细胞转染成功与否的八大要素

摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于

知己知彼，方能百战不殆。做细胞转染也一样道理。细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。

要素一：细胞

分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。

传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。

培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。

支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使非典型转染或转染效率偏低。这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。

要素二：载体DNA

一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。

载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。

载体构造(启动子/增强子/ORI)—转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和SV40)的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原(如，COS);而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。

除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。

要素三：组织培养试剂

一般原则：优化您的细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。

基础培养基——培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。配置时要使培养基务必避光保存;因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。

胎牛血清——血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。

添加剂——某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质(如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等)。

CO2培养箱——细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95%的CO2培养箱。用CO2是为了控制pH值，细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。有些培养基需要CO2 浓度为5%来有效控制pH值，而另一些则需要10%的CO2。需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2)则会导致实验结果的板间变异。来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。

要素四：使用瞬时转染来生产蛋白瞬时转染表达蛋白

以往为了获得蛋白质的高表达产量，必须先转染细胞，然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间，这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。如果是因为转染试剂具有细胞毒性，那么只有少数细胞能够存活，从而导致蛋白质的产量很低。而如果是因为转染成功的细胞太少，那么那些未转染的细胞生长速度大大超过转染成功的细胞，其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂，就可获得蛋白质的高表达。

现将一些影响蛋白高效表达的关键因素分列如下：

细胞系(有些类型的细胞比其他细胞产量高)

质粒骨架(例如：增强子，启动子，转录调控元件)

目的蛋白(有些蛋白很难获得高表达量)

目的蛋白的cDNA序列(例如：密码子的优化)

培养条件(营养物，代谢废物，转染抑制物)

当这些因素都得到优化，并加入合适配比和数量的转染复合物(转染试剂-质粒)后，就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。

要素五：瞬时转染和稳定转染

制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目的基因的载体。选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。

一旦选好了质粒载体，无论瞬时或者稳定表达都采用一样的转染方法。在加入选择性试剂之前，被转染的细胞至少要在标准培养基中培养过夜。这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。那些未成功转染质粒的细胞即被杀死。而只有那些成功转染的细胞能够生长。有的时候，还可以将选择性试剂持续加入到培养基中，以维持对细胞的选择压力。

要素六：转染方案

一般原则：建立一套适当的转染方案;首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。

转染复合物的制备——诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。

转染试剂/DNA配比(负载比)——所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。

形成转染复合物所用的稀释剂——对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基或盐溶液中形成。

转染复合物的加入——有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者2.将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。

要素七：时间进度

一般原则提示：要确保最终结果的成功;建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。

转染的开始——在转染前12小时，将细胞分种于培养板中。在细胞达到50-80%的融合率时开始转染，这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的融合。细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。在这段时间后，就不会再发现转染效率有所增长。

培养基更换——某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行，那么这一步骤就必不可少。而对于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂时，如果有足够的培养基用于后续表达阶段，就可以省略这一步。如果将转染复合物留在培养基中直到进行检测，那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高，而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除，但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。如果转染细胞需要生长3-7天，换培养基就尤其重要，这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。

时间测定——转染开始后的24-48小时内，报告基因产物的浓度逐渐增加;而这种增加取决于增强子的强度、表达外源蛋白中所涉及的细胞反应，存活细胞的健康状态，以及营养因素等。在转染后等待3-7天收集蛋白进行纯化较为常见了。

最后就是平时可能会忽略的转染试剂本身的脱靶效应off-target effect，转染试剂本身对基因表达水平(高表达或低表达)的影响，有时候可能会造成假阳性的结果。

我自己的体会是，一般的细胞，用脂质体2000和fugeneHD转染效率相差不大，虽然最近有文献说脂质体2000脱靶效应很高，但国内在乎的人貌似不多;但是干细胞，原代细胞和肿瘤细胞等一些比较难转的细胞系，Fugene HD比较温和，细胞毒性很低，转染效率明显要好;悬浮细胞，各有千秋，不敢说一定可以，重在尝试，要是都不行，就电转吧。

