单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析

单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析

生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。

抗体或蛋白聚体的分类

聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。下表1列出了生物制

药中最常见的聚体类别。为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50μm）。在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。就其分子量而言，大小大于10的二次方kDa的聚体潜在的不良免疫原性反应潜力，值得更仔细的评估。

聚体除大小外，聚体随时间的大小变化率是一个有用的参数，可以提供聚体的功能特征，其中时间对应蛋白质产品的有效期。聚体最初可以小二聚体或碎片的形式存在，并朝着更大的聚集结构变化，例如亚可见或可见颗粒（如果这种转变在热力学上温度变得快速）。在任何给定的时刻，蛋白质可能在有利于蛋白质单体或天然构型的热力学状态与有利于展开的天然蛋白质构型状态之间转变。在某些的条件下，未折叠的蛋白质可能与其他天然和非天然形式形成复合物，在获得足够的自由能以转变为可能成为新蛋白质实体而形成稳定状态的聚体。科学家Lumry和Eyring在1960年代研究了这些转变的基础，他们提出了溶液中蛋白质聚体的动力学转变，并在干扰素-γ聚集的情况下进一步转变为一级转变反应动力学。评估药品聚体总增长率的

过程很复杂。单一药物产品通常具有不均匀的聚体混合物（如上表1）。稳定的蛋白制品具有异质性溶液中存在的聚体，但与更不稳定的制品相比，其生长速率很小。聚体的增长速度加快的更加令人担忧，可能需要更积极的控制和聚体控制最小化策略。

蛋白质聚集的来源

蛋白质药品的聚体可以有多种来源，并且各种类型的聚体可以存在于所分装的药品瓶中。蛋白质聚体形成的潜力存在于蛋白质药物制造的各个阶段。从蛋白质序列和特征开始，每种蛋白质将具有可使其或多或少的稳定物理化学特征。例如，游离巯基水平升高而发现在培养物中会产生聚集的CHO细胞表达的单克隆抗体（MAb）的聚集情况，如果将硫酸铜添加到培养物中，则可以防止这种情况的发生。随着多种蛋白质形式与其环境相互作用的可能性增加，蛋白质异质性也可能是蛋白质聚集的一个促成因素。对于依帕珠单抗，二硫键会有利于共价聚体的形成。

治疗性单克隆抗体通常以高浓度配制，这也有利于增加分子相互作用的发生率，因此有可能形成聚体。因此，药物制造商花费大量时间和精力来开发一种制剂，制剂将使蛋白质药物产品在其有效期内保持稳定，无论是在溶液中还是冻干产品。例如，将蔗糖添加至白介素-1受体激动剂或冻干MAb制品以抑制或减少聚体的形成。

生产、保存、运输中的大量冷冻对蛋白的质稳定制备提出了挑战，因为在溶液冷冻期间会发生溶质浓缩作用。理想的策略是在–80℃下同时冻结整个溶液，并迅速冻结，这样可以最大程度地减少热变迁（例如低共熔）和玻璃化转变。此策略对于大批量解决方案不切实际。大量冷冻期间溶质浓度和pH的变化也可促进蛋白质聚集。大量的解冻也带来这方面的挑战，这主要与冰-液界面的表面吸附有关。当需要大量冷冻和解冻时，适当的制剂配方就变得至关重要，而赋形剂可以作为蛋白质冷冻保护剂来使用。

分装和生产工操作可能会由于剪切力而使蛋白质发生机械变性，或者会引入杂质，这些杂质会作为蛋白质聚体的成核源。例如，某些活塞式泵类似于汽车发动机活塞与润滑油相互作用的方式与蛋白质药物产品相互作用。蛋白药物产品和活塞杆之间的紧密接触会破坏原本稳定的药物产品。对于抗体药物产品来说就是这种情况，使用吸光度和光遮蔽方法确定其聚体颗粒的水平随着泵送次数的增加而增加。在活塞脱落的情况下，不锈钢钝化可以降低将不锈钢沉积物引入最终药物中的风险，这种情况可能会导致蛋白质异核化。

新的输送系统增加了容器兼容性，并增加了形成蛋白质聚体的可能性。小瓶中的玻璃，塞子中的橡胶，塞子和注射器中的硅树脂以及注射器中的钨这些异物，它们可能会进入蛋白质药物产品。这些异物中许多都是带静电的，因此有可能与蛋白质，蛋白质聚集体和蛋白质

聚体的前体发生相互作用，形成异核。对于预填充的注射器来说就是这样，其中包含在注射器针筒制造过程中脱落的钨颗粒，这些钨颗粒用作聚体的形成。

蛋白质聚体的研究

基于聚体动力学模型，蛋白质聚体可能比其单体更具疏水性。这是因为当蛋白质转变为天然的、部分展开的状态并暴露其疏水残基时，可能会发生蛋白质聚集。研究表明，聚体比单体使用硫酸铵沉淀效果更好，并且它们与聚偏二氟乙烯（PDVF）膜的结合更牢固。

