呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒
呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书
（中文版）
主要用途
呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染
色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在线粒体氧化条件下，选择性阻止膜电位，所产生的荧光，来定量检测线粒体内膜电位依赖性活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于线粒体功能、氧化激发和抑制机理等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定线粒体活性氧族的浓度。三氟甲氧基苯腙羧基氰化物（carbonyl cyanide 4-trifluoromethoxy henylhydrazone；FCCP）使线粒体膜化学离子梯度消失。
产品内容
缓冲液（Reagent A）毫升
选择液（Reagent B）微升
补充液（Reagent C）毫升
染色液（Reagent D）微升
产品说明书1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，染色液（Reagent D），严格避免光照；有效保证12月
用户自备
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光线粒体
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于测定线粒体荧光强度
1
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂放进冰槽里融化，避免光照；同时从－80℃冰箱里取出待测的线粒体，放进冰槽里融化。然后进行下列操作。
1．准备1个96孔板，标记好背景对照孔和待测样品孔
2．分别加入xx微升缓冲液（Reagent A）
3．分别加入xx微升选择液（Reagent B）
4．移取xx微升线粒体悬液（总量为50微克线粒体蛋白）到96孔板的相应待测样品孔里
5．加入xx微升补充液（Reagent C）到96孔板的相应背景对照孔里
6．分别加入xx微升染色液（Reagent D）到上述孔里
7．放进37℃恒温水槽孵育15分钟，避免光照
8．选择下列方式之一进行操作：
a)使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10微升上述悬液到载波片上，盖上盖玻片
2）激发波长490nm，散发波长530nm――
绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高
b)或使用荧光分光光度或荧光酶标仪检测（定量检测）：
1）直接放进荧光酶标仪：激发波长490nm，散发波长530nm――
样品RFU－对照RFU＝实际线粒体RFU：增高，表明活性氧族（ROS）含量高
注意事项
1．本产品为20次操作
2．操作时，须戴手套
3．孵育时，须避免光照
4．建议染色完成后，即刻进行荧光分析
5．本公司提供膜电位依赖性活性氧检测试剂产品
6．本公司提供系列活性氧检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定荧光清晰
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC0200规格:50T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。产品说明： CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。 H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200w，超声3秒，间隔10秒。重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作 1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至240nm 处，蒸馏水调零。 2、CAT 检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml 试剂一，充分混匀，作为工作液； 用不完的试剂4℃保存一周。 3、测定前将CAT 检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。 4、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 样本，混匀5s；室温下立即测定240nm 下的 初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。计算ΔA=A1-A2。