小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察
一、实验目的
a)通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌活动的观察,加深理解细胞吞噬
作用的过程；
b)了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法。
二、实验原理
吞噬作用是细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的固体物质（直径一般大于250nm）的过程。
吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。
许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。
三、实验仪器及试剂
a)材料：健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，一部分腹腔
注射4％淀粉肉汤1mL另一部分不注射，大肠杆菌悬液。
b)试剂:4%淀粉肉汤，D-Hanks液，0.85％生理盐水，180IU/mL肝素钠生理
盐水溶液
c)普通光学显微镜、 10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃），5mL
一次性注射器、 10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等
四、实验步骤
a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小
鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开
腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b)体外吞噬。在两支10mL玻璃离心管分别加入0.3mL注射淀粉肉汤的腹腔
液+0.3mL大肠杆菌悬液和0.3mL不注射淀粉肉汤的腹腔液+0.3mL大肠杆
菌悬液，放在37℃水浴锅中吞噬。
c)制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临
时装片，观察现象并作图。
d)在0min和45min时在两管中分别取两滴混合液滴于载玻片上，用次甲基
蓝染色5分钟后装片观察。
五、实验结果
a)0min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片（次甲基蓝染色）
由图知，注射淀粉肉汤的巨噬细胞的数量较多。
b)15min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片
c)30min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片
d)45min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片（染色）
六、实验分析
由实验的所得图中可以知道，注射肉汤的巨噬细胞的数量较多。从0-45min，本应该看到巨噬细胞吞噬大肠杆菌的一个过程，但是可能是大肠杆菌的体积太小，或者是有两个时间段未进行染色，所以我觉得看的不是非常清楚。可能换成鸡血细胞会更加清楚。
七、注意事项
a)注射时注意不要注入皮下或将针头插进小鼠内脏。
b)抽取腹腔液时应从空隙处抽，放止针头被堵。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。 【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定 0.引言 巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。 1.材料与方法 1.1实验对象 清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。 1.2实验方法 1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养 随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。 1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定 （1）台盼蓝染色计算存活率。 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）；
实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察
实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名：李思露 学号：131140040 一、实验目的 1.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察,加深理解细胞吞噬作用的过程； 2.了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法 二、实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用（cellular eating），指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质（直径一般大于250mm）的过程。许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 内吞 内吞体 吞噬溶酶体 胞吐 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率＝吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100％
吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 （一）材料： 1.健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL。 2.抗凝鸡血 （二）试剂: 1.4%淀粉肉汤 2.D-Hanks液 3.0.85％生理盐水 4.180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 （三）用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1.巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤， 暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2.体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液，37℃吞噬。 3.制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临时装片，观 察现象并作图。 