酶联免疫吸附试验

实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）

一、实验目的

了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。

二、实验原理

将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。

常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色

辣根过氧化物酶（HRP）

RZ>3.1

碱性磷酸酶（AP）

邻苯二胺（OPD）

四甲基联苯胺（TMB）

对硝基苯磷酸酯（p-NPP）

橙黄色

蓝色

黄色

棕黄色

黄色

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型：

1、间接法测抗体（间接ELISA）

间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）

双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。

3、竞争ELISA

竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。

三、主要仪器及试材

以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。

使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含:

1、包被抗原的微孔板；

2、阴、阳性对照血清；

3、抗猪IgG-HRP结合物；

4、洗涤液；

5、底物A液、B液；

6、终止液；

7、样品稀释液

本实验所需仪器和试剂：

1、酶联免疫测定仪

2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）

3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清

4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP

5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO

3，2.93g NaHCO

，加

ddH

O至1000mL

6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g

2HPO

·12H

O，0.2g KH

，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH

O至1000mL。

7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL

8、底物液（TMB-H2O2）：

磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na

2HPO

，24.3mL 0.1mol/L 柠

檬酸液，加50mL ddH

O。

TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。

底物液（TMB）：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物

液加入0.2μL 30% H

2。

9、终止液：0.25% 氢氟酸

四、实验方法与步骤

（一）试剂配制

1、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO

3，2.93g NaHCO

，加

ddH

O至1000mL

2、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g

2HPO

·12H

O，0.2g KH

，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH

O至1000mL。

3、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL。

4、底物液（TMB-H2O2）：

磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na

HPO

，24.3mL 0.1mol/L 柠

檬酸液，加50mL ddH

O。

TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。

底物液（TMB）：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物

液加入0.2μL 30% H

2。

5、终止液：0.25% 氢氟酸

（二）实验步骤

1、取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl 稀释液（PBS）。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育20－30分钟。

2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，每次2－3分钟，200μl/孔，每次在干净吸水纸上拍干。

3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育20－30分钟。

4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。

5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟

后，每孔加终止液（0.25% 氢氟酸）1滴(50μl)，终止反应。

6、15分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.4为阳性。

五、实验注意事项

1、实验前血清样品必须置37℃灭活30分钟。

2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。

3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。

六、实验结果处理

以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD

630值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD

630

值

大于或等于1.0，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.2。

样品OD

630

值大于0.4，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.40之间，判为可疑；样品

630

值小于0.38，判为阴性。

七、思考题

1、间接酶联免疫吸附试验的原理。

2、鉴别诊断基本原理及其意义。

3、间接酶联免疫吸附试验检测的临床意义。

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

酶联免疫吸附试验

实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP） RZ>3.1 碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型： 1、间接法测抗体（间接ELISA）

间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。 2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。 3、竞争ELISA 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。三、主要仪器及试材以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含: 1、包被抗原的微孔板； 2、阴、阳性对照血清； 3、抗猪IgG-HRP结合物； 4、洗涤液； 5、底物A液、B液； 6、终止液； 7、样品稀释液本实验所需仪器和试剂： 1、酶联免疫测定仪 2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白） 3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清 4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP 5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO 3，2.93g NaHCO 3 ，加 ddH 2 O至1000mL 6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na 2HPO 4 ·12H 2 O，0.2g KH 2 PO 4 ，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH 2 O至1000mL。 7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL

酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/217673948.html, 酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项作者：任小龑来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。关键词：酶联免疫;吸附试验;满版实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。一、移液枪的使用我院免疫实验室常用手动单道移液器。注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。二、加样

酶联免疫吸附实验ELISA操作规则(新手适用)资料

酶联免疫吸附实验ELISA －－操作规则（新手适用）一、实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。二、实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的

ELISA(酶联免疫吸附测定)实验报告

ELISA Lin Chengyu Bio 04 2010030007 Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-21 1Introduction 1.1Background information ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodies employing ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays. This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative or quantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplification processes, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification.1 1.2Major principles Figure 1 Schematic diagram of ELISA2 Figure 2 Procedure of indirect ELISA3

elisa酶联免疫吸附实验报告材料

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为

ELISA酶联免疫吸附试验报告

大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：

一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料 BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H 2SO 4 。