要素八：交叉污染

如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。

作者：keeii 点击：1087次

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

(品牌管理)品牌八大要素在成功企业中的具体应用

（品牌管理）品牌八大要素在成功企业中的具体应用

摘要：21世纪是壹个辉煌的时代，经济的发展是空前壮大的，这不仅仅是科学技术的发展带来的果实，仍有企业运营关系的和时俱进，也就是说生产关系于逐步跟上了生产力的发展。可是自然资源的数量也逐步的减少，很多产业面临消亡或转型，企业之间的竞争也会更加的激烈。整个世界经济环境就是这样壹个充满了火药味的“人间”，虽然经济形势充满了挑战，可是仍是有更多的企业于建立，于发展，于壮大。人类是不畏困难的高级动物，面对任何困难均会利用智慧的钥匙去打开另壹扇天窗，取得胜利。那么当前，对于众多的企业家来说，如何去运营企业，如何去满足消费者需求，如何使企业立于不败。人才、品牌、技术等因素的优胜将更多地决定企业的存亡。品牌是企业无形的资产，甚至关系到企业的生存和发展。壹个企业于建立之初，它的品牌是不被人们认可的，假如企业没有壹个很好的“点”来支撑企业的话，于这个时候是企业竞争力最弱的时刻，因为当下的社会，消费者消费的对象能够说是对企业品牌的消费，要胜过对产品的消费，壹个良好的品牌于消费者心中代表着它的产品也是过质过关的，因而壹个聪明的企业运营者，他会于企业建立之初就开始了对企业品牌的塑造。纵观世界经济，很多优秀的企业家或者公司管理人员，均是壹个懂得品牌建设的高手，企业于他们的手中会如鱼得水，相应之品牌也会随着绝响。近年来，我国企业于品牌的建设上呈现出了壹派繁荣的景象，不管是大小企业均能显露出对品牌的重视，虽然对品牌的这种热诚持续增热，可是对于品牌正确的认识仍是存于问题，表当下对品牌建立、维护、管理、延伸、愿景等因素处于壹种暗淡的情况。因为对于这些因素的认识和正确应用时值得各个企业去学习的方向。关键词：品牌塑造；品牌愿景；品牌管理；品牌规划；品牌战略；品牌识别；品牌延伸壹、品牌的塑造和品牌愿景品牌塑造是指给品牌以某种定位、且为此付诸行动的过程或活动。品牌塑造是壹个系统长期的工程，品牌知名度、美誉度和忠诚度是品牌塑造的核心内容，大企业能够凭借雄厚的财力物力通过炒作、广告轰炸、大规模的公益和赞助等循序渐进的进行品牌塑造，通过建立品牌优势来刺激和吸引消费者的购买冲动。品牌愿景是指壹个品牌为自己确定的未来蓝图和终极目标，向人们明确的告知品牌今天

安全生产标准化八大要素

1、目标职责：目标、机构和职责（机构设置、主要负责人及管理层职责）、全员参与、安全生产投入、安全文化建设、安全生产信息化建设 2、制度化管理：法律标准识别、规章制度、操作规程、文档管理（记录管理、评估、修订） 3、教育培训：教育管理、人员教育培训（管理人员、从业人员、外来人员） 4、现场管理：设备设施管理（设备设施建设、设备设施验收、设备设施运行、设备设施检维修、检测检验、设备设施拆除、报废）、作业安全（作业环境和作业条件、作业行为、岗位达标、相关方）、职业健康（基本要求、职业病危害告知、职业病危害项目申报、职业病危害检测与评价、警示标志） 5、安全风险管控及隐患排查治理：安全风险管理（安全风险辨识、安全风险评估、安全风险控制、变更管理）、重大危险源辨识与管理、隐患排查治理（隐患排查、隐患治理、验收与评估、信息记录、通报和报送）、预测预警 6、应急管理（应急准备：应急救援组织、应急预案、应急设施、装备、物资、应急演练、应急救援信息系统建设、应急处置、应急评估 7、事故管理：报告、调查和处理、管理 8、持续改进：绩效评定、持续改进 5、核心要求 5.1目标职责 5.1.1目标企业应根据自身安全生产实际，制定文件化的总体和年度安全生产与职业卫生目标，并纳入企业总体生产经营目标。 5.1.2机构和职责 5.1.2.1机构设置企业应落实安全生产组织领导机构，成立安全生产委员会，并应按照有关规定设置安全生产和职业卫生管理机构，或配备相应的专职或兼职安全生产和职业卫生管理人员，按照有关规定配备注册安全工程师，建立健全从管理机构到基层班组的管理网络。 5.1.2.2主要负责人及管理层职责企业主要负责人全面负责安全生产和职业卫生工作，并履行相应责任和义务。 5.1.3全员参与

