泛素化蛋白检测办法
精心整理
泛素化蛋白检测方法
● 蛋白质泛素化简介
蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。
泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？
然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？
研究上述内容的实验方法和实验流程：
方法一：westernblotandstrip
通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】
方法二：westernblotandimmunoprecipitations
通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。
方法三：invitroubiquitinationassay
将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1，
A泛
。
SDS电
方法三：
invitroubiquitinationassay
(完整版)泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是 如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游
蛋白质泛素化与人类疾病发生的关系和研究进展
泛素化修饰与人类疾病 泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等组成，其对靶蛋白的降解是一种级联反应过程。泛素首先在El催化下，其C末端甘氨酸残基与El的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性。El-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体。最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3s。E3s可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2s形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε氨基基团上，形成异肽键(isopeptide bond)。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs从底物上水解下来，重复利用。 一、泛素(Ub) 泛素是1975年由Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞高度保守的多肽，单个泛素分子由76个氨基酸组成，分子量约8.5kD。在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小，如酵母和人的泛素仅有3个氨基酸序列的差别。泛素分子紧密折叠成球形，5股混合的β片
层形成一个腔样结构，部对角线位置有1个α螺旋，这个结构称为泛素折叠。这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C 末端延伸部分，这个末端第76位含有一个必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-末端第76位甘氨酸来连接的。 二、泛素活化酶(E1) El是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，但是对靶蛋白的特异性却几乎没有影响。El是一种广泛表达的多肽，大约1100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。El有2个亚型，是由同一个mRNA 在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。酵母的El 基因失活后是致命的，说明这个蛋白对于细胞的生存是至关重要的(Stephen等．1996)。El可以水解ATP，与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素。在真核生物这个激活反应由两步构成：起始形成泛素-腺苷酸中间物，接下来这个中间物与El半胱氨酸残基发生反应形成E1-Ub硫酯键。通常一个泛素分子有一个单独的E1。E1具有高度的催化效能，在低浓度的情况下就能够激活泛素，满足下游的级联反应过程(Pickart．2001)。 三、泛素结合酶(E2s) 级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。E2s在哺乳动物中至少有25个基因，所有的E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构
蛋白质泛素化研究进展—探索蛋白修饰的秘密
蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密 泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。 鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。 一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望 二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用
泛素化蛋白检测办法
精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1， A泛 。 SDS电
泛素化蛋白检测方法[精华]
泛素化蛋白检测方法[精华] 泛素化蛋白检测方法 , 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链(polyubiquitin chain)。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解;如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶(DUB)将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域(UBD)所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域(比如U-box或PHD结构域)的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 , 蛋白质泛素化的检测方法
研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点:哪些蛋白发生了泛素化;发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化;进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么,或者说这一过程中的E3酶是什么, 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应,对下游的信号通路有什么影响, 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一:western blot and strip 通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二:western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三:in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白 B(引起蛋白A泛素化的蛋白)，共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。 方法四:in vitro ubiquitin-binding assay
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？
泛素化蛋白检测方法样本
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样, 泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程, 它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽, 它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基, 因此它们之间也能够经过这些位点互相连接, 形成多泛素蛋白链( polyubiquitin chain) 。当前研究显示, 如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连, 会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解; 如果与被修饰蛋白上其它位点, 比如第63位赖氨酸残基相连, 则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样, 泛素化修饰途径也是可逆的, 即能够经过去泛素化酶( DUB) 将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后, 连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域( UBD) 所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD, 这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶, 它能够分