三、CAT 活性计算： 1、血清（浆）CAT 活力的计算： 单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=678×ΔA 2、组织、细菌或细胞中CAT 活力计算：（1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（V 样×Cpr）÷T=678×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g 组织在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W×V 样÷V 样总）÷T=678×ΔA÷W 3、按细菌或细胞中CAT 活力计算： 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol H 2O 2降解定义为一个酶活力单位。CAT（U/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=1.356×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.035×10-3L；ε:H 2O 2摩尔吸光系数，4.36×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.035mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min。 W：样本鲜重，g； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；
氧化应激与慢性阻塞性肺疾病
!!作者单位! C %""Q "广州中山大学第一附属医院呼吸内科通信作者!曾!勉氧化应激与慢性阻塞性肺疾病 刘凌云!曾!勉 !!慢性阻塞性肺疾病"<=>?#是一种具有气流受限特征的疾病$气流受限不完全可逆%呈进行性发展$与肺部对有害气体或颗粒的异常炎症反应有 关&%’(目前对<=>?的发病机制仍未完全阐明$ 氧化应激在<=>?发生机制中的作用日益受到重视(氧化应激不仅直接损伤肺组织$而且可使抗蛋白酶氧化失活%炎症细胞渗出%炎前介质基因表达$从而促进<=>?的发生发展(<=>?患者糖皮质激素治疗的抗炎效果远较哮喘的疗效要差$其糖皮质激素抵抗的机制尚不清楚$多数认为与氧化应激水平增加有关(在此$就以上内容的新进展作一综述(?!氧化剂的来源?@?!吸烟及空气污染!香烟的烟雾和焦油中包含#A ""多种化学物质$ 其中各种自由基和氧化产物浓度较高(估计每口香烟烟雾中含有%"%A 个自由基$香烟焦油中则含有更多各种稳定的自由基(此外$在支气管上皮内衬液";Z M #中形成的烟雾凝集物"
细胞氧化应激基本概念讲解
1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有95%是来自于线粒体，其来源是将细胞内的供能物质氧化、分解、释放能量，并排出CO2和H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸（cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水，二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子—自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有2-5%的电子转化为过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被认为与大约60种(而且至少是60种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -·、H2O2 及HO2·、·OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。
线粒体氧化应激及其线粒体营养素干预机制
线粒体氧化应激及其线粒体营养素干预机制 摘要：线粒体在生物氧化和能量转换的过程中会产生活性氧，当活性氧的生成与机体抗氧化防御系统之间存在不平衡时，线粒体就会发生氧化应激。线粒体氧化应激导致线粒体能量代谢失调，进一步损伤线粒体，从而促进神经退行性疾病的发生，发展。研究表明，线粒体营养素既可以增强抗氧化防御系统功能，又能够减少线粒体活性氧的生成，从而修复线粒体的氧化损伤，进而改善线粒体的结构和功能。本文将从线粒体氧化应激和线粒体营养素干预机制两方面做以综述。关键词：线粒体氧化应激活性氧烟酸硫辛酸硫辛酰胺 线粒体是真核动物细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，细胞生命活动所需能量的80%是由线粒体提供的，因此，有人将线粒体称为细胞的“动力工厂”。线粒体生物氧化和能量转换的过程中伴随着活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生。