商业模式的八大要素

商业模式的八大要素[1] “客户价值最大化”、“整合”、“高效率”、“系统”、“赢利”、“实现形式”、“核心竞争力”、“整体解决”这八个关键词也就构成了成功商业模式的八个要素，缺一不可。其中：“整合”、“高效率”、“系统”是基础或先决条件，“核心竞争力”是手段，“客户价值最大化”是主观追求目标，“持续赢利”是客观结果。

中国的企业在经历了要素驱动与投资驱动两个阶段后，开始向更高境界迈进，现在已经不是企业靠单一产品或者技术就能打天下的时代，也不是靠一两个小点子或者一次投机就能决出胜负的时代了。要想使企业有生存空间并能持续地赢利，必须依靠系统的安排、整体的力量，即商业模式的设计。未来企业的竞争，将是商业模式的竞争。商业模式的竞争将是企业最高形态的竞争！

企业经营也有“道、法、术、器”四个层面，商业模式就是“道”，是商道的最高境界。如果企业总是沉湎在“法、术、器”里找出路的话，就会像爬山一样，总在山脚、山腰打转转，很难直达山巅；而企业只有以商业模式——“商道”的高度，从上往下看时，就会豁然发现，通往山巅的捷径随处可见。企业的出路在于认知的高度，高度决定思路，思路决定出路。 [编辑] 商业模式的特征商业模式必须具有以下两个特征 (1)商业模式是一个整体的、系统的概念，而不仅仅是一个单一的组成因素。如收入模式(广告收入、注册费、服务费)，向客户提供的价值(在价格上竞争、在质量上竞争)，组织架构(自成体系的业务单元、整合的网络能力)等，这些都是商业模式的重要组成部分，但并非全部。 (2)商业模式的组成部分之间必须有内在联系，这个内在联系把各组成部分有机地关联起来，使它们互相支持，共同作用，形成一个良性的循环。 [编辑] 商业模式的类型根据上述理解，可以把商业模式分为两大类 (1)运营性商业模式。重点解决企业与环境的互动关系，包括与产业价值链环节的互动关系。运营性商业模式创造企业的核心优势、能力、关系和知识，主要包含以下几个方面的主要内容。产业价值链定位:企业处于什么样的产业链条中，在这个链条中处于何种地位，企业结合自身的资源条件和发展战略应如何定位。赢利模式设计(收入来源、收入分配)：企业从哪里获得收入，获得收入的形式有哪几种，这些收入以何种形式和比例在产业链中分配，企业是否对这种分配有话语权。 (2)策略性商业模式。策略性商业模式对运营性商业模式加以扩展和利用。应该说策略性商业模式涉及企业生产经营的方方面面。 ?业务模式；企业向客户提供什么样的价值和利益，包括品牌、产品等。 ?渠道模式；企业如何向客户传递业务和价值，包括渠道倍增、渠道集中/压缩等。

