基质辅助激光解吸电离_飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

收稿日期:2004211228;修回日期:2004212223

作者简介:陈海霞(1974～),女(汉族),山东利津人,副教授,工学博士,从事天然产物化学研究。E 2m ail :chennhxx @yahoo .com .cn

第26卷第2期

2005年5月

质谱学报

Jou rnal of Ch inese M ass Spectrom etry Society

V o l .26　N

o .2M ay 2005

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

陈海霞,高文远

(天津大学药物科学与技术学院,天津　300072

)

[作者简介]:陈海霞,2002年7月获华中农业大学食品

科技学院工学博士学位,研究方向为天然产物化学;

2002年7月—2004年7月在中国海洋大学药物与食品

研究所从事博士后研究工作,研究方向为糖生物学和糖化学。参与国家基础研究重大项目(973)及国家自然科学基金项目等多项研究工作,在国内外发表论文18余篇,其中以第一作者发表SC I 论文3篇。

摘要:综述了基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱

(M ALD I 2TO F 2M S )的发展、

在糖类化合物结构研究时常选用的基质,以及在不同类型糖化合物分析中的应用。M ALD I 2TO F 2M S 在糖类分析中通常采用的是N 2激光源,基质多为有机小分子如2,52二羟基苯甲酸、2,

4,52三羟基苯乙酮、12羟基异喹啉或22羟基252甲氧基苯

甲酸、Α2氰基242羟基2苯丙烯酸等,基质类型的选择则要取决于糖类的存在形式。糖类化合物如中性糖、酸性糖、

硫酸化糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等均可利用适合的基质而进行M ALD I 2TO F 2M S 分析。

关键词:基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱;基质;糖类化合物

中图分类号:O 657163;O 62911 文献标识码:A 文章编号:100422997(2005)022108207

Appl ica tion of M a tr ix -a ssisted La ser D esorption -Ion iza tion

T i m e of Fl ightM a ss Spectrom etry i n Study on

Carbohydra tes and Glycocon juga tes

CH EN H ai 2x ia ,GAO W en 2yuan

(Colleg e of P ha r m aceu tica ls &B iotechnology ,T ianj in U n iversity ,T ianj in 300072,Ch ina )

Abstract :T he developm en t and app licati on of m atrix 2assisted laser deso rp ti on 2i on izati on ti m e of fligh t m ass sp ectrom etry (M ALD I 2TO F 2M S )to the analysis of carbohydrates and their con jugates w ere review ed .T he M ALD I 2TO F 2M S in strum en tati on ,sam p le p rep ara 2ti on ,M ALD I m atrices and app licati on of M ALD I 2TO F 2M S to vari ou s carbohydrate struc 2tu ral typ es w ere discu ssed .T he n itrogen lasers that em it at 337nm (U V range )w ere al 2m o st un iversally em p loyed fo r M ALD I 2TO F 2M S analysis of carbohydrates and their con ju 2

gates.Som e o rgan s m all m o lecu lar com pounds w ere the comm on ly u sed M ALD I m atrices such as2,52DHB(dihydroxybenzo ic acid),THA P(2,4,62trihydroxyacetop henone),12 H I Q(12hydroxyisoqu ino line),22hydroxy252m ethoxybenzo ic acid and42HCCA(Α2cyano242 hydroxycinnam ic acid)et al.T he selecti on of M ALD Im atrices dep ended on the typ e of car2 bohydrates.Carbohydrates and glycocon jugates including neu tral carbohydrates,acidic car2 bohydrates,su lfated carbohydrates,glycop ro tein s,p ro teoglycan s,glyco li p id cou ld be ana2 lyzed by the app licati on of m atrix2assisted laser deso rp ti on2i on izati on ti m e of fligh t m ass sp ectrom etry w ith the app rop riate m atrices.