过量的ROS会引起线粒体损伤，促进神经退行性疾病的发生，发展。 由氧化应激引起的线粒体损伤是衰老及神经退行性病变的主要原因，并且严重影响运动能力。线粒体损伤可导致关键的线粒体酶功能障碍。酶的功能障碍主要是由于底物和辅酶的结合不足，而这种结合不足在补充足够的底物或辅酶及其前体后可以得到改善，长期补充线粒体营养素(mt-nutrients)可以有效地保护线粒体功能的完整，修复线粒体的损伤。Liu[1]等把线粒体营养的功能定义为：①可以提高线粒体酶底物和辅酶的水平；②诱导二相酶增强细胞内的抗氧化防御能力；③清除自由基及防止氧化剂的生成；④修复线粒体膜损伤。现就线粒体氧化应激和线粒体营养素对其干预机制两方面做简要综述。 1 线粒体氧化应激 氧化应激是指活性氧生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态，氧化应激可在活性氧生成超过抗氧化防御系统时或者在抗氧化剂活性降低时发生。众所周知，线粒体是真核动物细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，但在线粒体生物氧化和能量转化的过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，由于活性氧的活性非常高，过量的活性氧会进攻线粒体DNA及线粒体内蛋白质，脂类等生物大分子物质，从而损伤线粒体使其能量合成受到障碍，最终导致线粒体功能下降，线粒体氧化应激导致线粒体能量代谢失调，进一步损伤线粒体，从而促进神经退行性疾病的发生，发展。 1.1 线粒体活性氧的产生 线粒体具有有氧呼吸的特殊功能，在正常情况下，绝大多数的氧是通过与线粒内膜上的电子传递链传来的电子结合，
活性氧与肿瘤研究进展
基因组学论文 学院生命科学学院 专业生物科学 年级生科2班 姓名方海燕 论文题目活性氧与肿瘤研究进展 指导教师陈磊职称讲师 学号：
2017 年 5 月 3 日 目录 【摘要】 (3) Abstract (3) Keywords: (4) 1概述 (4) 2肿瘤患者氧化还原状态改变 (4) 3肿瘤患者ROS增多机制 (5) 3.1遗传分子生物学改变 (5) 3.2能量代谢改变 (5) 3.3炎性因子参与 (5) 3.4杭肿瘤药物使用 (5) 4 ROS与肿瘤生物学特性关系 (5) 4. 1与肿瘤形成研究发现 (5) 4.1.1脂质过氧化生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸 (5) 4.1.2 DNA损伤ROS通过诱导核DNA ( nDNA ) (5) 4.1.3蛋白质破坏 (5) 4.2 ROS与肿瘤转移 (6) 5 ROS与肿瘤治疗 (6) 6结语 (6) 参考文献 (7)
活性氧与肿瘤研究进展 姓名：方海燕学号：20145071235 学院：生命科学学院 指导老师：陈磊职称：讲师 【摘要】目的：探讨活性氧与肿瘤的发生、发展和治疗之间的关系。方法：应用ＰｕｂＭｅｄ和ＣＮＫＩ期刊全文数据库检索系统，以“活性氧和肿瘤”为关键词，检索２０００－０１－２０１３－０６的相关文献。共检索到英文文献２９条，中文文献３３０条，纳入标准：１）活性氧与肿瘤发生；２）活性氧与肿瘤转移；３）活性氧与肿瘤治疗。根据纳入的标准，最后分析文献２７篇。结果：肿瘤患者体内氧化还原失衡，表现为氧化应激水平增高，国内外在胃肠道肿瘤、舌癌和乳腺癌等的研究中均发现了氧化应激状态改变。肿瘤患者活性氧增多的机制主要集中在如下几个方面：１）遗传分子生物学的改变，包括转入因子Ｎｒｆ２及其抑制蛋白Ｋｅａｐ１、ＲＡＳ途径的相关突变，癌基因蛋白（比如Ｒａｆ、Ｍｏｓ、ＭＥＫ和Ｍｙｃ）的过度表达，抑癌基因（如ｐ５３）的沉默；２）肿瘤细胞处于高代谢状态，患者正常营养素摄取减少，引起活性氧的堆积；３）免疫系统非特异性的慢性激活，产生过多的前炎性因子；４）抗肿瘤药物特别是多柔比星和顺铂等的使用。活性氧与肿瘤生物学特性密切相关。一方面，它通过脂质过氧化、ＤＮＡ损伤和蛋白质破坏等参与肿瘤的形成；另一方面，活性氧也参与肿瘤的转移，这不仅表现在其清除剂可以降低细胞转移能力，也包括其可以调节肿瘤细胞迁移和侵袭；再者，活性氧和转录因子Ｓｎｉａｌ相互作用可以诱导上皮细胞间充质转化的产生。活性氧的作用与其浓度有关，高浓度的活性氧可能导致细胞凋亡，而低浓度可致细胞增殖和癌变，国内外研究发现许多抗肿瘤药物通过增加细胞内活性氧的产生来诱导肿瘤细胞凋亡，如乙烷硒啉、三氧化二砷、顺铂、柔红霉素和５－ＦＵ等。结论：活性氧不仅影响肿瘤的生物学特性，而且与肿瘤的治疗有密切关系，寻找合适的活性氧浓度，将为肿瘤的防治提供帮助。 【关键词】肿瘤；活性氧；治疗；综述文献。 