三．实验方法 1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。第二天取出，用PBS洗涤3-4次。 2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。 3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。 4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H 2SO 4 终止反应。 5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。四．实验结果表1 酶联免疫吸附OD值检测表目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。

酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附实验一、实验目的 1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。 2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。 3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。 4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。二、实验原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。三、实验试剂与器材 1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M B OTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水

酶联免疫吸附试验及其应用

酶联免疫吸附试验及其应用作者：鲍行豪一、前言近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。

酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理与结果解释

酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与结果解释基本原理：一、包被 1、固相载体的要求（1）、结合抗体或抗原的容量大（2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面（3）、不影响免疫反应性（4）、利于反应充分进行（5）、固相方法简便易行，快速经济 2、固相载体的材料：聚笨乙烯 3、包被coating 将抗原或抗体结合于固相载体。 4、封闭blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。二、反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。标记酶的要求： (1)、活性高 (2)、性质稳定 (3)、专一性强 (4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5)、方法敏感，重复性好，简单易行 (6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉常用酶辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶）三、洗涤

使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。四、底物显色 HRP DH2+H2O2—————→D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。常用底物：四甲基联苯胺TMB 四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。常用方法与原理一、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等二、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似双抗体夹心法应用：乙型肝炎表面抗体

酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理

更新时间：2004-12-210:30:00 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定加入酶反应的底物后，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的

单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA 提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。（四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明

酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。（2）研究抗酶抗体的合成。（3）显现微量的免疫沉淀反应。（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。

四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。注意事项 1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。

酶联免疫吸附剂测定ELISA实验报告及实验感想

ELISA实验报告 ●实验名称酶联免疫吸附剂测定（enzyme－linked immunosorbent assay，简称ELISA） ●实验原理 ELISA是一种在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。此次实验采用间接法，是检测抗体最常用的方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 ●实验试剂及器材 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 4. 包被液： 0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO30.15克, NaHCO30.293克，蒸馏水稀释至100 毫升。 5. 稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8克,

KCl 0.2克， KH 2PO 4 0.2克, Na 2HPO 4 ·12H 2 O 2.9g, 6. Tween-20，0.5ml，蒸馏水加至1000ml。 7. 洗涤液：同稀释液。 8. 封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。 9. 邻苯二胺溶液(底物)：配制：0.1mol/L 柠檬酸(2.1克/100毫升)，取6.1ml， 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163克/100毫升)，取6.4ml, 加蒸馏水12.5ml, 取邻苯二胺8mg（溶解）；临用前加30 % （体积分数）H2O240 微升。 10. 终止液：2 mol/L H2SO4。 ●实验步骤 1.向培养板中加入经过包被液稀释的抗原，每孔加200微升, 37 ℃温育30min。 2.倒尽板孔中液体，加200微升洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3.加封闭液200微升，37 ℃温育半小时。 4.洗涤同步骤2。 5.用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。同时作稀释液对照。 37 ℃温育一小时。 6.洗涤同步骤2。 7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 37 ℃温育半小时。 8.洗涤同步骤2。 9.加底物：邻苯二胺溶液加200微升，等待5分钟。 10.加终止液：每孔50微升。 11.观察结果，用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。 ●实验结果数据如下所示：

elisa酶联免疫吸附实验报告

e l i s a酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit

酶联免疫吸附实验汇总

ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的应用简介随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

特性用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。辣根过氧化物酶过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，

酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附试验ELISA 一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体

由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 1.辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。

酶联免疫吸附测定的操作要点

酶联免疫吸附测定试验（ELISA）的操作要点 1标本的收集和保存（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色，从而产生非特异性发应。（2）样本的采集及血清分离中要注意尽是避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。（3）血清标本宜在新鲜时检测，放置时间过长均可产生假阳性反应，如在冰箱中保存过久，可发生聚合，在间接法中可使本底加深。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2-8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。（4）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应充分混匀、轻缓、避免气泡，可上下颠倒混合，不要在混匀器上强烈振荡。（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可以加入适当防腐剂。 2试剂的准备（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了缩短升温时间，使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。（2）目前的ELISA试剂盒中的洗涤液均需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。（3）当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 3加样本及反应试剂在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物。