Key words:m atrix2assisted laser deso rp ti on2i on izati on ti m e2of2fligh t m ass(M ALD I2TO F2 M S);m atrix;carbohydrates;glycocon jugates

越来越多的研究表明,糖类除了作为能量与结构物质外还具有多种生物学功能,因此糖类化合物成为继蛋白质、核酸之后生命科学领域中的又一研究热点。糖类的结构与其功能密切相关,所以糖的结构研究直接影响着生命科学中糖生物学的发展。糖类化合物的结构是相当复杂的,生物体内的糖类化合物难于纯化且极其微量,因此寻找快速、灵敏的糖链结构分析方法成为糖链研究领域的关键。在糖结构研究的诸多方法中,质谱被认为是一个重要的不可缺少的手段,特别是基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱(M ALD I2TO F2M S)的出现,以其灵敏快捷、直观准确、极高的质量上限、良好的“软电离”性质、对杂质的包容性及可直接分析混合物而无需预分离的特点,广泛应用于生物化学领域。M AL2 D I2TO F2M S在糖研究中的应用,也显示出强大的潜力和应用前景。本文就近年来M ALD I2 TO F2M S在糖类化合物研究中的应用进行综述。

1　基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱M ALD I2TO F2M S发展于20世纪80年代中后期,是由德国科学家Karas和H illenkam p 等首创[1]。M ALD I2TO F2M S是将被分析物的溶液和某种基质(多为有机小分子)溶液按适当比例混合,蒸发溶剂,使被分析物与基质共结晶,再用一定波长的脉冲式激光进行照射从而得到质谱图。基质分子必须能有效吸收激光能量,使基质分子和样品投射到气相并得到电离。M ALD I2 TO F2M S产生的分子离子十分稳定,不易裂解,所以被成功应用于蛋白质、寡糖、多糖、糖蛋白及蛋白聚糖、糖脂等生物分子的结构研究中。据报道[2]在分析糖蛋白及衍生化糖时M ALD I2TO F2M S的灵敏度比快原子轰击质谱(Fast A tom Bom bardm en M ass Sp ectrom etry,FAB2M S)提高10～100倍。M ALD I2TO F2M S的灵敏度与仪器的激光光源、仪器类型及基质的选择等多种因素有关。

111　激光源

在M ALD I2TO F2M S质谱仪中通常采用的是N2激光源(发射波长337nm)来分析生物大分子,另外也有采用红外范围的激光光源来分析脂类、糖蛋白及糖链的研究。如B erkenkam p 等[3]研究了中红外激光源-铒(E r)激光光源在糖蛋白及免疫球蛋白分析中的应用。采用红外激光源的测定中样品的消耗量超过紫外激光源测定的两倍,而且当测定化合物相对分子质量(M r)大于20k时亚稳离子才比较少,因此只是在测定分子质量大的化合物时具有较好的分辨率。

112　基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪M ALD I2TO F2M S应用脉冲式激光,采用的是飞行时间质谱计,因此是测定大分子最理想的质谱仪。

113　基质的选择

在M ALD I2TO F2M S测定中基质的性质及样品的制备方法对获得理想的质谱图非常关键。基质的作用是稀释样品,吸收激光能量及解离样品。基质与样品的晶体形态、样品与基质比率对谱图质量都有影响。采用M ALD I2TO F2M S时首先要选择适合待分析样品的基质,糖类的存在形式有中性糖、酸性糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等,各类糖化合物分析时常用的基质概述如下。

1.3.1　中性糖M ALD I2TO F2M S质谱分析所用的基质　在糖分析中应用最早的基质是32氨基242羟基苯甲酸,由于它的灵敏度较低,很快被

901

　第2期 陈海霞等:基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

2,52二羟基苯甲酸(2,52D ihdroxybenzo ic acid ;2,52DHB )替代。2,52DHB 可以与大多数中性糖

形成适宜的晶型,从而形成[M +N a ]+、[M +K ]+

、

[M +L i ]+等多种离子,是中性糖分析时应用最广泛的基质。另外还有多种二羟基苯甲酸取代物可以作为中性糖分析时的基质,但它们产生的信号都较弱,除非分子中有邻位羟基的存在。研究表明,基质分子的基本条件是要同时存在氢的给体和受体。基于这一原则,除2,52DHB 以外的能形成共轭体的基质如1,42二羟基222萘酸也被研究和应用[4]。