五、实验结果 图1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞装片（不染色） 0min15min30min45min 时 间 现 象 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物： 6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃ 250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至 5×106cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 一、实验目的 a)通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌活动的观察,加深理解细胞吞噬 作用的过程； b)了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法。 二、实验原理 吞噬作用是细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的固体物质（直径一般大于250nm）的过程。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 许多原生动物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。 三、实验仪器及试剂 a)材料：健康小白鼠：6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，一部分腹腔 注射4％淀粉肉汤1mL另一部分不注射，大肠杆菌悬液。 b)试剂:4%淀粉肉汤，D-Hanks液，0.85％生理盐水，180IU/mL肝素钠生理 盐水溶液 c)普通光学显微镜、 10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37℃），5mL 一次性注射器、 10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验步骤 a)巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小 鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开 腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 b)体外吞噬。在两支10mL玻璃离心管分别加入0.3mL注射淀粉肉汤的腹腔 液+0.3mL大肠杆菌悬液和0.3mL不注射淀粉肉汤的腹腔液+0.3mL大肠杆 菌悬液，放在37℃水浴锅中吞噬。 c)制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min 制备细胞混合液临 时装片，观察现象并作图。 d)在0min和45min时在两管中分别取两滴混合液滴于载玻片上，用次甲基 蓝染色5分钟后装片观察。 五、实验结果 a)0min时注射肉汤（左）与未注射肉汤（右）图片（次甲基蓝染色）
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013
细胞工程综合实验报告 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 班级 xxxx 姓名 xxxx 学号 xxxxxxxxxx 指导教师 xxxx 实验时间 xxxx 成绩
小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养 姓名学号班级 一、实验目的 1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。 2.初步掌握培养过程中的无菌技术。 3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培
小鼠巨噬细胞功能的检测
小鼠巨噬细胞功能的检测 伍国强 （兰州大学草业学院兰州730020） 摘要：本实验用CFA免疫小鼠后，检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。 关键词：巨噬细胞；功能；检测 1 前言 巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有：（1）吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用。（2）抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR 识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC)。此外，巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号。（3）抗肿瘤作用：Mφ被某些细胞因子如IFN-γ激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高。（4）分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如 IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能，我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。 2 材料与方法 2．1 材料 2．1．1 药品：生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。 2．1．2 仪器：血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。 2．1．3 动物：小白鼠2只，由兰大医学院动物实验中心提供。 2.2、方法 2．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞制备取小白鼠2只，分为对照组和实验组，对照组注射0.1ml生理盐水，试验组注射0.1mlcFA。48小时后，小鼠眼眶放血，断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管（冰浴）。1600rpm离心10 分钟，弃上清，4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水调mΦ浓度为1×106，取4ml 1600rpm 离心10分钟，弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加入24孔板，每组4孔，每孔1ml。37℃，5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。2．2．2 巨噬细胞吞噬中性红试验将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液，对照孔加0.5ml生理盐水，其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。 3 结果与讨论表：mΦ的浓度及吸光值 mΦ细胞个数mΦ浓度 （个/ml) 0D值 对照组256 6.4×105 0.252 试验组2176 5.44×106 0.283 3．1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度从上表可以看出，用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用
酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。 4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。 三、结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。 注意
小鼠巨噬细胞试验
一、小鼠巨噬细胞分离培养 小鼠脱颈处死，浸入75%酒精中5min后，于腹中线处剪开皮肤，暴露腹壁肌肉，用酒精消毒腹膜壁，用无菌注射器将PBS或无血清DMEM培养液5ml 注入腹腔，仰卧平放并轻柔小鼠腹部2~3min，静置5min后，使动物体倾向一侧，用注射器抽取腹腔液约4~4.5ml，1500rpm离心8min，去上清，用含10%小牛血清的DMEM培养液进行细胞计数，调整细胞浓度为lx10∧6个/ml(取出一滴细胞悬液经台盼蓝染色，细胞存活率大于99%)，5ml/瓶接种于25cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，2-3小时后更换培养液除去未贴壁细胞，贴壁细胞则为腹腔巨噬细胞。 注：巨噬细胞不增殖，不传代，能培养存活2-3周，细胞形态基本不变，细胞贴壁成不规则形状。 二、细胞计数 1.制备细胞悬浮液，用DMEM培养基进行计数 2.准备记数板：用蒸馏水冲洗，擦镜纸擦拭，再用酒精擦净，2-3次 3.加样 4.计数：用台盼蓝染色计数。 细胞悬液细胞数/ml=4个大方格总数/4×10∧4，如计算前已稀释再乘稀释倍数 三、药物配制 将挥发油配成64mg/ml母液，用DMSO助溶，用无血清DMEM培养液稀释，使其终浓度为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml。 四、挥发油对细胞毒性检测 将浓度为1×10∧6个/ml的细胞悬液1ml/孔接种于16孔板中，置培养箱中培养，24h后加入不同浓度的挥发油，同时设DMSO对照、空白对照及空白调零孔。培养24h后弃培养液，每孔加入ml无血清培养液和20ulMTT(5mg/ml)液，继续培养4h，然后弃培养液每孔加入 150ulDMSO，微量振荡器振荡10min后，采用酶标仪测定其在570nm波长的吸光度(A值)，并用下列公式计算细胞的存活率: 药物组A值均数 细胞存活率(%)= x100 空白组A值均数 五、细胞炎症模型建立 为建立体外细胞炎症模型，确定后续实验中LPS刺激巨噬细胞的时间和浓度，对LPs刺激巨噬细胞的时效与量效关系进行了研究。采用ELISA或RT-PCR测定小鼠腹腔巨噬细胞上清液中TNF-a含量来研究时效与量效关系。 时效关系：培养24h后的细胞分组加药：空白组（完全培养液）、LPS 1h组（终浓度为1ug/ml）、LPS 3h组（1ug/ml）、LPS 6h组（1ug/ml）、LPS 12h组（1ug/ml），分别在规定时间终止培养，弃去培养液。用ELISA法，450nm测TNF-a含量。量效关系：方法同上，分6组LPS浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10ug/ml
实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察教案资料
实验 6 小鼠腹腔 巨噬 细胞吞噬现象观察
实验6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象观察 姓名：李思露 学号：131140040 实验目的 1. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过 程； 2. 了解巨噬细胞吞噬能力检测的形态学方法实验原理 吞噬作用也称为胞吞作用( cellular eating),指细胞通过质膜内陷形成内吞泡的方式吞入不能渗透过膜的较大固体物质(直径一般大于250mm)的过程。许多原生动 物通过吞噬作用摄取营养；高等动物体内的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用成为动物体非特异性免疫的重要组成部分。不同动物来源的巨噬细胞或同一动物来源的不同巨噬细胞吞噬功能强弱不同，个体吞噬细胞的平均吞噬能力是机体非特异性免疫功能强弱的重要反映。 吞噬细胞细胞膜上有识别某些病原体相关分子及凋亡细胞磷脂酰丝氨酸等配体的受体，可以使巨噬细胞识别结合病原体、凋亡细胞及其它异物，引起受体胞内区活化，进而导致与其相连的细胞骨架重排引发吞噬作用。 ck griuk'd maR-rtal 巨噬细胞吞噬自身衰老凋亡细胞而不吞噬正常细胞，原因是，凋亡细胞细胞膜内侧面的磷脂酰丝氨酸反转到胞膜外侧面而被巨噬细胞模式识别受体识别。 吞噬功能一般用吞噬百分率和吞噬指数两个指标反映。 吞噬百分率=吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数x 100 %
吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数 三、实验材料、试剂及器材 （一）材料: 6-8周龄健康小白鼠，实验前1~2天，每只腹腔注射4%淀粉肉汤 1. 健康小白鼠: 1mL。 2. 抗凝鸡血 （二）试剂： 1. 4漩粉肉汤 2. D-Hanks 液 3. 0.85 %生理盐水 4. 180IU/mL肝素钠生理盐水溶液 （三）用品 普通光学显微镜、10mL低速离心机、托盘天平、水浴箱（37C）、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管等 四、实验操作 1. 巨噬细胞收集：脱颈处死小鼠；腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴 露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。 2. 体外吞噬。0.3mL腹腔液+0.3mL鸡红细胞悬液，37C吞噬。 3. 制片及观察。分别在0min、15min、30min、45min制备细胞混合液临时装片，观 察现象并作图。 五、实验结果 巨噬细胞吞噬物的变化亦具有与时间相关的特点，巨噬细胞吞噬物在形态上易于观察和检测，这些特征使得巨噬细胞在损伤时间推断过程中具有重要的法医学意义。 六、作业与思考题
巨噬细胞吞噬实验&沉淀实验实验报告
实验二 一巨噬细胞吞噬功能实验 【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。【方法】体内法： （1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。（2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴0.03%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。 （4）高倍镜下进行观察，计数。 【结果】 【分析】 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 二沉淀反应双向琼脂扩散实验
