狂犬病的实验室检测与诊断技术

狂犬病的实验室检测与诊断技术

武汉生物制品研究所基因工程室

严家新研究员

一、狂犬病实验室检测与诊断技术的用途

1. 狂犬病人存活期内的实验室诊断：

目前尚无实验室方法可确认处于潜伏期的狂犬病人。对可能感染狂犬病毒而尚未发病（即处于潜伏期）的人应尽快接种狂犬病疫苗，必要时还要同时接种抗血清。国外文献上比较可靠的研究结果已证明，狂犬病的潜伏期可能超过6年。狂犬病疫苗在暴露后接种越快越好，但只要是在发病前，接种疫苗都会有保护作用，补种疫苗可以说没有时间限制。

狂犬病人一旦发病，其死亡率为100%。病人在发病后最初几天，检测狂犬病毒的抗原一般是敏感的，常可在其唾液、角膜印片、尿液或皮肤中检出病毒抗原。检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查。但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。皮肤活组织检查最好从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。出现早期症状时检测抗原，仅有25-50%的患者为阳性；随着病情的进展阳性率也增加。而脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天才出现。但在国内护理条件下，狂犬病人发病后，很少能维持生命7天以上。

2. 动物和人狂犬病的死后诊断：可用抗原检测、病毒分离、病毒鉴定等方法进行死因确诊和病毒来源、演化分析。

3. 测定狂犬病毒的抗体:主要用于确定人或动物接种狂犬病疫苗是否成功。

W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。前段时间国内因狂犬病疫苗假冒伪劣产品猖獗，而狂犬病疫苗的质量又是性命攸关的事，疫苗接种者主动要求在疫苗接种后测抗体的越来越多，这是可以理解的。但只要疫苗的质量和供货渠道（包括保存条件）可靠，通常并不要求每个接种者都检测抗体。因为除非接种者本身可能有免疫功能方面的异常，合格疫苗的抗体阳转率应为100%。

二、狂犬病的实验室检测与诊断的必要性

典型的狂犬病的临床表现十分典型，但也有约40%的狂犬病例属瘫痪型，其表现并不典型，很容易与其他疾病混淆，所以实验室检测手段对狂犬病的确诊非常必要。一个国家要控制狂犬病，却不能普遍应用狂犬病的实验室检测技术，甚至连一个专门的有权威的检测中心都没有，这是不可想象的。因此目前国内有关狂犬病的科研成果和相关产品以及各种相关统计资料在国外同行中的可信度不高，整个国家要制定科学的防治战略也会失去可靠的依据。为了进行狂犬病的流行病学调查和综合防治，为了对狂犬病疫苗的质量和实际效果进行监控，为了进行与狂犬病相关的基础和应用研究等，都迫切需要尽快建立和推广狂犬病的实验室检测技术。

以下再举几个具体例子进行说明。

ＷＨＯ要求狂犬病病例的统计上报资料要注明诊断的依据。仅根据临床症状而不包括实验室诊断依据的上报数字是不可靠的。在泰国进行的一项系统研究证明，狂犬病的临床表现只有约60%是典型的（表现为狂躁、怕水、怕风等），另有约40%的狂犬病的临床表现是非典型的（表现形式以瘫痪为主，临床表现与其他多种疾病很难区分）。对泰国同一时期同一地区死亡的所有病人都作是否死于狂犬病的实验室检测，结果发现，每10个经实验室检测证明是死于狂犬病的病人中，必有4人的死因原来仅根据临床症状而被错误地归类于其他疾病，实际上报的狂犬病死亡人数只有6人。这就意味着，原来根据临床表现每上报10人死于狂犬病，实际死于狂犬病的人数应为17人（10/17 ~ 0.6）。

2003年中国全年统计狂犬病的发病人数为2000人，其中绝大多数都没有实验室诊断依据，而仅根据典型的狂犬病临床表现。对同期其他因病死亡的人的确切病因的鉴定也基本不包括针对狂犬病的实验室检测。如果套用泰国的统计数字，考虑到由于缺少实验室诊断依据，可能有40%的狂犬病人的死因被错误地归类于其他疾病，因此中国2003年狂犬病的实际死亡人数可能应推断为3000人以上。