为了提高灵敏度与分辨率,2,52DHB 也常和其它物质混合形成混合基质应用。少量其它基,形成均一晶体,增强离子化强度和减少亚稳离子的生成。现已应用的混合基质主要有22羟基252甲氧基苯甲酸、岩藻糖、12羟基异喹啉(12H I Q )和2,52DHB 的混合物,阿魏酸和岩藻糖以及52甲氧基水杨酸、岩藻糖和2,52DHB 的混合物,32氨基喹啉和Α2氰基242羟基2苯丙烯酸(42HCCA )混合物等,这些混合基质应用于糖的分析可明显提高信号强度。图1即为采用2,52DHB 和12H I Q 混合基质且添加0.25m o l L L i C l 、N aC l 、KC l 和C sC l 四种盐溶液后麦芽七糖的M ALD I 2TO F 2M S 分析谱图[5]。在混合基质的作用下,麦芽七糖形成[M +

N a ]+

、

[M +K ]+、[M +L i ]+和[M +C s ]+等四种离子,信号强度明显提高

。

图1　采用2,5-D HB 和1-H IQ 混合基质麦芽七糖的正离子M ALD I -T OF -M S 分析图

F ig .1　Positive ion M ALD I -T OF -M S spectru m of ma ltoheptaose fro m 2,5-D HB and 1-H IQ

与2,52DHB 相比,基质32氨基喹啉具有较

低的背景和较高的分辨率。M etzger 等[6]

用32氨基喹啉成功地分析了M r 为6k 的植物多糖,但这种基质升华太快,而且32氨基喹啉还可与还

原性糖形成希夫碱,特别是酸性环境中42HCCA 存在的情况下,由于这些缺点限制了其在糖类研究中的应用。Β2咔啉类化合物和被分析物混合后由于在样品表面形成高度均一化的晶体也是一类很好的基质。但是Β2咔啉类化合物更多的产生[M +H ]+离子,对一些M r 低的中性多糖还会

产生[M 2H ]-离子,限制了它的使用。巯基苯并噻唑也是一类适合于糖类分析的基质,特别是在分析高甘露糖型N 2糖链时,其信噪比和分辨率

明显优于2,52DHB 。另外,脎类、阿魏酸、羟基乙酰苯、阴离子搀杂剂等基质也在糖类结构分析中有所应用。

1.3.2　酸性糖M ALD I 2TO F 2M S 质谱分析所用的基质　酸性糖中由于有糖醛酸、唾液酸或硫酸基团的存在,结构分析时所用基质与中性糖并不完全相同。含唾液酸的N 2糖链用2,52DHB 作基质时检测灵敏度很低,并且不产生唾液酸的信号,但如果将精胺和2,52DHB 混合进行负离子模式下分析唾液酸化糖即可获得较好的效果。

Pap ac 等[7]

的研究发现62巯基222甲基胸腺嘧啶(62aza 222T h i o thym ine )在测定酸性糖时比常规

基质具有较高的灵敏度,比2,52DHB 高10倍,测定N 2连接糖链检测限可达50fm o l ,但有时会引起羧基及唾液酸的丢失。另外,2,4,52三羟基苯乙酮(2,4,62T rihydroxyacetop hone ,THA P )和柠檬酸铵的混合基质对唾液酸化糖的检测灵敏度很高,这主要是由于干燥过程中形成的晶型好,基质的背景干扰小。

