需用电荷调节剂。但这可能引起蛋白结构的永久改变，这些电荷调节剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有时也用到1，2 亚乙基二醇，1，2丁醇和氯化钠。温度对分离也有影响，温度增加保留时间，减小分离因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量为69,000，等电点为4.8。蛋白中认为存在两个药物结合位点：华法令-氮杂普鲁帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮杂-吲哚（benzodiazapine-indole）结合位点。流动相中加入辛酸，采用人血清白蛋

白手性色谱柱可以有效分离benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分离，流动相组成为：100mM磷酸缓冲液pH7：乙腈：异丙醇= 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）为球型蛋白，分子量为66,000，等电点为4.7。此蛋白为一个单氨基酸链，通过17个二硫键形成9个双环。许多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到分离。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白稳定，一些有机溶剂（如乙腈、甲醇）可使蛋白变性，因此使用起来要特别注意。

卵类粘蛋白由蛋清中提取，分子量为55,000。它可分离大量的胺类和酸类化合物。

蛋白手性色谱柱的载样量均较小。影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。蛋白手性色谱柱在所有手性色谱柱中是应用最广的色谱柱，但并不是效果最好的色谱柱。

7、冠醚型：

冠醚类固定相用于分离一级胺，一级胺必须质子化方能达到分离。因此必须

使用酸性流动相，如高氯酸。最常用的是冠醚类固定相是18-冠-6，已有商品化产品，由Daicel公司制造。无论（+）或（-）型均可达到有效分离，并可通过变化（+）（-）类型而改变分析物出峰顺序。冠醚作为添加剂也用于核磁共振和电泳，但由于其毒性较大，有致癌性，使其应用受到限制。