【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，二者均可发生扩散，并且随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验，常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。 【方法】 （1）制板：将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml （2）打孔：待琼脂凝固后，将载玻片置于打孔样板上，用打孔器打孔 （3）加样：在中央孔内加抗体，上下两孔加抗原1，左右加抗原二，每孔加10μl （4）结果观察：将琼脂板置于湿盒，37℃一天后观察结果。 【结果】 在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。【分析】抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。 琼脂铺板时要一次铺成，并且铺设均匀。 打孔时要注意垂直打孔，注意不要有裂隙产生。
小鼠腹腔巨噬细胞准备
peritoneal macrophage cell preparation 1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上； 2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜； 3. 10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液； 4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛血清悬起细胞，2×106细胞/ ml. 5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二次，留下贴壁细胞； 6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。 注: 1.雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集； 2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液； 3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁； 4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育，但大多不理想，故细胞分离后应用台盼兰染色检测活力； 5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，灭菌后使用，较为实用；
6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，4天后同法集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。 小鼠腹腔巨噬细胞提取的经验方法总结如下： 第一： 用刺激物质的方法，一般都是在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠（应该现配现用，否则效果较差）每只2ML。实验当天将小鼠断头处死，置于1%的新洁尔灭或者75%的乙醇溶液中浸泡2—3MIN，消毒皮肤。于无菌环境下向腹腔注入HANKS液8ML，用手轻轻挤压腹壁20次以上，吸出灌洗液。将灌洗液离心2000R/MIN，5MIN，弃去上清，用HANKS洗涤3次，合并小鼠细胞，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，记数，调整腹腔细胞浓度为 2*10*6/ML，将腹腔细胞加入24孔培养板中，1ML/孔，于37摄氏度，5%CO2培养箱中培养3–4小时，使巨噬细胞贴壁，取出培养板，弃去上清夜，用HANKS也反复吹洗培养孔3遍，除去非粘附细胞，即为巨噬细胞单层.（炎性巨噬细胞，即激活的巨噬细胞） 第二种： 不加刺激物质的提取方法： 1实验结束后，拉颈处死小鼠，用75%酒精消毒。 2用带9号针头的5ML注射器腹腔注入含75%小牛血清的HANKS液 （5%NBS—HBSS）轻柔腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞0，反复抽吸几次。 3 1500 R/MIN离心8MIN，用5%NBS—HBSS洗2次。 4将腹腔细胞用含10%小牛血清1640液（10%NBS—1640）配成2*10#6/ML 加到24孔平底培养板中，1ML/孔，5% CO2温箱孵育2H 5每孔用5%NBS—HBSS洗3次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为巨噬细胞单层
巨噬细胞提取方法
我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中； (2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜； (3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液； (4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。 (5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h； (6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。 按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取 实验动物：6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。 试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml) 步骤： 1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。 2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。 3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS 5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。 4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。再用75%酒精擦洗腹壁。 5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。小心拔出针头。把液体注入50ml离心管中。再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。合并渗出液于50 mL离心管中。直至冲洗液变澄清。 6、4℃250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。 8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。将调整细胞浓度调整至5×106 cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。 种96孔板。2h细胞贴壁。换液。墨汁（时间短，可以不灭菌）染色。观察。
RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol
ＲAW２６4、７细胞株得相关信息
ATCC：美国模式培养物集存库(Aｍｅrican tｙｐe ｃulｔure cｏllｅcｔion)得简写 收到冷冻管细胞得处理方式 1、收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形, 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后，移到液氮)。 2、收到T25 flask细胞得处理方式 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡,Ｔ２5 fｌasｋ均加满培养基。 ２、1、检查flａsk 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 ２、２、将原封之Ｔ25 fｌask 静置于３７℃, 5% CO２培养箱中,使细胞回温至３7℃，并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长. ２、3、隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，（取出之培养基可以再使用）,
仅留约5—10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。 ＲAW2６4、7细胞株得ＣelｌCuｌｔure 一、RAW２64、7细胞培养得特点 1、RＡW2６4、7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。贴壁特别牢固。
２、RＡW264、7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。 3、每次传代都很难消化下来.用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形，并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。 ４、对于ＲAW264、7细胞她得声场时喜欢结伴。正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接，等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层。所以,要很好地控制好细胞得生长速度，不要等到叠加成层得时候再传代。 ５、RAW２６4、7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类得．这个时候就就是提醒您注意传代了,这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉． 二、RＡＷ2６4、7细胞传代
RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol.pdf
RAW264.7细胞株的相关信息
ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写 收到冷冻管细胞的处理方式 1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。 2. 收到T25 flask细胞的处理方式 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。 2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。
2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。 RAW264.7细胞株的Cell Culture 一、RAW264.7细胞培养的特点 1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。贴壁特别牢固。
2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。 3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。 4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。 5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。 二、RAW264.7细胞传代
小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察
小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察 一、实验目的 1. 学习小鼠腹腔巨噬细胞的制备技术； 2. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬蟾蜍红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过 程及其意义； 3.掌握小鼠腹腔注射给药及脊椎脱臼处死方法。 二、实验器材 显微镜，注射器，盖玻片，载玻片，滴管，试管，烧杯，离心机，离心管 三、试剂 1. 任氏液： Nacl 6.5g KCl 0.14g Cacl2 0.12g NaH2PO4 0.01g NaHCO3 0.20g 蒸馏水 1000ml 2. 阿氏液（红细胞保存液）： 葡萄糖 2.05g 柠檬酸钠 0.89g 柠檬酸 0.05g NaCl0.42g 蒸馏水 100ml 调pH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min,置4℃冰箱保存。 3. 4%台盼蓝染液： 台盼蓝 4g NaCl 0.9g 蒸馏水 100ml 4．6%淀粉肉汤： 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g NaCl0.5g 蒸馏水 100ml 加入可溶性淀粉6.0g，加热促使溶解，再煮沸灭菌，置4℃冰箱保存，使用时以水浴融化，加入适量4%台盼蓝染液混匀。 5. PBS溶液 6. 3%NaHCO3溶液 四、生物材料 1．小鼠（体重20g左右）； 2．1%蟾蜍红细胞悬液：采用穿刺法处死蟾蜍后，迅速从心脏采血1ml,放入盛有4ml 阿氏液的瓶中，混匀置4℃冰箱保存备用，使用前加入任氏液离心（1500rpm,10min）