1.3.3　硫酸化糖M ALD I 2TO F 2M S 质谱分析所用的基质　硫酸化糖类由于含有不稳定的硫酸基,用常用的基质对其进行M ALD I 2TO F 2M S 分析,产生的结果往往不稳定,因此多种新的基质被研究和应用。研究表明Β2咔啉类化合物以及12硝基咔唑由于吡啶环结构的存在比较适合

硫酸化糖的分析。而D ai 等[8]发现72氨基242甲基香豆素对单硫酸化二糖是一种很好的基质,但72氨基242甲基香豆素在离子化过程中形成的离子可以影响检测,将其和A T T 混合后进行样品准备,采用两层结晶的方法,然后再进行真空干燥,这样可以消除基质离子的影响,对硫酸化三糖和四糖产生较好的信号。另外,72氨基242甲基香豆素与还原末端含有甲氧羰基辛基的糖复合物可以形成好的晶形,产生很强的信号。对含有

11质谱学报 第26卷　

N2乙酰神经氨酸的硫酸化糖,可以加入一定量的氯化钠使形成占绝对优势的[M+N a]+,从而利于离子峰的辨认。

1.3.4　糖蛋白M ALD I2TO F2M S质谱分析所用的基质　糖蛋白是蛋白质被糖基化后的产物,上述糖类的一些基质如2,52DHB和42HCCA 也可以对糖蛋白进行M ALD I2TO F2M S分析,但是当糖蛋白相对分子质量大于5000时,由于不能有效地使被分析物电离,信号强度明显减弱。P itt等[9]证实2,62二羟基苯乙酮(2,62D ihy2 droxyacetop henone)是糖蛋白分析时有效的基质,可能是苯乙酮的存在产生了大量的微小亚稳离子碎片。在2,62二羟基苯乙酮中加入磷酸氢二铵和柠檬酸盐的缓冲溶液有利于离子化的发生,可以提高质谱分辨率。而2,4,52三羟基苯乙酮对含有唾液酸或不含唾液酸的糖肽分析效果都很好。此外32氨基喹啉、芥子酸和阿魏酸等多种基质也都在糖蛋白的分析有所应用。

1.3.5　糖脂M ALD I2TO F2M S质谱分析所用的基质　在糖脂中应用较多的基质主要有2,52 DHB、1,52二氨基萘(1,52 D iam inonap h thalene)、42羟基苯甲酸(42H y2 drazinobenzo ic acid)、62巯基222甲基胸腺嘧啶(62aza222th i o thym ine)等。这些化合物均可适宜于正离子模式和负离子模式,但在负离子模式中具有更好的分辨率和信噪比,且碱性盐形成少,碎片少。H arvey[10]比较了一系列基质对神经鞘脂类(从神经鞘氨醇到神经节苷脂)结构分析的影响,发现基质2,52DHB、42HCCA及七叶苷原(6,72H ydroxy2coum arin)分析中性糖脂时能够给出较强的信号,而酸性糖脂最好采用2,52 DHB基质分析,主要由于其可减少酸性糖脂中唾液酸及二氧化碳的丢失。

114　样品的制备

糖类化合物在天然状态下往往存在于混合体系中,因此首先要对糖类化合物进行分离纯化,需要注意的是防止糖的降解与基团的丢失。另外糖类样品中盐离子的存在不利于M ALD I2 TO F2M S分析时的离子化和结晶的形成,一般需要脱盐处理。脱盐的方法有多种,如采用透析膜、离子交换层析(阴离子和阳离子)和疏水层析等。

糖类化合物难于离子化,因此常采用衍生化的方法以提高其检测灵敏度。常用的衍生方法主要有还原胺化法和羰基衍生法等。M ALD I2 TO F2M S分析中糖类常用的衍生剂列于表1。糖链的衍生明显提高了检测灵敏度,如T akao 等[11]采用ABD EA E标记N2连接糖链后再进行M ALD I2TO F2M S分析,灵敏度比单独的糖链提高1000倍。

