酪氨酸解氨酶(TAL)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
酪氨酸解氨酶（TAL）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC4060
规格：50T/48S
产品内容：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前每瓶加入5mL双蒸水和20μL浓HCl充分溶解待用。现配现用。产品说明：
酪氨酸解氨酶（TAL）广泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸次生代谢途径的关键酶之一。TAL能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）直接将酪氨酸转化为香豆酸，香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。
TAL能够分解酪氨酸产生香豆酸，其在310nm下有吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出TAL活性。
自备实验用品及仪器：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰、浓盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理：
（1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
（2）细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤：
（1）紫外分光光度计预热30min，波长调至310nm。蒸馏水调零。
（2）加样表：在1mL石英比色皿中分别加入
试剂名称（μL）测定管
试剂一700
试剂二200
样品100
充分混匀后立即测定10s时在310nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A2-A1。
三、TAL活力计算：
1、按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。
TAL（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(V样×Cpr)÷T=333×ΔA÷Cpr。
2、按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。
TAL（U/g鲜重）=ΔA÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=333×ΔA÷W。
3、按细胞或细菌个数计算：
单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟在310nm下吸光度变化0.01定义为一个酶活性单位TAL（U/104cell）=ΔA÷0.01×V反总÷(500÷V提取×V样)÷T=0.667×ΔA。
V反总：反应总体积，1mL；V样：加入的样品体积，0.1mL；
Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；
V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；
T：反应时间，3min。
注意事项：
1、当ΔA大于0.2或者A1大于1.5时，建议将样品用蒸馏水稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间
（5min或10min）或增加加入的样品体积来测定。
酪氨酸酶
酪氨酸酶 概念：酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一种含铜的氧化还原酶，它与生物体合成色素直接相关．（长的黑有很大的一部分原因在自己）在人体中，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关 （酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关，不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同．多数昆虫在正常生理状态下，酪氨酸酶以酶原的形式存在，不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位，以完成特定的生理功能．美洲蜚蠊存在于血红细胞内，而麻蝇则仅存在于血浆中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在．昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶．昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵，并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护．在节肢动物中，酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程——防御反应和伤口愈合． 哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中，使体表着色，从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用．哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“]．酪氨酸酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生疾病如白癫疯和白化病．动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关．）作用机制：酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L．酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成黑色素，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，并与昆虫的蜕皮（蝉蜕可以入药）和（苹果）果蔬的褐化有很大关系 （黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段，第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3，4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性)，并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能．第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程．