通常，通过将蛋白质溶液暴露于高温、pH、湿度和光入射的极端条件下来研究聚集体，这就是所谓的强制降解和光降解研究。基本原理是基于这样的期望：蛋白质以这种方式降解反映了蛋白质药物的有效期中所经历的降解途径。这些参数在建立稳定性研究程序时也是非常有价值的。

蛋白质聚集研究的另一个重要部分是评估聚体的生物学活性。与单体蛋白质活性相比，聚体的生物活性的差异会深刻影响蛋白质药物的功效。在这种情况下，产品功效可能会受到影响。通常，基于风险的聚体评估可能需要进行特定的研究，以帮助阐明哪种类型的聚体更令人担忧。对药品在其有效期中所处的不同环境进行全面调查，包括制造、存储、运输、冷冻和解冻周期、氧气暴露、光照和物理作用力

等等。

蛋白质聚体的检测

生物制药工业中可用于检测，表征，定量和监测生物制药蛋白产品中聚体的分析方法数量在不断的增加。下表2列出了用于检测，监视和研究聚体的最常用方法。尽管表述并不全面，但表2提供了分析方法的一般概念及其主要优点和局限性。可用的测试方法可以分为两类：检测小聚集体的方法，例如二聚体，LMW，HMW，可溶性聚体和蛋白质片段（表2的第一部分），以及检测大聚集体的方法，例如不溶的亚可见和可见的颗粒（表2的第二部分）。在用于检测小聚集体的一组测试方法中，体积排阻色谱法（SEC）通常用于批次放行期间的常规检测和聚体监测。不适合批量生产的方法可以用其他表征或验证来测试。

尺寸排阻高压液相色谱法是对二聚体，LMW和HMW物等蛋白质聚体使用最广泛的分析方法。该方法适具有高灵敏度、精密度、分离度、准确性，可以高通量进行分析测试。但是，作为色谱方法，它也可能导致聚集，导致样品制备过程中现有聚集物被去除，或者在无法区分或回收HMW物时低估了聚集物的存在。SEC的主要局限性可能是需要以低浓度（例如1mg/mL）进样。对于治疗性蛋白质，这通常意味着稀释100倍，导致可逆的可溶性聚集体分解。这种担忧导致了更普遍的问题，例如，总体概况的相关性如何？它代表最终药品中存在的聚

集体吗？如其他地方所述，没有一种能够评估给定蛋白质溶液中存在的所有聚集体的分析方法。通常需要几种方法的组合来覆盖可能存在的聚集体的微观和宏观范围。另外，由于每种方法的局限性，可能需要正交实验来确认方法。例如，SEC结果可能需要使用其他正交方法（例如分析超速离心（AUC））进行确认。AUC可以用作确认方法，因为它提供了良好的聚体分离，并且不需要样品稀释或样品制备。

在用于聚体表征的方法中，场流分离（FFF）和动态光散射（DLS）能够直接评估溶液中的聚集体（无需稀释）。FFF的检测范围比SEC 的检测范围宽，但是可以解决浓缩样品的数据分析困难的问题。DLS 是一种很好的定量方法，读数与表面积成正比，因此，如果大小差异不够大，大聚体可以掩盖小聚体的检测。热量法对于评估蛋白质溶液的稳定性非常有用，因为它可以检测蛋白质的解离和折叠。某些方法可以组合使用，以拥有更强大的分析工具，例如质谱联用色谱法，可提供有关化学和物理降解的信息。

此外，根据美国药典（USP），通常使用显微镜和光遮盖法检测和计数亚可见颗粒）<788>章。两种测试都适用于小批量和大批量产品，但通常在此类测试中使用多个药品瓶样品。样品首先通过光遮蔽法进行测试。如果样品未达到规定的限值，则可以使用显微分析方法。但是，如果有技术原因或正在测试的产品产生干扰，使光遮蔽方法不合适或结果无效，则显微镜方法可能是唯一的测试方法。浊度法根据参

考标准测量溶液的乳浊度或透明度。光遮蔽，比浊法和DLS的组合已用于评估蛋白质溶液中颗粒形成的过程。当这些方法与检测到的聚体的表观球状尺寸相关时（如下图1），用于检测和监测直径在几纳米到50纳米之间的小聚体方法的能力就存在差距，这种差距可能会造成因为检测，测量和评估某些小聚体以及较大聚体前体的运动能力可能无法在蛋白质聚体控制策略中实现。实际上，已经指出表观球状直径约为0.5 μm的聚集体没有得到常规跟踪和分析。