表1　M ALD I-T OF-M S分析中糖类常用的衍生化试剂

Table1　D er iva tives applied i n the ana lysis of carbohydra te by M ALD I-T OF-M S

衍生化试剂D erivative agent缩写A bbreviative nam e 42氨基苯甲酸(22二乙胺)乙酯22(diethylam ino)ethyl42am inobenzoate ABD EA E

22氨基吡啶22am inopyridine22A P

42氨基苯甲酸乙酯ethyl42am inobenzoate ABEE

42三甲基氨基苯胺42tri m ethylam inoaniline TM A PA

22氨基苯甲酸22am inobenzo ic acid22AA

22氨基苯甲酰胺22am inobenzam ide22AB

3,6,82三磺酸基212氨基萘12am inopyrene23,6,82trisulfonic acid A PT S

22氨基吖啶酮22am inoacridone22AM A C

2　M ALD I-T OF-M S在糖类化合物分析中的应用

Karas等[12]首先采用M ALD I2TO F2M S分析了水苏四糖,从此开辟了糖类化合物分析的新途径。随着不同质谱分析仪与基质辅助激光解吸电离技术的共同使用,M ALD I2TO F2M S新技术显示其快速、准确、高灵敏度的特点,在糖类化合物的结构分析上有了更进一步发展。

211　在中性糖和酸性糖结构分析中的应用M ALD I2TO F2M S技术产生的分子离子十

111

　第2期 陈海霞等:基质辅助激光解吸电离2飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

分稳定,不易裂解,因此可直接分析具有不同糖残基数的糖混合体。一些植物多糖、海藻多糖及环糊精等碳水化合物可通过酶法或化学方法降解以获得直链且相对分子质量较小的糖组分,从而进行M ALD I2TO F2M S分析。

Stah l等[13]采用32氨基喹啉作为基质M ALD I2TO F2M S质谱分析菊粉中的果聚糖,可检测的果聚糖的最大相对分子质量可达10k。

D aas等[14]将果胶部分酶解,获得任意长度的寡聚半乳糖全酸,即可采用基质2,52DHB作质谱分析。而木聚糖由于多含有分支,常采用内切木糖酶酶解,形成相对分子质量为400～1000的碎片,经硼氢化物还原后作M ALD I2TO F2M S 分析。另外,Yam agak i等[15]分析罗望子木聚糖时,首先用半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶处理样品,在源后衰减模式(PSD)下,用M ALD I2PSD2M S 分析了所获得七聚糖重复单元的结构。结果表明,含四个Β124连接的葡萄糖残基和三个1～6连接的木糖残基。同样海藻多糖如昆布多糖等也是部分降解使糖链长度在20～50单位范围内,为了增加古洛糖醛酸和甘露糖醛酸的识别,常采用甲基化预处理。

E rra2B alsells等[16]使用M AL2 D I2TO F2M S对M r范围在2000～45000的磺酸化木糖2甘露聚糖进行了分析,并比较了不同基质对磺化糖复合物测定的影响,其中2,52 DHB和12羟基异喹啉的混合基质最适合。

212　在糖蛋白分析中的应用

M ALD I2TO F2M S质谱在糖链特别是糖蛋白中N2连接糖链的结构分析中得到了广泛的应用。相对分子质量较小且含有较少糖链的糖蛋白可直接应用M ALD I2TO F2M S分析,如图2中对卵清蛋白的分析,由于其只有一个糖基化位点且只含有4条糖链,因此可明确分析其糖基化方式[17]。而对于大分子糖蛋白由于分辨率不够,不能直接进行糖形的分析。对于不能直接分析的糖蛋白,常采用两种策略,即去除糖链或降解蛋白质成为较小的肽段。采用化学方法、外切糖苷酶或内切糖苷酶的方法切除糖链,分析去除糖链前后蛋白质相对分子质量的变化,从而获知糖基化信息。如Gleizes等[18]测定了糖肽酶F(Pep tide2 N2glyco sidase F,PN Gase F)酶解前后糖蛋白的相对分子质量分别为12230和12309,说明N2糖链的相对分子质量为1036,推测N2糖链的组成为(H ex)3(Glc NA c)2(Fuc)1。当待分析的糖蛋白含几个糖基化位点时,则进一步采用唾液酸酶、糖肽酶或O2糖苷酶分析,而且由于多个糖基化位点的存在,需要裂解蛋白后分别测定获知每一糖链的相对分子质量。糖基序列的确证需要M ALD I2TO F2M S与外切糖苷酶结合分析