目前国际上公认狂犬病的死亡率是100%，原则上不承认有狂犬病康复的可能，即狂犬病的发病率应与死亡率相等。国内报刊上常有死亡率小于100%的报导，甚至有狂犬病被治愈的报导，由于均无实验室诊断依据，不被国际学术界承认。没有合格实验室给出的诊断依据的康复病例应从狂犬

病病例的统计数字中剔除。“狂犬病患者必死无疑，不死不算狂犬病”，要挑战这个命题，必须提供确切、完整的病史和权威的实验室诊断资料。

目前国内报刊和相关学术界公认的一些结论，如国内健康犬中狂犬病毒的带毒率高达17%甚至更高；国内的犬可长期带毒甚至传播狂犬病，而犬自身可长期不发病等，由于相关研究资料都缺少严格的实验室检测、诊断的数据；或虽有实验室数据，但所用试剂不合格，或方法不可靠，或实验设计不合理，所得结果无法重复验证，这些结果从未得到国际学术界的承认。国外学者根据狂犬病在世界各地流行规律的长期研究建立的数学模型否定了中国的犬中存在如此高的带毒率。国外学者坚持认为犬在具有传播狂犬病的能力（唾液腺中可检出狂犬病毒）后10天内必定会发病（开始出现狂犬病的症状）。希望国内学者今后在坚持自己的不同观点时能同时提供更令人信服的实验室检测数据。

三、对安全操作的建议

所有可能涉及活的狂犬病毒的操作均应在P2或P3生物安全实验室内进行。

由于对血清1型以外的狂犬病相关病毒的致病性还不很了解，所有可能含有这些病毒的标本的操作均应在生物安全柜内进行。

所有狂犬病实验室工作人员务必进行狂犬病疫苗的暴露前免疫，这些人员的中和抗体应定期检查，意外地暴露于感染时必需立即报告负责人。

四、狂犬病毒抗体的检测

W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。

1992年第八届WHO狂犬病专家委员会推荐将小鼠中和试验(MNT)和RFFIT（快速荧光灶抑制试验, Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test）作为检测狂犬病毒中和抗体的两项基本方法，这两种方法应作为其它方法的基准和参考。

MNT是从上世纪30年代就开始采用的经典方法。自上世纪70年代初开始，RFFIT逐渐成为国际上最广泛接受的对MNT的替代方法。WHO专家委员会建议在可能时尽量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、价廉，且灵敏度与MNT相同。

1.小鼠中和试验（Mouse neutralizing test, MNT）

原理：将一定量预先滴定好的攻击病毒，与待滴定的系列稀释血清混合均匀在37℃保温1小时(进行体外中和反应)。反应结束后，血清中的有效抗体效价越高，残存的病毒越少(试验中需设已知滴度的参照血清)。然后将残存病毒/血清混和物颅内接种10-12克小白鼠，观察并记录小鼠发病及死亡情况，计算死亡率和保护50%动物的血清稀释度。

特点：

可定量检测狂犬病毒中和抗体效价。

需专门技术培训，操作较繁琐。

需14天出结果，耗时长，不利于快速诊断。

需较多试验小鼠，成本高。

动物间的个体差会影响试验结果。

2. 快速荧光灶抑制试验（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test，RFFIT）

基本实验过程：

将固定剂量的CVS病毒与系列稀释的待测血清(包括已知滴度的参考血清)一起在96孔细胞培养板中37℃温育1小时(体外中和反应)。

病毒的最适剂量在预实验中预先确定，为经24小时温育后能使80%的细胞感染(产生荧光包含体)的最高稀释度。

中和反应结束后在每孔中加入等量敏感细胞(BSR)悬液。

再经24小时温育后, 细胞单层用丙酮固定, 用荧光标记的抗NP抗体染色, 以检测未被中和的残余病毒的存在(荧光灶FFU)。与病毒对照组比较, 计算每种待测血清使固定量CVS病毒的荧光灶数目(FFU/ml) 减少50% 的稀释度，然后与已知滴度的参考血清比较，计算每种待测血清的中和抗体滴度。以下显示的是狂犬病毒在BSR细胞中形成的荧光灶：