Abstract：OBJECTIVE;To discuss the relationship between reactive oxygen species (ROS) and tumor,including the development，metastasis and treatment of tumor. METHODS;Using "reactive oxygen species and tumor" as key words totrace related papers from January 2000 to June 2013 in the database system of PubMed and CNKI. Thirty-nine literatureswere finally selected according to the inclusion criteria as follows; 1)reactive oxygen species and development of tumor;2) reactive oxygen species and metastasis of tumor; 3)reactive oxygen species and treatment of tumor. RESULTS; Tumor patients suffered from redox imbalance, manifesting as increasing of the oxidative stress level. Domestic and foreign studiesof gastrointestinal tumortonguc carcinomabrcast cancer all found the change of oxidative stress level. The main mechanisms why reactive oxygen species (ROS) arc ample in tumor patients arc as follows:1)the change of genetic molecularbiology,including relative
呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒
呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书 （中文版） 主要用途 呼吸链依赖性纯化线粒体氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染 色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在线粒体氧化条件下，选择性阻止膜电位，所产生的荧光，来定量检测线粒体内膜电位依赖性活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于线粒体功能、氧化激发和抑制机理等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。 技术背景 超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定线粒体活性氧族的浓度。三氟甲氧基苯腙羧基氰化物（carbonyl cyanide 4-trifluoromethoxy henylhydrazone；FCCP）使线粒体膜化学离子梯度消失。 产品内容 缓冲液（Reagent A）毫升 选择液（Reagent B）微升 补充液（Reagent C）毫升 染色液（Reagent D）微升 产品说明书1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里，染色液（Reagent D），严格避免光照；有效保证12月 用户自备 培养箱：用于染色孵育 （共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光线粒体 荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于测定线粒体荧光强度 1
程辉辉 实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定
华中农业大学水产学院《动物生理生化研究法》实验报告（2014-2015年度第二学期） 实验单元3：鱼类氧化应激指标的测定 学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.21 摘要：鱼体在受到外界刺激的时候，组织或细胞内氧自由基生成增加，清除能力降低，导致活性氧在组织或细胞内蓄积而引起氧化损伤。而活性氧的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化。蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。而衡量脂质过氧化的指标便是丙二醛，其是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标。在本实验中，我们主要探究了脂质过氧化和蛋白羰基化的测定方法，以便更好的定量衡量氧化应激的程度。实验中所测得的肌肉蛋白质羰基含量为727.92 nmol/mg prot，肝脏蛋白质羰基含量为1142.41 nmol/mg prot，肌肉MDA含量为0.011 nmol/mg prot，肝脏MDA 含量为0.14 nmol/mg prot，相比其他的实验，所测定结果相差较大。