真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异构、脱羧生成5，6一二羟基吲哚(DHI)，5，6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5，6一醌(IndQu)；褪黑素生成，多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌，然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素．在第二阶段，只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤．） 活性中心：酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成．在催化过程中，双核铜离子位点以3种形态存在，分别是氧化态、还原态和脱氧态．研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、
酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展
现代生物医学进展https://www.360docs.net/doc/234462580.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.10NO.16AUG.2010 酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物研究方法进展* 刘振凯1艾 菁2耿美玉1,2△ （1中国海洋大学医药学院山东青岛266003；2中国科学院上海药物研究所上海201203） 摘要：酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases,PTKs ）在肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等相关信号通路中起到了关键的调控作用，已经成为肿瘤靶向性治疗的重要靶点。本文对靶向酪氨酸激酶的小分子抑制剂的筛选和评价方法进行综述，以期促进酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物的研究。 关键词：酪氨酸激酶；抗肿瘤药物；小分子抑制剂；抑制剂筛选 中图分类号： R730.5，R915文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2010）16-3134-04Advances in Research of Protein-tyrosine Kinases Inhibitors as Anticancer Drug* LIU Zhen-kai 1,AI Jing 2,GENG Mei-yu 1,2△ （1Marine drug and food Institute,Ocean university of China,Qingdao,266003,China;2Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201203,China ） ABSTRACT:Protein tyrosine kinases (PTKs)have long been recognized as promosing therapeutic targets involved in a variety of human diseases and in particular several types of cancer.They play important roles in regulating intracellular signal transduction path-ways closely associated with the invasion,metastasis and angiogenesis of many tumors.An effort towards the development of new and more effective PTK inhibitors represents an attractive therapeutic strategy for cancer therapy.In this paper,we review the screening and evaluation methods of small-molecule inhibitors of PTKs with a view to promote the study of PTKs. Key words:Protein-tyrosine kinases;Antitumordrugs;Small-molecule inhibitors;Inhibitors screening Chinese Library Classification （CLC ）:R730.5R915Document code:B Article ID:1673-6273(2010)16-3134-04 *基金项目：国家杰出青年科学基金资助（No 30725046） 作者简介：刘振凯（1983-），男，硕士。研究方向：分子药理学。E-mail ：lzkai111@https://www.360docs.net/doc/234462580.html, △通讯作者：耿美玉（1963-），研究员、博士生导师。E-mail ：mygeng@https://www.360docs.net/doc/234462580.html, (收稿日期:2010-05-07接受日期：2010-06-01) 恶性肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病。目前，临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，这类药物大多存在难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点[1]。近年来，随着生命科学研究的飞速发展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明，给抗肿瘤药物的研发理念带来了巨大转变。以一些与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶/蛋白作为药物靶点，筛选发现选择性强、高效、低毒的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向[2]。 蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，它们能催化ATP 分子上的γ-磷酸基转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。酪氨酸激酶分为受体型和非受体型两种。受体酪氨酸激酶是一种单次跨膜蛋白，目前至少已有近六十种分属20个家族的受体酪氨酸激酶被识别。