3. 酶免疫吸附法（ELISA ）：

酶免疫吸附法是上世纪七十年代建立的方法，目前世界上用于检测狂犬病毒抗体的酶免疫法基本上是采用间接ELISA 法，其吸附抗原有全病毒颗粒、纯化的狂犬病毒糖蛋白以及纯化的狂犬病毒核衣壳蛋白（RNP ），并以过氧化物酶标记的抗抗体作为标记抗体，即可检测人及不同动物血清中的抗狂犬病毒抗体。

以下是本室制备的ELISA 试剂盒的原理图。与所有其他ELISA 试剂盒不同的是，本室的试剂盒在制备时，首先用抗狂犬病毒单抗包被，然后才加狂犬病毒抗原。这样，只有与狂犬病毒单抗能反应的狂犬病毒抗原才能吸附在酶标板上，狂犬病毒抗原以外的的杂质吸附在板上的机会大为减少，

ELISA 只需简单的实验室设备，尤其适合检测大量的血清样品，且在很短的时间内即可出结果。 ELISA 法与MNT

有较好的相关性，在小鼠饲养及组织培养不具备的实验室里，ELISA 可视为MNT 的替代方法。

影响ELISA 结果的一些可能因素：

1. 严格地讲，ELISA 实验并不是测定真正的中和抗体，所测抗体为所有能与包被板上抗原结合的IgG 抗体，包括一些非特异性抗体，所以其结果不用国际单位（IU/ml ）表示，而是用等价单位（EU/ml ）表示。

2. 试剂盒的质量和有效期：目前市面上的ELISA 试剂盒，大部分尚未获得国家批准文号，质量不过关或结果不稳定。此类试剂盒对低温保存的条件要求高，保存时间短，即使在标称有效期内，结果也常会随时间的推移有所降低。

3．国内有些试剂盒所用的原料抗原来自国产疫苗的半成品，而且未经严格纯化。特别是如果生产疫苗的细胞为地鼠肾细胞，生产试剂盒所用抗原含有地鼠肾细胞的抗原，则接种了这种用地鼠肾细胞生产的疫苗的病人用这种试剂盒测抗体会得到效价很高的结果，而事实上此人真正能中和狂犬病毒的抗体可能很低，ELISA 结果所显示的实际上可能大部分是针对地鼠肾细胞的抗体。

值得注意的是，国内的乙脑等疫苗也是用地鼠肾细胞生产的，国内接种过这类疫苗的人很多，即使是很久以前接种过，体内也普遍存在针对地鼠肾细胞的免疫记忆效应，再次接种含地鼠肾细胞抗原的疫苗后，相应抗体很容易迅速升高。

由于上述原因，用这样的试剂盒去检查高度纯化的狂犬病疫苗（如完全不含地鼠肾细胞抗原的

维尔博疫苗）接种者的抗体，结果可能反而会偏低。

4．RFFIT检测狂犬病毒抗体的灵敏度可达0.1IU/ml,而即使是国外合格的ELISA试剂盒，检测的灵敏度有时也达不到0.5IU/ml。所以如果ELISA检测的结果为阴性, 一般需换用MNT或RFFIT 进行检测，而不能直接下结论。这通常仅发生在抗体偏低的情况下（但也可能刚刚超过WHO规定的0.5IU/ml的合格标准）。由于合格狂犬病疫苗在全程接种后绝大多数情况下抗体滴度都很高（＞10IU/ml），全格的ELISA在大多数情况下能给出肯定的结果。

5. 待检血清的质量：如血清含较多溶血成分，或未在低温保存，或反复冻融次数过多，都会影响检测的结果。

4. 间接免疫荧光法（IFA）：

以狂犬病毒感染细胞，制成细胞片，用间接免疫荧光法检测人血清中狂犬病毒抗体。该方法只能作半定量测定抗狂犬病毒抗体，其灵敏度随待测血清的稀释度增加而降低，同时与细胞片制备过程中病毒接种的量及感染时间长短有关。