为两大类, 即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域( 比如U-box或PHD结构域) 的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点: 哪些蛋白发生了泛素化; 发生了泛素化的蛋白质, 具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化; 进行定量。 明确了上述几点后, 进一步需要弄清楚的是, 我们感兴趣的泛素化蛋白, 是如何发生泛素化的, 影响这一泛素化过程的关键分子是什么? 或者说这一过程中的E3酶是什么? 然后需要研究的是, 这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应? 对下游的信号通路有什么影响? 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一: western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带, 拍照后, 将膜strip。 然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应, 显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二: western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。
蛋白质的泛素化降解总结
仅作参考，如有抄袭，依法追究目录： 1.研究背景 2.泛素化降解途径 2.1泛素的基本结构 2.2泛素化的过程 2.3 E3酶对蛋白底物的识别 2.4 蛋白底物在26S蛋白酶体中的降解 3.研究的意义以及应用 4.研究展望
真核生物细胞中的蛋白质泛素化降解 摘要： 蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径,主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径。泛素系统广泛存在于真核生物中，是精细的特异性的蛋白质降解体系。泛素是一种序列保守的小分子蛋白质，蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体通过消耗ATP的方式降解。泛素系统由泛素、26S 蛋白酶体、多种酶（E1、E2、E3去泛素酶等）组成。其中E1和E2被称为泛素活化酶和泛素载体酶。泛素连接酶E3负责连接泛素与特异性底物，这样泛素化底物可以被26S蛋白酶体降解为若干肽段。泛素系统在真核生物中有非常重要的作用，通过降解蛋白质，调节细胞的分化、免疫，参与转录、分泌调控和细胞形成等，与人类的某些疾病有关。本文就泛素系统的组成、调控机制和研究进展做一介绍。 关键字：泛素系统；E3；26S蛋白酶体 正文： 1.研究背景 蛋白质在细胞内的降解是一个复杂的过程，但是又是一个高度有序的过程。真核生物中蛋白质的降解绝大多数都是由泛素系统完成。蛋白质首先是由泛素分子所特异性识别结合，在泛素分子的介导下，由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用，与26S蛋白酶体作用，被切割成多肽。多聚泛素链可以还原成单体，循环使用。泛素与细胞的多种生命活动有关，例如细胞生长发育过程中组织抑制因子的选择性降解；细胞周期中，周期蛋白选择性降解等。许多疾病和泛素化的过程有关，利用泛素系统治疗疾病也成为了热点。 2.泛素蛋白酶系统 2.1泛素的基本结构 泛素是一种热稳定性蛋白，含有76个氨基酸，相对分子质量8.6kDa。结构保守，如图一是人和酵母细胞中泛素分子序列比对，我们可以看到，只有三个氨基酸的差别。 图一人和酵母的泛素分子序列比对
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泛素化蛋白检测方法 LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应对下游的信号通路有什么影响
(完整版)泛素化蛋白检测办法
精心整理 泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一 样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitinchain ）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2 酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过
分子生物学---9蛋白质修饰(泛素化)
泛素化内稳态及信号 一：背景 1.细胞内蛋白酶解：80%-90%通过蛋白酶体降解，10%-20%通过自噬。 2．泛素： 由70个左右的氨基酸组成，本身有7个赖氨酸可被泛素化。细胞内广泛存在的一种蛋白。占细胞总蛋白1-2%，真核生物中高度保守。泛素内稳态取决于不断的改变。泛素化和去泛素化是一个动态平衡过程。 3．细胞内泛素化-蛋白酶体系统（U P S） （1）E3连接酶亚家族：
E3连接酶的功能影响细胞每个方面的活性，它的改变可以导致疾病。 （2）E3连接酶（大约600种）可以作为o n c o g e n e或者t u m o r s u p p r e s s o r （3）泛素信号：分类及功能
功能：细胞凋亡、D N A转录和修复、分化和生长、免疫应答和炎症，细胞表面受体和离子通道，血管新生，核糖体生物合成等等泛素信号异常：肿瘤、病毒感染、神经退行性疾病、发育畸形、细菌感染等。蛋白质降解受到抑制后，正常细胞会出现生长抑制，而肿瘤细胞则出现凋亡。 二、泛素内稳态及应激 1.细胞内泛素内稳态（老师上课说过这是可能的考点）
泛素内稳态：泛素合成 聚泛素链形成 聚泛素链组装 泛素降解 泛素应激：泛素增加、泛素减少 泛素减少：损害减数分裂、组织生长缺陷、突触发育及功能、胎儿肝脏发育细胞周期及耐逆性、增殖缺陷、扰乱造血系统、神经退化和代谢紊乱、细胞分化异常 泛素增加：延迟衰老、改变基因表达、热击的应答方式、促进细胞增殖和应激耐受、改变蛋白酶体构成、激活自噬 三、泛素信号和主要信号通路 1、N-e n d r u l e通路 泛素化蛋白酶体系统中最简单的规则：及蛋白质N端的特点决定蛋白质的半衰期，若N端为精氨酸或者赖氨酸的蛋白质寿命就很
泛素化蛋白检测办法
t o 精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活 性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有 7（位赖氨种E2酶、600的作用。结 构域的E3酶。这 两种E3● 的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路 有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程：方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的
特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1，UbeH13- SDS
泛素化蛋白检测方法修订稿
泛素化蛋白检测方法 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。
泛素化蛋白检测方法
泛素化蛋白检测方 法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也能够经过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。当前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即能够经过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重
要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它能够分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING 结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分