不同的受体酪氨酸激酶和配体结合后，受体自身发生二聚化或结构重排，并进一步使受体胞内区特异的酪氨酸残基发生自身磷酸化或交叉磷酸化，从而激活下游的信号转导通路[3]。它们在信号由胞外转导至胞内的过程中发挥重要的作用。而非受体酪氨酸激酶是一种胞浆蛋白，现已经确认的有约30种，分为10大家族。蛋白酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中占据了十分重要的地位， 调节细胞生长、分化、死亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能失调则引发生物体内一系列疾病。大量资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常激活或过度表达将导致细胞无限增殖，周期紊乱，最终导致肿瘤的发生发展[4]。 同时，酪氨酸激酶调控异常还与肿瘤的侵袭、 转移，肿瘤新生血管生成，肿瘤化疗抗性等密切相关。事实上，以酪氨酸激酶为靶点进行抗肿瘤药物的开发已成为国际研究的前沿。 1酪氨酸激酶抑制剂的开发策略 目前酪氨酸激酶抑制剂的开发策略主要分为胞外、胞浆和核内三个层面：细胞外策略主要是针对于受体型，配体与受体的生物拮抗剂以及特异性抗体，通过拮抗配体和受体的相互作用，抑制酪氨酸激酶的激活[5]；胞浆内策略主要分为抑制激酶区的激酶活性和拮抗酪氨酸激酶与其下游信号分子的相互作用两个方面[6]；核内策略主要是利用miRNA 降解或者干扰酪氨酸激酶的mRNA ，抑制激酶的蛋白表达而达到抑制激酶活性的目的[7,8]。其中研究最多的是抑制激酶区激酶活性的小分子抑制剂，而本文也主要是针对这部分抑制剂的研究方法进行探讨。酪氨酸激酶的自磷酸化过程和催化下游信号分子磷酸化的过程都涉及到ATP 上磷酸基团的转移，这一反应过程是酪氨酸 3134··
酶活性及酪氨酸酶..
酶催化活性及其影响因素的研究 学院:化学与分子工程学院 班级:应用化学108班 姓名:王文移05 宁家彬06 指导老师:詹天荣
酶催化活性及影响其活性因素的研究 作者：王文移 宁家彬 [摘要]：酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探 究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH 值，抑制剂对于酶活性的影响。 [关键词]：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH ，温度，抑制剂 Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different catalytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity. [引言] 认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性，是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 酪氨酸酶是一种氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中。土豆的提取液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH 值、底物浓度以及激活剂抑制剂的影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。 1.实验原理 本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜色，多巴的吸光度。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH 值、离子强度、温度等），25℃时在1min 内转化1mol 底物所需要催化剂的量为活性单位。通过 下式可计算酶的活性：610??=ktV A a ，式中，a 为所用溶液的酶的活性，A ?为
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B，PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。 PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，
PTP-1B的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： (1)与胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。 (2)在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3(STAT-3)和Janus激酶-2(JAK-2)的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 (3)PTP-1B通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B在催乳素信号传
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告
酪氨酸酶活性抑制实验方案报告 1．1 材料： 酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 恒温仪、紫外分光光度计、离心机。 1.2 试剂配制 1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8) 精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。 2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L) 精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。 3)受试液 精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。 4)阳性对照(+CK) 精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。
5) 酪氨酸酶液的制备 以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1： 1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。 1.3 检测方法 总反应体系为5mL。具体设计见表l。 在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为 0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。 实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。 抑制率=[(A-B)/A]×l00％ 其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。 表1 5mL试验体系设计