安全管理八大要素

安全管理八大要素安全管理是在企业安全生产实践中形成的具有本企业特色的安全理念和行为准则。它包括相应的规章制度和组织体系。企业应把安全文化建设当作安全生产的一项基础性工作来抓，突出以人为本，营造“关爱生命、关注安全”的良好氛围，全面强化员工的安全文化素质，把“安全第一、预防为主”变为每个员工的自觉行为。从而为实现安全生产提供思想保证和精神动力。企业在开展安全文化建设中，必须把握和处理好以下八个方面的关系：一、安全文化与安全管理的关系安全文化与安全管理有其内在联系，但安全文化不是纯粹的安全管理，企业安全文化也不是企业安全管理，安全管理是有投入、有产出、有目标、有实践的生产经营活动的全过程，安全文化是安全管理的基础和背景，是理念和精神支柱。安全文化与安全管理是互相不可取代的。它们都是为了人的安全和健康，但各自的目标值和广度及深度大不相同。安全文化与安全管理是有机的统一，安全文化来源于安全管理，指导于安全管理，安全管理又提炼了安全文化，丰富了安全文化的内容和理念。二、安全文化与企业文化的关系建设安全文化是企业文化建设发展的需要，是从属于企业文化的一个子系统，是企业文化的重要组成部分。安全文化建设必须依赖于企业文化这个基础，没有企业文化的发展，企业安全文化也就没有了根基。因此，在搞好安全文化建设的同时，必须抓好企业文化建设。通过安全文化以有形或无形的渠道，正式或非正式的传播方式在企业员工中树立一种全新的“安全生产、以人为本”的企业文化理念，以此推进企业文化建设向深层次发展。三、全文化与学习型组织创建的关系搞好安全文化建设工作，首先要组织编写《安全文化手册》，这是最基础的工作。在此基础上，要大力开展宣传贯彻《安全文化手册》活动，充分利用各基层单位学习型组织的网络优势、政治优势和传播优势，将《安全文化手册》的内容纳入到学习型组织的学习内容中，真正落实“工作学习化、学习工作化”，赋予学习型组织贴近安全生产、贴近企业发展的实际内容和现实意义。同时，也希望学习型组织创建工作能够在学习宣传贯彻《安全文化手册》的活动中，与安全文化建设相辅相成、相得益彰，共同取得成果。以安全文化建设为突破口，全面带动企业文化建设向前发展。四、安全理念和安全生产的关系安全理念是企业在安全方面的诸项工作科学发展的综合体现，是企业管理层对企业安全管理的深层思考，是灵魂和精髓。安全理念的培养、形成和发展，直接影响着安全生产的进程和生产质量的高低，关系着企业的生存和发展。就企业安全生产的本身分析，安全理念是一种精神理念，没有安全理念的精神支柱，是很难保证安全生产的。因此，在施工生产过程中，安全理念的确立是第一位的，而安全生产活动则是第二位的。五、思想教育与经济处罚的关系

优秀团队的八大要素Word版

优秀团队的八大要素要建立一支优秀的团队，最重要的是什么？同样是一群人做事情，在不同的状况下，为什么整个团队的氛围差别会这么大？而他们所体现出来的团队精神，所做出来的工作成效，差别会这么大？我曾经跟随几位非常有领导力的团队领导者，从他们组建团队开始，到建立团队规则，到打造执行力团队，到建立团队氛围，以及工作标准和工作成果整个过程，受益良多，总结出建立优秀团队的八大要素，包括核心四项和外围四项，在此希望与各位优秀的精英们探讨建立优秀团队的诀窍和技巧。 A、团队愿景/目标/目的意义：团队为何而组建？愿景是最好的凝聚和激励方式，当年共产主义的愿景可以让多少革命烈士愿意为之抛头颅、散热血，而团队的愿景可以为团队注入强大动力，当团队的愿景可以很好的与个人的愿景结合的时候，当给予人发挥的平台和空间时，每个人都会自动自发的去工作。用好团队愿景这一强大的工具，可以帮助提升团队凝聚力和向心力。方式：与所有成员共同讨论团队愿景，询问每个团队成员在这个工作任务和团队当中，希望从中得到什么？他希望在怎么样的团队当中工作？他觉得什么样的工作是有意义的？ B、团队成员/角色/团队领导人意义：在团队建立的初期，团队领导人的角色非常重要，承担着整个