蛋白质聚体的控制

制药商采用了各种方法来控制蛋白质药物中的聚体，这取决于聚体的性质和水平，以及它们对特定蛋白质产品的安全性、质量、稳定性的潜在影响。尽管蛋白质药物产品可能包含的性质和大小与通过适当监控无法控制的某些聚体，但某些聚体可能需要根据其风险评估要求采取积极的控制策略。在某些情况下，控制措施是为了减少或抑制聚体的形成。有时，各种条件的改变可以提高易于聚集的蛋白质产品的稳定性，例如在冻融过程中的控制策略也可能包括添加赋形剂。重组人血小板活化因子就是这种情况，重组人血小板活化因子在储存时通过与二氧化硅颗粒异核形成聚体。表面活性剂普罗尼克酸F68的添加或配制药物产品的pH值的变化也减少了异核的形成。在其他情况下，控制策略的重点是加强对总量水平的限值和规格的监测以及聚体的评估。液体Remicade产品就是这种情况，其浊度比冻干产品的浊

度更高。采取的措施是增加浊度指标限值，并通过凝胶过滤HPLC加强单体指标的监测。

蛋白质聚体限度的控制

研究产品聚集的程序能够为产品聚集水平建立标准和限制。聚体总量是否是特定药品的稳定性指标，还是存在于药品中的混合物被确定为低风险指标，积累足够的数据以支持我们最终的结论都是很重要的。这样做的理由是，在产品开发的临床前和临床阶段积累足够的数据，以及对蛋白质降解途径的研究，将有助于更好地理解聚体对药品安全性和质量的影响。

对于蛋白质药物聚体的最大允许限量尚无共识，因为某些聚体水平，某些蛋白质仍可能在很大程度上稳定且安全，而对于其他蛋白质，聚体水平的很小变化可能会深刻影响蛋白质的稳定性甚至安全性。直到拿到申请许可证时，药物制造商将收集足够的数据来证明控制策略的合理性。这些数据包括临床批次的结果、体内和体外研究的信息、产品稳定性、聚体的类型及其对产品安全性和质量的潜在影响。通常，允许进行正式分析，从而可以预测产品整个有效期内预期的聚体含量。

聚体的最大可允许极限的唯一标准为USP <788>是基团亚可见粒子。一些制造商已开始努力优化评估亚可见颗粒的替代方法，以减少

所需的样品量，以及USP <788>建议使用光遮蔽和显微镜方法分析高浓度，高粘度蛋白溶液时可能会遇到的限制。但是，USP对亚可见颗粒的测试旨在减轻与可注射溶液中外来颗粒的存在有关的风险，这些外来颗粒可能会导致血管闭塞，并且解决与大型蛋白质聚体有关的安全性问题。根据USP <788>，可见颗粒仅具有定性规格，这表明注射用无菌溶液应基本不含可通过目测观察到的颗粒物质。由于外观检查的主观性，制造商在进行可见颗粒的常规分析时必须小心。

蛋白质聚体的监管指导建议

目前尚无有关生物制药蛋白质聚体的具体监管指南文件。国际协调会议（ICH）提出了有关药品和原料药杂质的指南（ICH Q5C，Q6B，Q1AR）。稳定性指南将杂质评估作为长期，压力，加速和光暴露（ICH Q1系列）期间稳定性计划的一部分，而可比性指南则考虑了制造变更期间的杂质（ICHQ5e）。这些指南提供了杂质评估的一般指南，但并未将聚体作为蛋白质药物制造中的单独问题专门解决。

通常，制造商强烈依赖其研发小组制定的综合计划，以评估其在药物特性，制造和存储过程中的聚体。此外，监管机构鼓励实施总体标准评估，并已看到制造商根据其产品总体的合理分析而提供的相关信息激增。在拿到许可申请时，制造商应该能够为其汇总级别的规范提供数据支持的依据。

结论

评估聚体时，有一些重要的考虑因素。蛋白质药物中的聚体可以看作是动态地经历过渡平衡状态的各种类型（大小）的不断发展的混合物。在任何给定时间，此类混合物的数量可能会达到新的平衡，并朝更多的聚体结构发展。蛋白质聚体混合物的动力学非常复杂，需要多种分析方法进行检测，评估和监控。

制剂仍然是实现蛋白质稳定的关键方面，也是蛋白质聚集最小化的重要步骤。与伴侣蛋白协助内源蛋白维持其折叠状态相同的方式，赋形剂，pH和温度的正确组合可防止蛋白药物处于聚体状态。

蛋白质药物中聚体的评估取决于科学方法，基于风险的管理程序，该程序可评估蛋白质的稳定性，并确定给定的聚体混合物在药品有效期内的安全性和有效性的影响。对蛋白质在其货架期内每次环境暴露中可能遇到的潜在降解途径的了解，为良好的蛋白质产品奠定了基础。这些知识应与临床前，临床和制造经验相关联，以更好地了解聚体类型和数量。