酪氨酸酶的催化作用
酪氨酸酶的催化作用 [原理] 酪氨酸酶是一种以铜为辅基的结合蛋白酶，这种氧化酶可直接作用于底物多巴生成多巴醌，然后经过一系列的反应，最终生成黑色素。在多巴转变为多巴醌的反应中，酪氨酸酶使多巴中的氢原子的两个电子传递给分子氧，使后者转变为氧离子，游离在溶液中的两个质子与氧离子化合生成水。其催化的主要反应及电子传递过程如下： 酪氨酸是甲状腺素、肾上腺素和黑色素的前体。人类皮肤、毛发和眼睛虹膜的黑色素是酪氨酸在酪氨酸羟化酶催化作用下生成了3,4-二羟苯丙氨酸（简称多巴，DOPA ），后者在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌，而后经过一系列中间反应，最后聚合成黑色素。白化病（albunism ）是一种表现为皮肤、毛发和虹膜变白，因为缺乏酪氨酸酶而不能合成黑色素的先天性代谢缺陷性疾病。 酪氨酸酶也广泛分布于植物界，例如新鲜蘑菇、马铃薯（外层含量尤多）和谷物等。 [试剂] 1．酪氨酸溶液 0.1g 酪氨酸溶于100ml 0.1%碳酸钠溶液中。 2．马铃薯抽提液 切碎马铃薯约6g 置于研钵中，加少量净砂，研成匀浆，再加蒸馏水l0ml 充分研磨；最后通过棉花过滤，即可获得含有酪氨酸酶的马铃薯抽提液。 3．煮沸过的马铃薯滤液 取2ml 试剂2于试管内，在酒精灯上加热至沸以破坏酶的活性。 4．液体石蜡 [主要器材] 研钵、恒温水浴箱 CHCOOH 2 酪氨酸 2
[操作步骤] 取试管3支按表10进行操作 表10 试剂（滴） 1 2 3 煮沸过的马铃薯液20 —— 马铃薯抽提液—20 20 酪氨酸液20 20 20 充分混匀各管 液体石蜡—— 5 置35℃~40℃水浴约30分钟，观察并记录各管颜色，试解释所得的结果。 [注意事项] 1．煮沸马铃薯液时，小心勿使液体溅出。 2．加液体石蜡时宜斜执试管，沿管壁缓缓加入，不要产生气泡；加入的液体石蜡必需完全覆盖液面，以隔绝空气。
酪氨酸酶抑制率测定方法
1. 4念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制 1. 4. 1念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响 提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方 法[ 6, 7] , 并略作修改。待测样品用DMSO 进行浓度 梯度稀释, 浓度分别为1、05、025、0125 mg / mL; 换算成反应体系中的终浓度分别为333、1665、8325、4 3 g /mL。反应在96孔细胞板上 进行, 每组8孔, 分别是: A. 不含样品, 但含酪氨酸 酶的阴性对照, 3孔重复; B. 不含样品及酪氨酸酶的 空白对照, 1孔; C. 包含样品及酪氨酸酶, 3孔重复, D. 含样品但不含酪氨酸酶的空白对照, 1 孔。A 孔 中加入190 L pH 68、0 1 mo l/L 磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶; B 孔中加入200 L 相 同的磷酸缓冲液; C 孔中加入180 L磷酸缓冲液, 10 L 1380 U /mL酪氨酸酶, 10 L样品; D 孔中加 入190 L磷酸缓冲液, 10 L样品。然后将细胞板 在30条件下放置5 m in, 再在每孔中加入100 L 2 5 mmo l/L L-酪氨酸( 见表1 )。在30反应 10m in后, 立即置于Tecan Sunrise 酶标仪中测量在475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑 制按公式计算: 抑制率=( A - B ) - ( C- D)*100% A – B
参照文献方法〔3〕在数支干燥的试管中 各加入1.oml0.03%左旋多巴溶液，再加上维 生素E一日环糊精溶液，(加入量按表所列体积) 最后的磷酸钠缓冲液加至5.Oml，25℃恒温10 min后，加入0.4ml酶提取液，立即计时并迅速置于恒温槽内，待反应1min，用BaCRman DV一70型分光原度计在475nm处测定吸收度，以缓冲液为参比，然后根据多巴色素的消光系数“=3700求出Vi，把无维生素E一日环糊精溶液存在时速度定为100%，求出不同浓度维生 素E一日环糊精存在时酶的相对活性以及对酶的抑制率 抑制率二V。空白一V抑制V。空白x100%
新型酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模拟研究
新型酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的合成、生物活性及分子动态模 拟研究 目的:蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是新的抗肿瘤药物研究靶点。为寻找新的具有较强抗肿瘤活性的SHP2抑制剂,本课题以文献报道的SHP2抑制剂GS493,SHP836等为先导化合物,设计、合成了苯磺酸和吡嗪胺两类新的衍生物;测试了苯磺酸类衍生物对SHP2蛋白活性中 心的抑制作用;在细胞水平测试了所有化合物对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231和非小细胞肺癌NCI-H1975的增殖抑制活性;选择活性较好的化合物If、IIe进行计算机辅助的分子动力学研究,以探讨它们与SHP2作用的具体模式及对SHP2的选择性。方法:1.目标化合物的设计与合成:（1）保留GS493的苯基腙吡唑啉酮以及磺酸基团,用内脂环或酰胺代替1位苯环的硝基,3位苯环的硝基替换为氟、甲氧基等基团,设计了12个目标化合物 Ia-Il。其合成方法为:对硝基苯甲酸经酰氯化,再与胺反应形成酰胺,然后再将其硝基还原,重氮化,还原,得到N-取代-4-肼基苯甲酰胺中间体;对氨基苯磺酸经过重氮化,与取代苯甲酰乙酸乙酯耦合得到4-{2-[1-乙氧基-3-（4-取代）-1,3-二氧代丙-2-基]肼基}苯磺酸中间体,其再与N-取代-4-肼基苯甲酰胺中间体反应得到目标产物Ia-Il。（2）保留 SHP836,SHP099的吡嗪胺结构,3位引入新的芳环或芳杂环替代二氯 苯环,6位引入大位阻的取代哌嗪基团,设计了12个目标化合物 IIa-IIl。其合成方法为:以2-氨基-3-溴-6-
酪氨酸酶活性抑制实验方法