团队方向和规划的重任，而如何用人所长，则是团队领导人最重要的工作。每个人的特长、个性特点和兴趣爱好的确是有分别的，如果能将适合的人放到适合的位置，做他最擅长的事情，能够事倍功半。最重要的是，这样的平台和空间，使团队成员从心里油然而生责任感，“这是我的项目”，这种工作起来的感觉是不一样的。方式：了解每个人的特长和能力所在，了解每个人希望承担的角色和希望发展的方向，他们希望学习和成长的动力，要了解他们内心火焰会为何而燃烧，只要看看他们在说到什么事情的时候，眼睛是发光发亮的，那就是他的动力所在！安排和分配任务时，考虑最能发挥他优势和他最想做的工作。

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。细胞培养在适合的培养基中。细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合：用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下：澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

成就领导力的八大要素

要素一：明确的愿景那些真正能够留名千古的宏伟基业都有一个共同点：有令人振奋、并可以帮助员工做重要决定的“愿景”。一些人错误地认为，领导者的工作就是将100%的精力放在对组织结构、运营和人员的管理和控制上。这种依赖于自上而下的指挥、组织和监管的模式会极大限制创造力。相比之下，为组织制定一个明确的、振奋人心的、可实现的愿景，对于组织的长远发展来说，其重要性更为显著。优秀的领导者会与追随者分享组织的愿景。制定并与员工分享美好的愿景，可以充分激发员工的参与感和积极性，可以让整个团队保持激昂的斗志和坚定的方向，是领导艺术的重要组成部分。要素二：充满激情世界上所有伟大的企业，都有一位充满激情的领导者。如GE的杰克韦尔奇、沃尔玛的萨姆沃尔顿、苹果的乔布斯等。这些卓越的商界领袖具备一项共同的特质：在工作中永远满怀热情，从不知疲倦。卓越的领导者不仅善于用激情来激励自己，还善于运用和调动激情，将员工的积极性放大，使员工创造出意想不到的业绩。激情还是聚集人才的重要手段。要素三：善于沟通好的领导者一定是沟通大师。沟通，最首要的就是学会聆听。认真地听取别人的陈述，不仅是一种礼貌，也是获取信息、了解对方真实意图的有效方式。一名好的领导者必须学会对自己的团队进行有效的沟通，让每一个团队成员都能感觉到他是重要的、特殊的、优秀的。领导者还要学会在公众场合进行演说，优秀的领导人，如克林顿、奥巴马，都是天才的演说家。在进行沟通时，一定要加强沟通技巧的学习和运用，比如，多运用图表来强化听者的印象。有效地管理会议也是沟通能力的体现。要素四：掌控节奏最好的领导不是那种最有魄力、冲锋在前、日理万机的领导，而是能在不同个性层面达到理想的均衡状态、保持合理节奏的领导者。千万不要做“忙碌的傻瓜”，节奏过缓同样不行。理想的节奏应如同既明快又稳健的圆舞曲，均衡而舒心。掌控好节奏的领导者善于用全方位的理智思维分析复杂情景，针对不同类型团队或团队不同发展阶段灵活选择管理方式。要素五：适应变化当今世界飞速变化，领导者制订战略时，必须充分考虑各种不断变化的因素，根据紧急情况制订应急战略，或相应补充和调整原有战略。有效的领导必须着眼于持续改进。适应变化的有效方式是创新。因此，领导者的创新意识非常重要，直接影响到其能否带领团队在复杂环境中度过危机走向成功。创新力也是领导力。尤其重要的是，领导者要将自己的创新意识注入整个团队，培育创新型组织。要素六：培养团队在任何一个成功的组织里，团队利益总要高过个人利益。这样的道理说起来容易，但却不好把握。好的领导者善于根据组织目标的优先级顺序决定自己和自己部门的工作目标以及目标的优先级。领导者还应勇于做出有利于团体利益的抉择，就算对自己来说是一种损失也是如此。此外，领导者应该主动扮演“团队合作协调者”的角色，不能只顾突出自己或某个人的才干，而忽视了团队合作。要素七：选择并培训人才对21世纪的领导者而言，人才甚至比战略本身更为重要。领导者应把“以人为本”视作自己最重要的使命之一，不遗余力地发掘、发现人才，将适合组织特点的优秀人才吸引到自己身边。一名领导者如果不能将30%以上的工作时间投入到选拔人才中，那他就无法让自己的团队获得持久的动力。当然，“选拔”并不仅仅限于直接的面试和聘用行为，也包括更多结识业内朋友，建立自己的人际关系网络，从中发现更多、更好的人才。要素八：勇气和真诚勇气和真诚是所有卓越的领导者共同的品质。“将帅不勇，何以将帅？”领导者的勇气能感染追随者，让他们从领导者身上看到信心和希望，从而能打造一个战无不胜的勇敢团队。真诚