在实验中存在诸多操作失误，希望能在以后的实验中引以为戒，为实验室条件下对鱼类的氧化应激水平奠定实验和操作基础。 关键词：应激；蛋白质定量；蛋白质羰基化；脂质过氧化 【前言】 随着集约化养殖的发展，鱼类在养殖过程中遭受到的应激因素日益增多。人为活动、外界环境的变化、饵料和水体中的有害物质均会对鱼体产生应激。氧化应激反应是有氧生物不可避免的，它是生物体的活性氧簇( reactive oxygen species，ROS)和抗氧化防御系统之间不平衡的结果。ROS是过渡金属离子、农药、石油污染物等物质诱导产生的。自由基是正常细胞新陈代谢过程中由内源性细胞产生的。线粒体呼吸是ROS 主要的内源性来源（李学彬，2009）。ROS 的逐步产生可以导致蛋白质和脂质的氧化，基因表达的改变以及细胞氧化还原状态的变化。 在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的最终分解产物之一，常作为脂类过氧化的测定指标，其含量能直接反映机体脂质过氧化程度，并间接反映细胞损伤程度（刘淑兰，2012）。 脂质过氧化的测定通常是通过TBA试验来完成的，其主要应用于食品和生物材料中脂类氧化检测和定量。硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化合物分解生成丙二醛（MDA），MDA 与硫代巴比妥酸（TBA）作用生成TBA染料配合物，此化合物在532nm 下有最大吸收值。通常测试结果表示为532nm下吸光值与丙二醛吸光系数之积，即通常所说TBA值。 蛋白质羰基化是指蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。蛋白质羰基在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统（MCO系统)完成的。在这个过程中，Fe2+和Cu2+可以结合在蛋白质的阳离子结合位点。被H2O2或O2攻击之后将侧链含有氨基的氨基酸羰基化（曹溪青，1985）。此外, 羟自由基也可直接作用于肽链, 使肽链断裂, 引起蛋白质一级结构的破坏, 在断裂处产生羰基。目前，大量的研究证明了氧化损伤与衰老和疾病的关系。 实验中采用的蛋白质羰基化的测定方法是2, 4 -二硝基苯肼（DNPH)比色法，这 1 / 3
呼吸链生物化学
第七章生物氧化 1、生物氧化（biological oxidation）：物质在体内进行氧化称生物氧化。 主要指营养物质在体内分解时逐步释放能量，最终生成CO2和水的过程。 生物氧化又称组织呼吸或细胞呼吸。 生物氧化释放的能量：主要（40%以上）用于ADP的磷酸化生成ATP，供生命活动之需。 其余以热能形式散发用于维持体温。 2、生物氧化内容 （1）生物体内代谢物的氧化作用、代谢物脱下的氢与氧结合成水的过程。 （2）生物体内二氧化碳的生成。 （3）能量的释放、储存、利用（ATP的代谢——ATP的生成与利用）。 3、生物氧化的方式——遵循一般氧化还原规律。 （1）失电子：代谢物的原子或离子在代谢中失去电子，其原子正价升高、负价降低都是氧化。（2）脱氢：代谢物脱氢原子（H=H++e）的同时失去电子。 （3）加氧：向底物分子直接加入氧原子或氧分子的反应使代谢物价位升高，属于氧化反应。向底物分子加水、脱氢反应的结果是向底物分子加入氧原子，也属于氧化反应。 4、生物氧化的特点 （1）在温和条件下进行（37℃，中性pH等）； （2）在一系列酶催化下完成； （3）能量逐步释放，部分储存在ATP分子中； （4）广泛以加水脱氢方式使物质间接获得氧； （5）水的生成由脱下的氢与氧结合产生； （6）反应在有水环境进行； （7）CO2由有机酸脱羧方式产生。 5、物质体外氧化（燃烧）与生物氧化的比较 （1）物质体内、体外氧化的相同点： 物质在体内外氧化所消耗的氧量、最终产物、和释放的能量均相同。 （2）物质体内、体外氧化的区别： 体外氧化（燃烧）产生的二氧化碳、水由物质中的碳和氢直接与氧结合生成； 能量的释放是瞬间突然释放。 5、营养物氧化的共同规律 糖类、脂类和蛋白质这三大营养物的氧化分解都经历三阶段： 分解成各自的构件分子（组成单位）、降解为乙酰CoA、三羧酸循环。
肿瘤与炎症的关系
肿瘤发生、发展与炎症的关系 班级：2015级研究生学号20151051018 姓名：季科炎症与肿瘤的发生、发展具有相关性，它们通过内源性及外源性两条通路相互联系。炎症调节因子和效应细胞是肿瘤组织局部微环境的重要组成，它们在炎症与肿瘤相互关系中起着重要作用。 炎症与肿瘤相互关系的研究始于19世纪，研究表明，慢性炎性病灶常继发肿瘤发生，而肿瘤组织活检样本中存在炎症细胞。炎症与肿瘤之间的联系包括两个通路：外源性通路，由增加肿瘤风险的炎症诱导（如炎症性肠道疾病）；内源性通路，由可以引起炎症和肿瘤生成的基因改变所致（如致癌基因）。 1、外源性通路：流行病学研究证实，约25%的肿瘤由炎症发展而来。炎症可以是由微生物感染引起，也可以由非炎症性物理或化学性刺激引起。