洗涤两次，再用任氏液配成浓度为1%的细胞悬液。 五、实验步骤 1. 先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上（或放在篮子里，方便固定），用左手的拇指和 食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部1/2处的一侧注射。 2. 实验时，取一只小鼠，腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。（一定要刺破腹腔，不能注射 到皮下）另一只小鼠，先腹腔注射1ml淀粉台盼蓝溶液，再腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。 3.20-30分钟后，用CO2麻醉后再以颈部脱臼法处死小鼠。 4.以酒精棉球润湿小鼠腹部的表皮。用镊子提起表皮，用剪子剪一个“T”型切口 5.用5ml注射器，向小鼠的腹腔内注射4ml PBS溶液。 6.轻揉小鼠腹部几分钟，使悬液分散。 7.将小鼠的腹膜切开一个小口，用吸管吸出腹腔渗出液，置于试管中。 8.用4% NaHCO3溶液调渗出液的PH值至7.2-7.4。（半滴/ml，边加边晃动试管） 9.吸取少量细胞悬液制成装片，观察巨噬细胞吞噬蟾蜍（鸡）红细胞的过程。 六、实验结果 (1)巨噬细胞开始吞噬蟾蜍红细胞 蟾蜍红细胞 巨噬细胞 图1 巨噬细胞紧附于蟾蜍红细胞，开始吞噬
小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
巨噬细胞吞噬现象的观察 杨遂群* 马晓红杨薇黄文强安小宁陆祖宁安绍芳 实验目的 1．了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理 2．熟悉细胞吞噬作用的基本过程 实验原理 在高等动物中，单核吞噬细胞系统和嗜中性粒细胞专司吞噬功能，在细胞的非特异性免疫功能中发挥重要作用。单核吞噬系统包括血液中的单核细胞和组织中固定和游走的巨噬细胞。 但静息的巨噬细胞其分泌和杀伤功能低下，受到病原微生物或炎症因子的刺激时，巨噬细胞成为激发或致敏状态，分泌能力得以增强，但杀伤功能仍然很低。只有活化的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力，具有非特异抗感染和抗肿瘤作用。 大吞噬细胞：来源：单核巨噬细胞 存在部位：血液（单核细胞)、全身结缔组织及小血管的基底膜组织（巨噬细胞） 功能：吞噬病原微生物（寄生虫等），死亡细胞。 小吞噬细胞：来源：中性粒细胞 存在部位：血液、炎症部位（全身） 功能：主要吞噬化脓菌 实验用品 1．器材 显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水纸 2．试剂 生理盐水、Alsever溶液、瑞士染液 3．材料 小白鼠、1%鸡血红细胞。 实验步骤 1、实验前3天取小白鼠腹腔注射6％淀粉液1毫升（连续注射三天效果较好）。 2、小鼠腹腔注射1％的鸡红细胞悬液2ml，轻揉腹部使鸡细胞分散。 3、25～30分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠。并腹腔注射生理盐水2毫升； 4、在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴腹腔液，静置10分钟，腹腔巨噬细胞贴壁，弃去生理盐水，待其标本稍干后瑞氏染液染色。 5、.瑞氏染色：滴加3~4滴瑞氏染液于标本上，以完全盖住标本为宜。 6、分钟后甩去玻片上的染液，自来水轻洗，吸水纸吸干。 干燥后油镜镜检 7、清洗油镜，解剖盘及器具，打扫桌面卫生、实验室卫生，老鼠尸体要掩埋！ 实验报告 画图示出你所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬羊红细胞的各种形态。 思考题 1、在高等动物中哪些细胞具有吞噬功能？ 2、在什么情况下巨噬细胞吞噬功能加强？
小鼠肠巨噬细胞使用说明
小鼠肠巨噬细胞 小鼠肠巨噬细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肠巨噬细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肠巨噬细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肠巨噬细胞产品简介： 产品名称：小鼠肠巨噬细胞 组织来源：小鼠肠组织 产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠肠巨噬细胞细胞简介： 巨噬细胞功能及其在疾病发生过程中的作用是目前研究的热点问题之一。肺巨噬细胞的吞噬、免疫和分泌作用都十分活跃，有重要防御功能。肠是重要的巨噬细胞储存器官，为结核病的研究提供了重要的材料。 本公司生产的小鼠肠巨噬细胞采用机械研磨贴壁法制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠腹腔巨噬细胞的获取
小鼠腹腔巨噬细胞的获取 1材料准备 好血清56℃灭活1h，完全冷却后1000rpm/5min，然后0.22μm滤膜过滤，配含10%不含双抗的灭活FBS血清的1640培养基，另外再配含有双抗的完全培养基。 泡沫板，小注射器6个，10mL注射器几个，无菌剪刀、镊子。提前预冷的未加双抗的1640培养基。加了双抗的完全培养基37℃预热。50mL管几个。无菌PBS，台盼兰，75%酒精。 C57BL/6小鼠8-12周。 Corning极低吸附培养板，细胞不能黏附，或者用0.25%胰酶 +0.02%EDTA。用Hanks液终止胰酶和EDTA消化。 2实验步骤 1）拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2min，移入超净台，把小鼠放到泡沫板上，用枕头固定四肢，用镊子和剪刀剪开皮肤，露出 腹膜，但勿伤及腹膜壁。注意：在处死老鼠时，如果腹腔内有 血，则这只老鼠不能用，容易有血细胞污染。 2）用10mL注射器吸取提前预冷的无双抗的164010mL，换小针头注射到腹腔中，同时从两侧用手指按压腹膜壁2-5min，使液体在腹 腔内充分流动。然后放置20-25min。提前预冷离心机到4℃。 3）轻轻拔出针头，然后从侧壁吸出培养基，注意不要吸到体内器官。然后再注射5mL的培养基，按压1min，停滞5min，吸出到 提前预冷的50mL的离心管中。 4）500g/8min，然后用无双抗的培养基洗一次，500g/8min，弃去上清液，然后用预热的完全培养基重悬。 5）台盼兰计数，很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。如果是96孔板，一般是2X10^5个/mL，如果 温箱孵育2-4h，用提前预热的是6孔板，200w个/mL，5%CO 2 1640洗1-2次，然后换液，洗去未贴壁细胞，贴壁细胞则为单层 的巨噬细胞。 3实验结果 巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪 足，铺开呈三角形或多角形。 4注意事项 1)巨噬细胞使终末分化细胞，不会增殖。在条件适宜下可存活2-3 周，多用原代培养。每只小鼠可产生200-300w个细胞，其中90% 为巨噬细胞。培养细胞对低温的耐受力比高温强。 2)很难消化下来。 3)避免交叉感染，每只小鼠换一个注射器。 4)严格无菌操作。 5)吸取细胞悬液时，尽量不要吸到大小肠，容易造成成纤维细胞感 染。 6)巨噬细胞的marker：CD14,CD11b（MAC1），CD68(需要破膜，胞内 细胞因子染色，不仅表达在巨噬细胞上，也表达在淋巴细胞，成