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

乔布斯精彩演讲的八大要素

乔布斯精彩演讲的八大要素有说服力的演讲底稿包含9个常见的要素。亲爱的读者，在你打开演示程序之前，不妨考虑将这些构成要素纳入演讲底稿中去，不管是将它们插入你的keynote软件，还是powerpoint 软件，抑或其他任何设计软件都可以。这其中某些概念我们将在以后更详细地探讨，但现在，请暂时记住它们。精悍的标题你想带给观众的最伟大的想法是什么？注意，标题应当简短易记，并以主谓宾的语序出现。当乔布斯推出iphone手机时，他大声宣布：“今天，苹果重新发明了手机！”这就是他的标题。标题的作用是紧紧地抓住听众的注意力，使人们集中精力听演讲。阅读《今日美国》，你一定会有所收获。下面是这份美国最流行的日报所采用的一些标题的例子：“超薄苹果！超强功能！”“苹果发布‘雪豹’新操作系统”“苹果ipod瘦身”激情声明“公共演讲之父”亚里士多德相信成功的演讲者都有一种“精神病态”，对演讲主题充满激情，一般的沟通者则很少对他们的话题表现出兴奋感。乔布斯几乎每一次做演讲时，都表现出令人眩晕的兴奋感。他以前的雇员，甚至包括一些专职记者都声称，乔布斯旺盛的精力和热情令人神往，让人禁不住为之倾心、着迷。读者朋友，请花几分钟的时间填空，作为对演讲激情所作的声明：“我非常兴奋，因为此产品（公司、精神、功能等）。”请作出关于激情的声明，不要怕难为情，大方地和听众分享你的活力

和激情。“3”条关键信息现在你已经确定了你的标题，也作出了声明，下面请写出3条你希望在场的听众接收到的信息，要做到使他们不用翻看笔记就能很容易地回想起信息的内容。虽然场景5将就这个问题进一步展开深入地论述，但是亲爱的读者朋友们，请现在就记住，你的听众靠短时记忆能记住的只有3~4个要点。每个关键信息都必须有充分的素材来支持。隐喻和类比当你确定了关键信息和支持点以后，接下来应确定使用何种修辞手法，令你的叙述更有吸引力。根据亚里士多德的意见，隐喻是“迄今为止最有意义的手法”。隐喻也是一种比喻—用一个词或短语，以特征上存在某一类似之处的一个事物来指代另一事物。隐喻之隐喻性的实现基于隐喻创造者的经验和隐喻接受者的经验的相互融合。隐喻是市场营销、广告和公关宣传活动中常用的一种很有说服力的工具。乔布斯在交谈和演示中经常运用隐喻。在某次有名的采访中，乔布斯说：“电脑是我们所能想到的最出色的工具，苹果电脑就相当于21世纪人类的自行车。”专业营销人员喜欢运用跟体育相关的隐喻—“我们都为同一个团队效力”、“这不是一场分组对抗赛，这是实战”、“我们的工作已经做得非常成功，让我们继续保持下去”。虽然用体育作比喻很有效果，但是在演讲中，尽量挑战自我，标新立异，超越观众对你的期望，会收到更好的效果。我从卡巴斯基反病毒软件的广告中发现了一个新颖而有趣的隐喻。该公司刊登了整页的广告（其中之一是在《今日美国》上），画面上是一位身着盔甲的中世纪士兵，他垂

