植物显微技术实验参考资料

实验一植物根尖染色体压片法

一、实验目的

1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法；

2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。

二、实验原理

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织（分生区），其中根尖是最常用的材料：

1. 根尖取材容易，操作和鉴定也比其它组织方便；

2. 采用实验室内种子萌发后所长出的幼嫩根尖，不受植物生长季节的限制，并且可以大量获得；

3. 对于某些珍贵而稀少的实验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材

料的伤害要小得多；

4. 采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。

三、实验材料

?大蒜（Aillum sativum 2n=16）

四、实验器具和药品

1. 用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。

2. 药品：无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲

醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。

五、实验说明

1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。

2. 植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。

3. 有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。（预处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3-4小时。常用的药剂，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。）

4.植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁将分生细胞结合成

一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，称为解离。同时，解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。

六、实验步骤

1.前处理：将大蒜或洋葱的鳞茎，置于盛水的小烧杯上，放在25℃温箱中，待要长到2cm左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02%秋水仙素溶液中，浸泡处理3-4小时。

2.固定：经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定24小时。固定材料可以转入70%酒精中，在4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。

3. 酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0.1mol/L HC中，在60℃水浴中，解离8-10分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板上，加上几滴改良石炭酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。

4.压片：把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长区部分剪去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞的附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的，必需掌握以下几点：

①压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展余地。

②敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。

5. 封片：把压好的玻片标本，放在干冰或冰箱结冰器时冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片和载玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。

七、结果拍摄根尖染色体有丝分裂中期相。

实验二去壁低渗法制备染色体标本

一、实验目的

1. 学习利用去壁低渗火焰干燥法制备植物染色体标本。

2. 获得分散良好、形态清晰的中期染色体用于核型分析。

二、实验原理

植物染色体标本制备最常用的方法是压片法，将材料解离后进行染色和压片，由于植物细胞具有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体那样平整地贴在载玻片上，使用压片法进行制片时常常由于细胞堆积致使染色体很难彻底分散开。而去壁低渗法则是先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，得到原生质体，再将细胞进行低渗处理，即把细胞置于低渗液（低浓度的KCl或蒸馏水）中，使细胞充分吸水膨胀，染色体分散，平展地铺展在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴在载玻片上。此法有效地克服了压片法中存在的染色体分散不开、平展不良等不足，现已成为当前植物染色体研究中的重要方法，广泛应用于核型分析、染色体显带等研究。

三、实验材料

大蒜根尖（染色体数2n=16）

四、实验用品：

1. 器材：显微镜；温箱；冰箱；重蒸水；眼科镊子；刀片；牙签；载玻片；试剂瓶；三角瓶；量筒；酒精灯；青霉素小瓶

2. 药品：

①0.2% 秋水仙素溶液

②Giemsa原液

③甲醇（AR级以上）

④冰醋酸（AR级以上）

五、实验步骤

1.取材：将大蒜瓣掰开，大头朝下置于白瓷盘中，加上少许水，3-4天后根长到1cm左右，将根剪下，用蒸馏水洗几次。

2.预处理：根尖用0.2%的秋水仙素溶液处理2～4h。

3. 前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25℃条件下处理30分钟。以下可分两种方法进行处理:

第一种方法：

①酶解去壁：吸去氯化钾溶液，加入混合酶液（2ml滴管5滴左右），在25℃下处理1-2小时。

②后低渗：吸去酶液，慢慢加入(25±0.5) ℃的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10-30分钟第二种方法：

①固定：吸去前低渗液，立即加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定20-30min

②水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液

③酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液（酶液量以浸过材料为合适），在25℃下酶解30-60min。

④后低渗：同上，但是，可适当延长时间至1-1.5小时。

4. 经过上述两种方法处理的材料,可用两种方法制备染色体标本

第一种方法——涂片法:

①固定：经后低渗的材料，直接用甲醇：冰醋酸（3：1）固定30min上

②涂片：将材料放在预先用蒸馏水浸泡并冷冻的清洁载玻片上，加1滴固定液，然后用镊子迅速将材料夹碎涂布，并去掉大块组织残渣

③火焰干燥：立即将载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干

④染色：经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空气干燥。

第二种方法——悬液法：

①制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液；

②固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成细胞悬液；

③去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层悬液于另一个小瓶中；

④去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约

0.5ml左右细胞悬液置备标本；

⑤标本制备：在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细

胞悬液,立即将载玻片一端抬起,并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。

⑥染色：同涂片法④

5. 镜检：在显微镜下寻找典型的中期染色体，注意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位置，并尽可能找到具随体染色体。

六、注意事项

1.由于分裂细胞主要位于根尖的分生区，所以切取根尖时不宜太短（丢失分裂的细胞），也不宜太长（使分裂细胞在所有细胞中的比率减少），以刚好切下分生区最为适合。

2.用吸管吹打时要充分，尽量使组织块分散成单个细胞，观察细胞悬液看不到漂浮的组织块即可，如果组织块不分散会不利于染色体分散。

3.载玻片要预先冰冻，进行滴片时，从冰箱中拿出载玻片后马上滴片。

由于在进行滴片时，细胞铺展在整个载玻片上，所以染色时要尽量铺

4.满载玻片，注意不要将染液滴到实验台及其它地方。

七、作业：去壁低渗火焰干燥法与压片法相比，其优点是什么？

实验三徒手切片法

一、实验目的

1. 掌握临时装片的制片方法、掌握徒手切片的方法

2. 了解植物细胞结构。

二、材料与用品

器械：显微镜、载/盖玻片、刀片、镊子、滴管、擦镜纸、毛笔、培养皿

实验材料及夹持物：洋葱鳞茎、西红柿老熟果实、芹菜叶柄

三、实验原理

用光学显微镜观察的样品，必须是透明的薄片，因此，首先要把观察的材料制成透明的切片后才能在显微镜下观察。徒手切片法是指手拿刀片把新鲜材料切成薄片，制成临时装片的方法。此法简单方便，不需设备即可保留植物活体状态。

四、实验内容和实验方法

（一）临时装片的制作

1. 擦净载玻片和盖玻片

①擦载玻片用左手的拇指和食指捏信载玻片的边缘，右手用纱布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好后放在干净处备用。

②擦盖玻片先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再将右手拇指和食指用纱布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着纱布慢慢地进行擦试。

2. 取样用滴管滴一点水或其他溶液（根据需要）于载玻片的中央，把观察物放于载玻片上的液滴中，展开或摇匀。

3. 盖盖玻片右手持镊子，轻轻夹住盖玻片的一角，使盖玻片的边缘与液滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上，避免气泡的产生。如盖玻片下的液体过多，可用吸水纸将多余的液体吸掉。

（二）徒手切片法

徒手切片法不需要任何机械设备，只需要一把锋利的刀片即可完成切片的制作，方法简单，也容易保持物的生活状态，有很大的实用价值。

1. 选材

选择软硬适度的材料，先截成适当的段块。一般直径大小3-5mm、长度20-30mm为宜。若材料太软，如幼叶，不能直接拿在手中切片，可用适当大小的马铃薯块茎或萝卜块根等作支持物，将材料夹入其中一起切片。

2. 切片

用左手拇指、食品指和中指夹住材料，使其稍突出在手指之上，拇指略低于食指，以免刀口损伤手指。材料和刀刃上蘸水，使其湿润。右手拇指和食指横向平握刀片，刀片要与材料断面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置，以均匀的力量和平稳的动作从左前方向向右后方拉切。