在胃肠道，幽门螺杆菌感染是腺癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要原因。在胆管，华支睾吸虫感染引起的慢性炎症浸润可以导致胆管癌。乙型和丙型肝炎病毒感染引起的慢性肝炎患者易患肝癌，居全球肿瘤死亡率第三位。非感染引起的慢性炎症也与癌变相关，食管炎、食管腺上皮化生、慢性胰腺炎可以增加食管癌、胰腺癌的发病风险。临床研究发现 ,溃疡性结肠炎与结肠癌、骨盆或卵巢炎症与卵巢癌、持续性细菌性感染或非感染性刺激引起的慢性前列腺炎与前列腺癌之间可存在相关性。所以，越来越多的证据支持慢性炎症与肿瘤发生之间存在相关性。 炎症微环境有直接的致突变作用，其中的白细胞生成大量活性氧和活性氮，可以产生诱变剂，如过氧化亚硝酸盐，与DNA反应导致增殖的上皮细胞和基底细胞发生突变。巨噬细胞和T 淋巴细胞可以释放TNF-α和巨噬细胞游走抑制因子，加速DNA损伤。另外，炎症通过直接或间接的作用参与了肿瘤血管新生和肿瘤细胞生长、侵袭和转移。 2、内源性通路：研究发现，炎症细胞和调节因子存在于大多数肿瘤的微环境中，也存在于没有炎症的流行病学基础的病例。人们猜想，在这些病例中引起肿瘤形成的基因改变是否导致了炎症微环境的形成。 在人类肿瘤中, RAS家族成员是最易发生突变的显性基因，而 RAS-RAF信号通路中激活的致癌成分又诱导了有促肿瘤作用的炎症化学趋化因子和细胞因子。MYC是在多种人肿瘤中过表达的转录因子，该基因的表达失常启动和维持着肿瘤表型的主要方面，除了有促细胞增殖作用,还影响了细胞外微环境的重塑，炎症细胞和调节因子在此过程中起了重要作用。在小鼠 MYC依赖的胰岛β细胞癌，血管新生首先由MYC诱导的炎症因子IL-1β引发。MYC激活了几个趋化因子的转录 ,它们对肥大细胞有募集作用。肥大细胞驱动了血管新生，在这种情况下，它们维持着新生血管的形成和肿瘤的生长。 虽然很多实验和临床结果都显示炎症有促肿瘤作用，但是也有结果并不支持这个结论。例如，很多显著的慢性炎症反应如牛皮癣与皮肤癌没有关系。而且，在某些肿瘤或者某些肿瘤亚型,炎症细胞与预后良好有关(如肠道肿瘤中的噬酸细胞，在乳腺癌的一个亚型和胰腺癌中的TAMs)。这些观察可能反应炎症细胞不仅破坏正常组织细胞，而且也破坏肿瘤细胞。例如，虽然在多数情况下，巨噬细胞起促肿瘤作用，但适当激活时，巨噬细胞能杀伤肿瘤细胞，并引发以作用于血管壁为中心的肿瘤破坏性炎症反应。 自然免疫反应可以促发抗肿瘤的保护性反应。早在19世纪末即有研究者观察到有些肿瘤患者的肿瘤病灶有严重术后感染时，机体产生自发的、持续的肿瘤抑制作用。 综上所述，炎症与肿瘤之间存在相关性，它们通过内源性与外源性通路相联系，促进了肿瘤微环境的形成。炎症调节因子在炎症与肿瘤相互关系中起着重要作用,
【JF-800A】血液灌流治疗腹型过敏性紫癜,改善氧化应激与炎性反应指标,安全性良好
【JF-800A】血液灌流治疗腹型过敏性紫癜，改善氧化应激与炎性反应指标，安全性良好 【文献解读】肠外营养支持联合HA280血液灌流治疗腹型过敏性紫癜临床研究 导读 过敏性紫癜（HSP）目前已经成为我国儿童人群中较为常见的一种系统性血管疾病。在医学领域中，认为HSP可能属于血管的炎性反应，若干研究结果也显示，HSP的发病机制与机体的氧化应激反应、免疫炎性反应等均具有较为密切的联系。罹患腹型过敏性紫癜的患儿大多症状十分严重，会出现消化道内的大出血，诱发肠梗阻、肠穿孔以及肠套叠等多种严重的并发症，对儿童的生命安全形成巨大的威胁。在过敏性紫癜的治疗方面，目前尚以对症治疗、控制病情进展等保守策略为主。随着近些年医学科技的进步，针对各类重症患者抢救方法以及策略的方法研究也取得了较大的进展。其中血液灌流技术在近些年逐渐成熟，在重症患者的抢救过程中发挥了极大的作用，该种方法在本质上是利用体外循环的方法将患者血液循环之内的免疫复合物、炎症反应介质和其他有害物质清除，发挥出治疗效果。本研究选择2016年1月到2019年4月在我院接受治疗的腹型过敏性紫癜患儿96例作为研究对象，对肠外营养支持联合HA280血液灌流治疗腹型过敏性紫癜患儿的临床效果进行探讨，现报告如下： 资料和方法 1、研究对象： 选择2016年1月到2019年4月在我院（河北省唐山市丰润区人民医院）接受治疗的腹型过敏性紫癜患儿96例作为研究对象。 2、研究方法： 分组方法和结果：按照患儿的出生日期单日、双日分为对照组（n=48）和治疗组（n=48）。两组的一般临床资料数据差异均不具有统计学意义。