COSO风险管理框架八大要素

COSO风险管理框架把风险管理的要素分为八个：内部环境、目标制定、事件识别、风险评估、风险反应、控制活动、信息与沟通、监督。内部环境企业的内部环境是其他所有风险管理要素的基础，为其他要素提供规则和结构。内部环境影响企业战略和目标的制定、业务活动的组织和风险的识别、评估和执行等等。它还影响企业控制活动的设计和执行、信息和沟通系统以及监控活动。内部环境包含很多内容，包括企业员工的道德观和胜任能力、人员的培训、管理者的经营模式、分配权限和职责的方式等。董事会是内部环境的一个重要组成部分，对其他内部环境的组成内容有重要的影响。而企业的管理者也是内部环境的一部分，其职责是建立企业的风险管理理念、确定企业的风险偏好，营造企业的风险文化，并将企业的风险管理和相关的行动计划结合起来。目标制定根据企业确定的任务或预期，管理者确定企业的战略目标，选择战略方案，确定相关的子目标并在企业内层层分解和落实，各子目标都应遵循企业的战略方案并与战略方案相联系。事项识别管理者意识到了不确定性的存在，即管理者不能确切地知道某一事项是否会发生、何时发生或者如果发生其结果如何。作为事项识别的一部分，管理者应考虑会影响事项发生的各种企业内外部的因素。外部因素包括经济、商业、自然环境、政治、社会和技术因素等，内部因素反映出管理者所做的选择，包括企业的基础设施、人员、生产过程和技术等事项。风险评估风险评估可以使企业了解潜在事项如何影响企业目标的实现。管理者应从两个方面对风险进行评估――风险发生的可能性和影响。风险反应管理者可以制定不同风险反应方案，并在风险容忍度和成本效益原则的前提下，考虑每个方案如何影响事项发生的可能性和事项对企业的影响，并设计和执行风险反应方案。考虑各风险反应方案并选择和执行一个风险反应方案是企业风险管理不可分割的一部分。有效的风险管理要求管理者选择一个可以使企业风险发生的可能性和影响都落在风险容忍度范围之内的风险反应方案。控制活动控制活动是帮助保证风险反应方案得到正确执行的相关政策和程序。控制活动存在于企业的各部分、各个层面和各个部门。控制活动是企业努力实现其商业目标的过程的一部分。通常包括两个要素：确定应该做什么的一个政策和影响该政策的一系列过程。信息和沟通

病毒转染原理及步骤

病毒转染原理及步骤在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。一、慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

合同的八大要素

合同的八大要素篇一：合同审核的几个关键要素合同审核的几个关键要素标签：律师法律现实中，不乏讲述了合同审查中应注意的几个要素和审查合同时候的一些小技巧的文章，我想审合同是每个民商事领域的执业律师都有过的经历，它是一门很基本的职业技能，似乎但凡有点法律功底的人都可以帮人审个合同什么的，因此在初入律师行业的时候，“师父”让实习律师干得最多的事情除了“跑腿”就是审合同了。起初觉得那是一门很简单的工作，后来随着自己执业经历的增长，包括自己也要带助理同时也会交办给他们一些修改合同的工作的时候，才发现审合同远没有我们当初想象的那么简单。那么今天我结合自己的一些成功和失败的经验来谈谈实践中我自身审查合同时的一些关注点以及如何去把握那几个关键要素。了解合同主体的交易背景以及交易目的这一点在审查合同的过程中是最重要又是最容易被忽略的。重要是因为合同的交易背景和交易目的是律师在起草或审查合同时的一杆标尺，就跟师在裁剪一件晚礼服的时候除了要知道穿这个晚礼服的人的基本信息，还要知道这个人是用在什么场合穿的，以及他（她）参与这个场合的用意何在，否则晚礼服做得再漂亮也不一定适用。而这一点又最容易