酪氨酸酶活性抑制实验方法 一、试剂：酪氨酸酶、酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、阳性对照（熊果苷粉末）、样品、去离子水 二、试剂配制： 1、磷酸盐缓冲溶液（PH=6.8）：先分别配制0.2M的磷酸二氢钠和0.2M的磷酸氢二钠。 0.2M磷酸二氢钠：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 去离子水； 0.2M磷酸氢二钠：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 去离子水； 取51ML磷酸二氢钠+49ML磷酸氢二钠即得0.2M、PH=6.8的磷酸缓冲液。 2、L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸25.6 g，用磷酸缓冲液定容于50mL容量瓶 中，即得L-酪氨酸溶液。 3、酪氨酸酶溶液：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1（W:V ）的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。 4、受试液的配制：将原先所配5mg/ml的溶液用甲醇稀释到1mg/ml.。 5、阳性对照：取熊果苷粉末0.01g，溶于10ml的甲醇溶液，即得1mg/ml的 对照品溶液。 三、实验方法： 依下表所示向试管中依次加入磷酸盐缓冲溶液、样品溶液、酪氨酸溶液，于35℃水浴10分钟。然后加入酪氨酸酶液，混匀，再在35 ℃下孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光值。
受试组用空白对照组1调零，阴性对照组用空白对照组2调零，阳性对照组用空白对照组3调零。 受试组吸光值为A1，阴性对照组吸光值为A2，阳性对照组吸光值为A3。 抑制率=1－[（A1－A2）/(A3－A2)]×100%=（A3－A1）/(A3－A2)×100% 注：受试液组共四种样品
酪氨酸解氨酶(TAL)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
酪氨酸解氨酶（TAL）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4060 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前每瓶加入5mL双蒸水和20μL浓HCl充分溶解待用。现配现用。产品说明： 酪氨酸解氨酶（TAL）广泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸次生代谢途径的关键酶之一。TAL能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）直接将酪氨酸转化为香豆酸，香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。 TAL能够分解酪氨酸产生香豆酸，其在310nm下有吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出TAL活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰、浓盐酸和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理： （1）组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 （2）细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤：
（1）紫外分光光度计预热30min，波长调至310nm。蒸馏水调零。 （2）加样表：在1mL石英比色皿中分别加入 试剂名称（μL）测定管 试剂一700 试剂二200 样品100 充分混匀后立即测定10s时在310nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A2-A1。 三、TAL活力计算： 1、按蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。 TAL（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷(V样×Cpr)÷T=333×ΔA÷Cpr。 2、按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟在310nm下吸光值变化0.01定义为一个酶活性单位。 TAL（U/g鲜重）=ΔA÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=333×ΔA÷W。 3、按细胞或细菌个数计算： 单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟在310nm下吸光度变化0.01定义为一个酶活性单位TAL（U/104cell）=ΔA÷0.01×V反总÷(500÷V提取×V样)÷T=0.667×ΔA。 V反总：反应总体积，1mL；V样：加入的样品体积，0.1mL； Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g； V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞； T：反应时间，3min。 注意事项： 1、当ΔA大于0.2或者A1大于1.5时，建议将样品用蒸馏水稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间 （5min或10min）或增加加入的样品体积来测定。
酪氨酸酶
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一种含 铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中[1]. 在植物中,酪氨酸酶一般称为多酚氧化酶;在昆虫中, 则称为酚氧化酶;在微生物和人体中,才称为酪氨酸 酶.酪氨酸酶主要参与两个反应过程:催化L-酪氨酸 羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌,多巴 醌经一系列反应后,形成黑色素.酪氨酸酶在生物体中 具有重要的生理功能.同时,它也与人体雀斑、褐斑等 黑色素过度沉积等疾病的发生有关,并与昆虫的蜕皮 和果蔬的褐化有很大关系[2]. 自从发现了人黑色素细胞可以以L-3,4-二羟基 丙氨酸(L-多巴)为底物合成黑色素,这个反应成为酪 氨酸酶活性和定位检测的基础.在之后的研究中,酪氨 酸酶成为第一个用亲和色谱纯化的酶,酪氨酸酶也是 最早发现能将酶分子内部氧原子参入到有机物中的酶;并为酶自杀性失活提供了早期实例.现今,人们已 经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了酪氨酸酶. 目前,对酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分离纯 化、催化机制、活性调控以及酪氨酸酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,在结构方面,其三维结构仍未 得到.鉴于此,对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其 调控,酪氨酸酶的合成和运输的研究也在不断发展. 酪氨酸酶的理化性质 高等脊椎动物、低等脊椎动物和原核生物的酪氨 酸酶的理化性质不同.由表1可以看到,从Strepto- myces antibioticus的272个氨基酸到Homo sapiens 的529个氨基酸,不同生物中的酪氨酸酶氨基酸数目 差异很大.虽然它们在生物体内具有相似的生理功能, 但它们的理化性质却有不同程度的差异性.酪氨酸酶 在同工酶的研究也占有非常重要的地位,是生物体内 具有同工酶的一大类酶.据研究,哺乳动物、原核动物、真菌的酪氨酸酶一般为单聚体或二聚体;而昆虫、两栖类的酪氨酸酶一般为二聚体、四聚体或五聚体等多聚体.