3、治疗方法： 对照组患儿给予常规治疗，具体包括：入院后给予肠外营养支持，在活动性消化道出血期间严格禁食，适当给予患儿补充钙离子，并使用H2受体阻滞剂进行对症治疗。如果患儿的症状逐渐改善，则逐步停止使用激素。 治疗组患儿在对照组治疗方法基础上进行血液灌流治疗，具体如下：使用JF-800A血液灌流机（健帆生物科技集团股份有限公司）与HA280树脂血液灌流器（健帆生物科技集团股份有限公司）完成血液灌流，每日完成一次血液灌流治疗，每次时间为2h左右，将血流速度控制在50～100ml/min。 两组的治疗时间均为14d。 4、观察指标： 对比两组的治疗期间糖皮质激素使用量、消化道症状持续时间、皮疹持续时间和住院时间；对比两组治疗前后的血清氧化应激指标变化情况；对比两组治疗前后的血清炎性因子变化情况。 5、统计学方法： 采用SPSS 4.0软件进行统计学处理，计量资料结果使用平均数±标准差表示，计数资料以率（％）表示，两组计量数据比较采用独立样本ｔ检验，同组干预前后计量数据比较采用配对ｔ检验，两组计数数据比较采用χ２检验。两组等级资料比较采用秩和检验中的Wilcoxon检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果 1、两组治疗期间糖皮质激素使用量、消化道症状持续时间、皮疹持续时间和住院时间对比 治疗组在治疗期间糖皮质激素使用量、消化道症状持续时间、皮疹持续时间和住院时间均短于对照组（P＜0.05）。
氧化应激
氧化应激 本综述由解螺旋学员穿山甲说了什么负责整理（2017年12月） 氧化应激（oxidative stress, OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化而导致的组织损伤。1, 2一旦发生氧化应激，许多细胞生物分子，如DNA、脂质和蛋白质就会容易受到自由基引起的氧化损伤，从而导致细胞和最终的组织器官功能障碍。氧化应激与多种疾病有关。 1.心血管疾病 过多的氧化应激反应物的堆积对血管系统有害1，它们会损伤内皮和平滑肌细胞膜，减少NO水平，氧化四氢生物蝶呤（BH4）作为一氧化氮合酶（NOS）的辅助因子，促进不对称二甲基精氨酸（ADMA）的合成，产生NOS抑制物，抑制鸟苷环化酶。其中的一个机制是低密度脂蛋白（LDL）中的多不饱和脂肪酸氧化成氧化低密度脂蛋白（oxLDL），这也是动脉粥样硬化的一个中间产物。3-5ROS依赖的信号通路引起转录和表观遗传失调，导致慢性低度炎症、血小板活化和内皮功能障碍。4, 6心血管疾病与心肌细胞活性氧族（ROS）的过多有关。7, 8 2.神经退行性疾病9-11 图1. 氧化应激与各种神经退行性疾病的关系 3.系统性红斑狼疮（SLE） SLE的特点是产生有害的自身抗原，炎症因子的过度作用，以及破坏性的组织和器官损
伤。所有这些紊乱都会因活性氧的异常消耗和过量生成而增强或减弱。12氧化应激在SLE中增加，导致免疫系统失调、细胞死亡信号的异常激活和处理、自身抗体的产生和致死性并发症。自身抗原的氧化修饰引起自身免疫，血清蛋白的氧化修饰程度与SLE的疾病活动和器官损害密切相关。13 4.慢性阻塞性肺疾病（COPD） 有证据表明COPD患者存在氧化和羰基应激，特别是在急性加重期。14COPD患者的肺泡巨噬细胞更活跃，释放更多的活性氧，表现为超氧自由基和过氧化氢。15COPD患者激活的外周血中性粒细胞释放的活性氧增加，特别是在病情恶化期间。14COPD常加重期患者体内内源性抗氧化物谷胱甘肽的浓度低于稳定期患者。16 5.高血压病 ROS影响高血压发展的过程包括氧化还原敏感信号通路的激活，尤其是在血管系统中，血管扩张剂NO减少，ROS生成增加。17, 18 OS与多种疾病有关，但研究最多的还是心血管疾病。针对OS与各疾病的关系，已经出现了抗OS的治疗方案。 参考文献 1. Annuk M, Zilmer M, Fellstrom B. Endothelium-dependent vasodilation and oxidative stress in chronic renal failure: impact on cardiovascular disease. Kidney Int Suppl 2003; (84): S50-3. 2. Al Shahrani M, Heales S, Hargreaves I, Orford M. Oxidative Stress: Mechanistic Insights into Inherited Mitochondrial Disorders and Parkinson's Disease. J Clin Med 2017; 6(11). 3. Heinecke JW. Oxidants and antioxidants in the pathogenesis of atherosclerosis: implications for the oxidized low density lipoprotein hypothesis. Atherosclerosis 1998; 141(1): 1-15. 4. Santilli F, D'Ardes D, Davi G. Oxidative stress in chronic vascular disease: From prediction to prevention. Vascul Pharmacol 2015; 74: 23-37. 5. He F, Zuo L. Redox Roles of Reactive Oxygen Species in Cardiovascular Diseases. Int J Mol Sci 2015; 16(11): 27770-80. 6. Santilli F, Guagnano M, Vazzana N, La Barba S, Davi G. Oxidative stress drivers