。

图2　采用基质2,4,6-THAP的卵清蛋白

M ALD I-T OF-M S分析

F ig.2　L i near M ALD I-T OF-M S spectru m

of ova lbu m i n recorded fro m2,4,6-THAP

糖蛋白中N2糖链结构的M ALD I2TO F2M S 分析已有研究,如核糖核酸酶B、对酰基硫酸酯酶A及免疫球蛋白中N2连接糖链均可采用糖肽酶F降解后进行M ALD I2TO F2M S分析。而Ku ster等[19]采用M ALD I2TO F2M S与外切糖苷酶阵列结合的方式成功分析了胶上酶解释放的艾滋病毒糖蛋白(H I V gp120)的N2糖链结构。另外由于含有唾液酸取代的糖链,在正离子模式下碎片的信号强度随唾液酸数量的增加而减弱,因此M ALD I2TO F2M S还可以对含有唾液酸的糖复合物进行半定量分析。对糖蛋白中O2连接糖链的研究也有报道,H uang等[20]使用氨基Β2消除反应,将糖蛋白中O2连接糖链解离出来,以2,52DHB为基质用M ALD I2TO F2M S分析了糖序列。采用M ALD I2TO F2M S还可以分析糖蛋白中糖基化的差异。

213　在糖脂分析中的应用

M ALD I2TO F2M S在脂质多糖的结构测定也得到了应用。Juhasz等[21]首次应用M ALD I2 TO F2M S分析了神经节苷脂。有些糖脂由于M r 小而可直接检测,但由于难于确定碳原子的归属(酰基或神经酰胺),因此常采用气相色谱2质谱

211

质谱学报 第26卷　

(GC M S)技术与M ALD I2TO F2M S联合分析。Sch roder等[22]通过GC M S技术与M ALD I2 TO F2M S及核磁共振等技术分析了糖脂结构,从而发现酰化胆甾半乳糖苷是Bo rrelia中发现的一个新的免疫结构域。Kaw ahara等[23]以2,52 DHB为基质,M ALD I2TO F2M S正离子模式质谱分析从Sadhesiva分离的鞘糖脂中的侧链是四糖结构。L udw iczak等[24]将肺结核分支杆菌中类脂阿拉伯甘露聚糖温和酸水解解离出甘露聚糖,用A PT S标记后以2,52DHB和52甲氧基芥子酸9∶1混合作为基质进行M ALD I2TO F2M S 分析。F riedl等l[25]同样也采用M ALD I2TO F2 M S技术分析了从猪寄生的线虫中分离出的鞘糖脂中的糖链。

3　展　望

M ALD I2TO F2M S已经被证实是一种快速、灵敏的糖及其缀合物结构分析技术。M ALD I2 TO F2M S可以直接确定糖类化合物的相对分子质量,结合专一性外源糖苷酶的降解分析,可以确定糖基连接方式和结构异构,而且还可以进行定量。另外,M ALD I2TO F2M S还可测定蛋白质与糖的相互作用,用于糖类化合物化学合成产物的检测。总之,M ALD I2TO F2M S在糖类化合物分析领域已有了长足的发展,可以预测M ALD I2 TO F2M S将在糖化学和糖生物学领域发挥更大的作用。

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质谱学报 第26卷