切片时要用臂力而不用腕力，手腕不要动，靠肘、肩关节的屈伸来切片，拉切要快，中途不要停顿，更不能用拉锯方式进行切片。

每切2-3片就要把刀片上的薄片用湿毛笔移入盛有清水的培养皿中暂存备用。如发现材料切面出现倾斜，应修平切面后再继续切片。

3. 镜检观察

连续切下很多切片后，挑选最薄的切片放于加了1滴清水的载玻片，盖上盖玻片，制成临时装片，进行镜检、观察。

（三）植物细胞的结构观察

1. 洋葱表皮细胞的观察

取一洁净载玻片，于载玻片中央加上一滴水。取洋葱一个，剥下一片新鲜的带紫色的南鳞叶，和刀片从外表面（或内表面）切一个面积为4mm2左右的方形小格，然后用镊子将表皮撕下，迅速入入载玻片上的小水滴中（表面向上）。并使其平展，盖上盖玻片，即制成临时装片。将装片放在显微镜下，用低倍镜观察细胞结构。

①细胞的形状洋葱表皮由一层细胞构成，所有的细胞都有相似的—扁砖状。细胞之间排列紧密，没有间隙。

②细胞壁为植物细胞所特有的结构，较透明，因此只能看到其侧壁。初看时，好像两个相邻细胞只有一层壁，但是，通过增加反差和仔细调焦就能发现这实际上是三层，即两侧相邻两细胞的细胞壁及中间的胞间层。

③细胞质为无色透明的胶状物，充满整个细胞。由于中央有大的液泡，被挤成一薄层，分布于细胞周围，仅细胞两端较明显。

④细胞核为球形小体。由于中央有大液泡，也被挤向近细胞壁处。

⑤细胞膜非常薄，而且与细胞壁紧贴在一起，因此不易观察到。

⑥液泡一个或几个，位于细胞中央，里面充满细胞液，所以比细胞质透明。

2. 果肉离散细胞观察

用解剖针挑取少许已经红熟的的番茄果肉（以临近果皮的为好），把它们放在载玻片上的水滴中，用解剖针将果肉细胞拨匀，分散得越开越好，盖上盖玻片，在显微镜下观察。可以看到圆形或卵圆形的离散细胞，同样也可以观察到细胞壁、细胞核和很大的液泡。此外，还可以看到带色的圆形小颗粒，即有色体。

3. 厚角组织

用徒手切片法做芹菜叶柄的横切片，选取薄而透明的切片制成临时装片，置于低倍镜下观察。在芹菜叶柄棱角处的表皮内方有厚角存在，这些细胞的细胞壁在角隅处有增厚。

实验四叶表皮整体制片实验（撕取法，离析法）

一、实验目的：

掌握植物（蔬菜或果树）叶表皮的制片方法，以观察叶气孔、毛状体及表皮细胞的结构。

毛状体（trichome ）：植物表皮细胞上的突起。包括毛、鳞片等。

二、实验材料：蔬菜叶片（随季节而定）。

三、实验用品：

器具：光学显微镜，培养箱，温台，粗天平，镊子，小剪刀，解剖针，培养皿，载/盖玻片，标签，玻片板，吸球，滤纸，量筒，钥匙，滴瓶（带橡皮头），毛笔，双面刀片，烧杯，白瓷板，解剖刀

药品：1％番红、二甲苯、蒸馏水、中性树胶

四、操作步骤：

1. 取材：

①果树叶片（多革质）在叶主脉中部两旁剪成4×6毫米左右长方小块进行离解；离解方法如下： 将处理好的叶片投入5-10％硌酸和5-10％硝酸等量混合离解液中，时间随材料而定。柑橘嫩叶约离解6小时左右，至上下表皮分离为止，移至盛清水的培养皿中。

选取约1cm2大小的叶片，放入20%的NaOCl溶液中浸泡直至叶片完全变白。待叶片变白后用镊子将其取出，用蒸馏水清洗数次以洗去叶片表面残留的NaOCl溶液，然后置于洁净的载玻片上，放在解剖镜下进行上、下表皮剥离。