线粒体外NADH的氧化;非线粒体氧化;活性氧与人体疾病
第三节线粒体外NADH的氧化 述：线粒体外膜通透性较高，允许分子量1000以内的物质通过。 线粒体内膜具有选择性通透性，主要依赖内膜中不同的转运载体转运物质。 ※线粒体内NADH的氧化 NADH直接进入NADH氧化呼吸链氧化生成水。 ※胞液中NADH的氧化： ⒈胞液中3-磷酸甘油等脱氢生成的NADH+H+在细胞有氧情况 下进入线粒体氧化并产生ATP。 ⒉NADH +H+不能自由透过线粒体内膜，需经2种转运机制进 入线粒体，再通过呼吸链进行氧化磷酸化。 一、α－磷酸甘油穿梭作用 ⒈发生部位：主要存在于脑和骨骼肌。 ⒉作用过程：（课本P63图5－12）幻灯80、81 ⒊能量生成：每1 NADH +H+ 氧化产生2ATP 二、苹果酸－天冬氨酸穿梭作用 ⒈发生部位：主要存在于肝和心肌 ⒉作用过程：（课本P64图5－13）幻灯83、84 ⒊能量生成：每1 NADH +H+氧化产生3ATP
第四节 非线粒体氧化体系 一、需氧脱氢酶类和氧化酶类 二、微粒体加单氧酶系 （一）加单氧酶（混合功能氧化酶、羟化酶）： ⒈ 利用氧分子在代谢物中加入一个氧原子； ⒉ 需NADPH 提供电子，黄素蛋白（辅基FAD ）、铁氧还蛋白 （辅基Fe-S ）Cyt-P450传递电子。 ⒊ 参与类固醇激素、胆汁酸及胆色素的生成和生物转化作用 RH + NADPH + H + + O 2 → ROH + NADP + + H 2O （二）加双氧酶：利用氧分子在代谢物中加入2个氧原子。 三、过氧化物酶体中的酶类 （一）过氧化氢酶(catalase) 又称触酶，其辅基含4个血红素 受氢体 辅酶（辅基）产物不需氧脱氢酶 辅酶需氧脱氢酶 O 2 FMN 或FAD H 2O 2氧化酶 O 2 含Cu H 2O 2H 2O 2 2H 2O + O 2 过氧化氢酶
活性氧与人体的衰老机制
生老病死是人的客观规律 人们常说：“生老病死，人之常情。”但同时，这种司空见惯和豁达洒脱的口吻在每个人真正直面时显得单薄而寡淡。新生命的降生让人热泪满襟，疾病的折磨让人痛苦不堪，日复一日的衰老让人无力悲凉，死亡让人徒留多少遗憾。“生如夏花般灿烂，死如秋叶般静美”，这是泰戈尔的生与死；“人生自古谁无死，留取丹心照汗青”，这是文君的慷慨赴死；“老骥伏枥，志在千里，”这是曹操的壮士暮年—— 人生的必然过程被千古风流人物演绎得隽永而灿烂。而如今，随着科学技术迅猛发展，人们对生老病死的认识也越加客观，研究也越发主动。经过前辈的刻苦钻研，我们得以站在巨人的肩膀上，对“生老病死”认识、了解，从而强壮其体魄，认真工作五十年，健康生活一百。 首先，我们要对在自然界中扮演了重要角色的自由基加以了解。什么是“自 由基”？自由基是指外层轨道中具有奇数电子的原子、原子团、分子。正是这些 数量级仅在原子、分子水平的小东西却对生命进程起了至关重要的作用。自由基的化学性质是活性强，结构不稳定,存在的时间短暂，一旦发生反应，常呈链锁 式反应。 在化学上，自由基的产生方法主要有三种：一、光照法，具有一定能量的光 辐照某些化合物时，使化学键断裂，生成自由基；二、氧化还原法，通过电子转 移生成自由基；三、热均裂法，很多过氧化物和偶氮化合物受热时均裂，生成自 由基，这是最方便而且用途最多的方法。而在实际生活中，则例如，外界环境中 的阳光辐射、电脑辐射、空气污染、吸烟、农药、X 射线、电磁波、酒精、一些
药物和污染物质等。而且，医学研究指出，人类在极端不良情绪下，如愤怒、紧张、恐惧时会产生自由基——所以各位，就算为了自己的性命着想，也要修身养性才是。 自由基就像空气一样无处不在：化妆品里，吸烟做饭时，化学制剂中，工业 废气中，汽车尾气中。人体里的自由基可以帮助传递维持生命活力的能量，也可以被用来杀灭细菌和寄生虫，还能参与排除毒素。受控的自由基对人体是有益的。但当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这种自由基就会给我们的生命带来伤害——正所谓是过犹不及。而伴随着生态环境形势日益严峻，自由基数目也与日剧增。 自由基对人体的损害主要有三个方面：一、使细胞膜被破坏；二、使血清抗 蛋白酶失去活性；三、损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外。因此，降低自由基危害的途径也有两条：一、利用内 源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二、发掘外源性抗氧化剂--自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽、胡萝卜素、硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。 这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自 由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。我们生物体系主要遇到的是氧自由