常用中药对酪氨酸酶的激活作用
ysis us ing d iffer ent antigen s ources.J In vest Dermatol,1990,94∶327-331. 5Hash imoto T,Kon ohan a A,Nish ikawa T.Immunob lot ass ay as an aid to th e diagnosis of unclassified cases of pemph igus.Arch Derma- tol,1991,127∶843-847. (收稿:1997-01-16 修回:1997-05-03) 常用中药对酪氨酸酶的激活作用许爱娥 王遂泉 周渭珩 白癜风是一种色素代谢障碍性皮肤病,目前尚无十分有效的治疗方法。在黑素的生物合成过程中酪氨酸酶起了关键性的作用,提高酪氨酸酶活性,就能提高黑素的合成量[1]。本实验旨在通过研究常用中药对酪氨酸酶的作用,筛选出其中具有激活作用的药物,用于临床治疗,以期能提高中药对白癜风的治疗效果。 一、材料和方法 (一)材料:实验用中药48种,包括北柴胡、炒白蒺藜、制首乌、炒僵蚕、炒乌梢蛇、炒白术、炒白芍、炒青皮、熟地黄、补骨脂、丹参、潼蒺藜、蛇床子、马齿苋、北沙参、独活、川芎、当归、桃仁、红花、三七片、菟丝子、虎杖、麦冬、旱莲草、甘草、佛手、前胡、白藓皮、紫草、乌梅、赤芍、无花果、丹皮、茯苓、党参、黄芪、枸杞、肉桂、荆芥、桂枝、地肤子、莶草、核桃、苦参、浮萍、决明子、防风。以上中药采购自杭州中药材公司,除注明炮制方法外,其余中药均为生品。 (二)方法: 1.试剂:DL-多巴、酪氨酸酶购自Sig-ma公司,其它试剂均为分析纯。 2.中药提取物的制取和酪氨酸酶活性测定按文献[2,3]的方法进行:中药粉碎后用50%甲醇水溶液浸泡,3小时后回流、过滤,再将残渣提取2次,合并提取液,水浴上挥去溶媒后将提取物溶于0.05mo l/L、pH6.5磷酸缓冲液中,制成每毫升相当于1g原 作者单位:310009杭州市第三人民医院皮肤科生药的溶液;反应混和物2ml(pH6.5、 0.05m ol/L磷酸缓冲液,70L l酪氨酸酶,中 药提取物)在37℃保温10分钟,加入1ml 0.15%DL-多巴,2分钟后立即于475nm 处测定吸光度A475。以磷酸缓冲液为空白, 以不加中药提取物的反应组为对照。此外, 将硫酸铜配成浓度为10-4、10-5、10-6mo l/ L的溶液,分别测定其对酪氨酸酶活性的 影响。 3.酶激活率的计算方法是以加中药组 测得的A475为A2,对照组的A475为A1,酶 激活率%=(A2-A1)÷A1×100%。同一 种中药取不同的浓度进行反应,以找出对 酪氨酸酶能达到的最大激活率。 二、结果 48种常用中药中,仅有13种对酪氨酸 酶具激活作用,其余35种无激活作用或呈 抑制作用。13种具激活酪氨酸酶作用的中 药以每种中药所能达到的最大激活率相 比,按从大到小顺序排列依次为旱莲草 49%、无花果38%、丹皮34%、潼蒺藜 34%、蛇床子33%、补骨脂31%、地肤子 25%、桃仁24%、白藓皮23%、白术22%、 紫草22%、肉桂21%、白芍20%。Cu6在浓 度为10-5mo l/L时对酪氨酸酶激活作用最 强,激活率为25%。 选取酶激活率较高的旱莲草、无花果、 潼蒺藜三种中药提取物先加入活性炭,沸 水浴30分钟,然后离心去沉淀,用上清液 重复酶活性测定。结果显示脱色后三种中 药均不能再激活酪氨酸酶。 三、讨论 我们选取白癜风治疗中使用概率较高 的48种中药,测定其对酪氨酸酶的作用, 结果显示仅13种对酪氨酸酶有激活作用, 按作用强弱依次为旱莲草、无花果、丹皮、 潼蒺藜、蛇床子、补骨脂、地肤子、桃红、白 藓皮、白术、紫草、肉桂、白芍。其中作用较 强的前6种是治疗白癜风的常用药。莶 草、乌梅、三七等中药对酪氨酸酶无激活作 用。13味具激活作用的中药,仅补骨脂、无 花果属呋喃香豆素类药,是传统的光化学 疗法的光敏剂,能激活酪氨酸酶活性,其余 11种中药,作用最强的旱莲草是补阴药,丹 皮、紫草清热凉血,潼蒺藜补阳,蛇床子燥 湿杀虫,地肤子清湿热,桃仁活血,白藓皮 清热解毒,白术补气,肉桂温里祛寒,白芍 补血。结果提示除传统的呋喃香豆素中药 外,其它性能的中药亦有激活酪氨酸酶的 作用。因此在治疗白癜风组方时,可优先考 虑选用上述有激活作用的中药。 参 考 文 献 1Iw ata M,Corn T,Iw ata S,et al.T he rela- tions hip betw een tyrosinase activity and skin color in h uman for esk ins.J Inves t Dermatol, 1990,95∶9-15. 2徐建国,尚靖.补骨脂对酪氨酸酶的激活作 用.中草药,1991,22∶168-169. 3Yukimits u M.中药生药对酪氨酸酶的抑制作 用.国外医学中医中药分册,1982,1∶42-44. (收稿:1997-01-09 修回:1997-10-24) 48Chin J Dermatol,Feb1998,Vol31,No.1
蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975～),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@https://www.360docs.net/doc/234462580.html,.联系人:付学奇(1960～),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究
酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 作者 摘要 关键词 一．实验目的 1.认识生物体中酶的存在和催化作用，便于我们了解生物体系中酶存在下的合成或分 解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。 2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应特别 是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 二．实验原理 许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。 生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。 通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。 本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。 由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。 其反应过程如下图所示