五、狂犬病毒抗原的检测

1. 免疫荧光（IF）法检测狂犬病毒抗原

我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体制备荧光结合物，经法国巴斯德研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等动物来源的样品（如脑组织涂片），证实我们的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高的特点，质量优于法国的产品。

2. 快速狂犬病酶免疫诊断法（Rapid Rabies Enzyme Immunodetection，RREID)

技术特点：

操作方便、快速灵敏，适于大量样本的检测。

本试剂盒中酶标板包被后需立即使用或保存于-20℃备用。

肉眼观察：阳性对照显黄颜色，阴性对照完全无色。所有显黄色样品，无论深浅均认为是阳性。这种肉眼观察已足够作出诊断，非常经济，因为不需要昂贵的酶标仪，也最适合于作现场流行病学调查。

酶标仪读数：仔细擦净平板底面，用450nm滤光片读数。

福尔马林固定的样品不适宜作RREID。

3. 基因扩增(PCR)及检测

PCR技术于1990年首次用于检测狂犬病毒RNA，近几年来狂犬病毒分子流行病学研究的进展都与该技术的应用有关。

对原始样品中的微量病毒RNA经逆转录(RT)产生cDNA后，再经PCR进行放大。

对放大产物可根据诊断或分型的不同需要分别用不同方法进行分析，如凝胶电泳、斑点杂交、限制性片段长度分析(RFLP)、直接测序等。

与传统的病毒分离或免疫学检测法相比，PCR在敏感性、特异性、特别是在能提供精确的序列资料等方面都要优越得多，因此有希望更广泛地用于狂犬病的常规检测及分子流行病学研究。

狂犬病毒PCR检测时目标基因的选择：在选择狂犬病毒基因组中的目标基因时，为诊断的目的应选基因组上的保守区。为分型及鉴别变异株应选易变区。

PCR产物的琼脂糖凝胶电流电泳图谱

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4. 狂犬病毒G基因的序列测定和系统树进化分析

1981年测定了狂犬病毒G基因全序列，随后几年里，又对几株狂犬病毒的部分或全部基因进行了测定。通过系统的序列分析，对各毒株之间的相互关系有了进一步了解，明确了狂犬病毒分类的分子基础。

将狂犬病毒的核酸、氨基酸序列与已知的生物学和免疫学特性联系起来，可以预测或确定病毒的抗原决定簇、病毒致病性的分子基础，以及决定病毒感染、复制和变异等重要功能的氨基酸区域。

这些结果对研制狂犬病毒新型疫苗及能抑制狂犬病毒感染和复制的药物有重要的指导作用。

狂犬病的潜伏期到底能有多长？

PCR技术应用于狂犬病毒来源鉴定的一个精彩例证：美国CDC的Smith等对从美国3名狂犬病死者分离的毒株的鉴定。死者均为移民，其一移民时间已达6年。由于在美国感染狂犬病的机会极少，而且PCR／序列分析的结果直接证明分离株分别与死者来源国家的狗中流行的毒株相同，所以该作者以迄今最令人信服的方式证明了狂犬病的潜伏期可长达6年以上。

我所与法国巴斯德研究所狂犬病毒研究室的一项关于中国和亚洲地区狂犬病毒分子流行病学研究的合作研究的初步结果表明，所分析的从中国和亚洲地区收集的五十三个毒株都属于狂犬病毒属的基因1型，而当前使用的狂犬病疫苗(基因1型)总的来讲仍能有效对抗属于基因1型的狂犬病毒街毒株。

中国目前尚未发现狂犬病相关病毒。因这方面的研究尚未系统进行，尚无法判定中国是否存在这些病毒。今后应加强这方面的研究工作。除直接从动物(如蝙蝠)中搜寻ＲＶ外，可重点从疫苗免疫失败的病人或动物中分离和鉴定病毒。我所与法国巴斯德研究所以及国内相关单位正在协作开展此项研究。欢迎全国各地疾病控制中心与我所合作开展此项研究工作。