②蔬菜叶片（纸质叶片）采用撕取法，用镊子撕取上下表皮（分别记认，并各分清上、下表皮的内外面）不带叶肉或修剪去叶肉部分在蒸馏水的培养皿中修整成约2×2～4×4毫米大小的方块进行离解。

2. 清扫叶肉及水洗：用毛笔轻轻清扫去残存的叶肉及洗尽解离液（撕取法免去此步）。

3. 染色：用毛笔挑选完整且不带叶肉的透明叶块至白瓷板内，加入1％番红液染色5～10分钟。

4. 去浮色：用自来水洗至无色再渗出止，若去浮色不彻底，封片后2-3天内又会渗出，前功尽弃。

5. 展片：将载玻片倾斜于水中，借水的浮力使表皮充分展开，最好记认内向的一面贴着玻片，用毛笔拨正位置，擦去多余的水分。

6. 烤干：将已贴材料的载玻片于40℃的恒温箱中或恒温台上烤干，亦可阴干，但一定要干透。

7. 透明：于材料上滴一滴二甲苯，待二甲苯挥发稍湿润时封片。二甲苯干透时叶片容易卷曲。

8. 封片：滴一滴中性树胶封片。

9. 镜检

五、注意事项

1. 取样时应该取叶片的中间部位，用镊子去除叶脉；

2. 样品与浸提液的比例为1：20；

3. 掌握好浸提时间，较幼嫩的材料浸提时间应该比较短；

4. 染色时间不宜过长；

5. 去浮色很关键，如果没有去掉，细胞内的染液会慢慢渗出，影响观察；

6. 透明前一定要烤干玻片，因为二甲苯不溶于水；

7. 封片的树胶只需用一两滴，太多会溢出沾在盖玻片上。

实验五植物细胞形态离析法

一、实验目的：初步掌握对蔬菜或果树茎段结构中的细胞离析方法，以观察细胞的完整形态，如导管、管胞、筛管、伴胞及韧皮纤维等。镜检后制成永久片。

二、实验材料：依研究方向而定（芥蓝茎）。

三、仪器、用具及药品、染料：

光学显微镜，离心机，恒温台，小烧杯，小刀，枝剪，试管，试管架，玻棒，镊子，载/玻片，离析液（10％硌酸和10％硝酸等量混合液），50％、70％、95％和无水酒精，1％番红溶液，二甲苯，中性树胶。

四、操作步骤：

1. 取材：取芥蓝茎段截成数厘米长，纵劈成火柴枝大小的细条后，再截成约5毫米长的碎条；

2. 离析：每管放入材料5～10细条，加入离析液（10%铬酸和10%硝酸等量混合液）约5毫升，离析2～3小时，搅拌检查至细胞离散止；

3. 离心：将离析后材料用玻棒搅碎，4000rpm，5～10分钟，倒去上层离析液，并去掉较粗末、离散的块状组织；

4. 清洗：清水泡浸后连续换水离心2次，每次5分钟，彻底除去离析液；

5. 染色：将清洗后的材料加入1％番红（70%酒精配），染色3～5分钟；

6. 脱水：70％酒精离心处理5分钟；

7. 粘片：用玻棒粘取沉淀材料均匀涂布于载玻片上镜检后置40℃温台上烤干；

8. 透明、封片：镜检理想者，经二甲苯透明后用中性树胶封片。

五、注意事项：

1. 一定掌握好浸提时间，一般蔬菜肉质茎泡2～3h即可，若时间过长，材料会全部溶解，果树木质茎要浸泡24h以上，浸泡好的标准是当用玻棒搅拌时，样品能被捣碎成条状，而不是粉末状即可；

2. 离心前应该去掉较粗未离散的块状组织；

3. 染色时应控制染色液的量，染液越多，离心次数就越多，而且易于过染，特别是蔬菜材料较易染色，染色时间5min以内；

4. 利用离心洗去染液浮色，可加入适量的酒精脱色，酒精浓度依据染色情况而定，较浓颜色的用较高浓度的酒精；

5. 取样观察时取少量沉淀即可。