被忽略是因为我们审查合同的律师可能都没有经历整个谈判过程，而客户又没有主动告知（大多数情况是客户也不清楚律师需要的信息），而真正审合同的律师估计也就只问了一句“我们是代表甲方还是乙方？”然后便自顾自的抛头颅洒热血的工作起来。这种情况下合同改好了，签约的人却未必顺利，也未必适用。合同的交易背景和交易目的在审查合同时候的重要性是不言而喻的，但实践中应如何去了解去把握却是一个现实难题，结合自身经历可以从以下几个点出发： 1、对于一般的常规性的合同，如买卖合同、租赁合同等，一般来说这类交易律师极少数加入委托人的商事交谈过程，且委托人往往又是顾问单位的，律师（包括实习律师）可以向委托人的合同专员或其它相关工作人员询问并通过自身查询了解以下几个方面的问题：（1）对于长期的合作对象了解以往的交易流程以及签约的合同的文档；原有的交易流程已经形成双方的一种交易习惯或交易默契，在合法且不影响实际交易的情况下，我们设计的合同条款应当充分尊重原有的交易习惯，如运输模式、交货方式、付款流程、合同生效条款等。如原本的书面合同和交易习惯有欠缺之处应尽量的弥补并完善，如是先票后款还是先款后票，开具发票的类型，货物的签收地点、签收人、验货方式等。（2）对于初次合作对象一定要查询其公司注册情况，这个工作并不难，

细胞转染的步骤

【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

影响精益生产成功的八大因素

影响精益生产成功的八大因素 1、领导层的支持公司领导层是否了解和认同精益生产的思想和原则，是否积极参与配合精益生产的引进工作对实施效果起着关键作用。让他们在整个项目的推广过程中起带头作业。这就意味着各个高级经理们必须与车间工人一道参与培训，不论他的工作有多忙，都要抽出时间参与到精益生产的整个实施过程中去。2、企业文化精益生产的引进可以说是一场思想上的变革，人们总会产生一种本能的抗拒心理。这种抗拒心理在不同的企业文化面前将呈现出不同的行为表现，如果企业原来的作风和传统习惯中就包含“消除浪费、鼓励创新”等，这种抗拒心理就会很快转变为精益生产变革的动力；如果企业文化相反，障碍也可想而知。 3、人力资源政策推行精益生产，将极大地提高生产效率和企业竞争能力，必定会赢得客户更多的订单，到时候不是要裁员而是要增员，企业应事先与员工进行充分的沟通，取得员工的支持。 4、执行组织精益生产需要一个专门的机构来推动，可以由全职或兼职的人员组成，看企业规模而定。精益生产的推动机构应该直接由总经理领导。 5、专业技能精益生产是一项系统工程，一提起精益，很多人就想到“零库存”，但这并不是精益生产，精益生产不是简单的形式上的模仿，需要深入研究和理解背后所隐藏的逻辑，企业在熟练运用一些适合自己的精益工具如工业工程、价值流图分析、防差错技术、TPM等基础上，要不断消化吸收，创造出一套适合自己的精益生产模式。。 6、持续改善目标精益生产需要一系列的衡量指标来测量精益生产的成效，从而引发从上到下所有员工的关注，并为目标的达成付出努力。一般的衡量指标有投资回报率、利润率、交货周期、库存周转率、客户缺陷率、单位成本、人均效率等方面。 7、关注客户价值精益思想的核心在于“以客户的观点定义价值”，消除浪费需要遵循如下的途径来达成：准确确定特定产品的价值一一识别每一种产品的价值流--使价值流流动连续不断-- 由顾客拉动生产商创造价值--追求完美。 8、有效的激励 1）物质激励企业在物质激励方面逐渐与员工绩效挂钩，企业工资改革过程中坚持将工资与员工的劳动效果、工作业绩挂钩，彻底打破平均主义，激发员工的工作热情。根据不同岗位、不同管理层采取多种工资形式。如计件工资、岗位工资、承包工资、年薪制度等，以适应企业各阶段的发展。 2）非物质激励企业以人为本，尊重员工的意见、建议，职工提出的合理化建议要逐一落实，并给予适当的物质奖励，设黄了合理化奖等。

各种转染试剂中文说明

FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。