微生物菌种操作方法汇总

常用的几种微生物接种方法

接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，分述如下：

一、平板划线接种法（分离培养法）

是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。

（一）分段划线法

平板分段划线(左)及培养后菌落分布图

本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。

（二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。

二、斜面接种法

此法主要用于移种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。通常是从平板培养物上挑取某一单独菌落或者从一支已长好的斜面菌种，移种至斜面培养基上，接种步骤如下（以从已长好的斜面菌种转接为例）：

（一）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。右手持接种环或接种针通过火焰灭菌后俟冷，并同时以右手小指和无名指轻轻拔取两支试管的棉塞或试管帽（先转动棉塞后拔去），夹持于手指间。

（二）将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防止外界的污染。

（三）首先将接种环伸入有菌试管，使接种环接触菌苔取少量菌，取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上的蜿蜒涂布，或直接自斜面底部向上蜿蜒涂布。此步注意接种环不可碰试管壁和接种时不要划破培养基。

（四）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，将接种环插到酒精瓶中。

三、倾注培养法

本法用于饲料中细菌、霉菌的计数。方法是取原始样品或经适当稀释的（通常是10-1~10-5稀释）液体1mL，置于直径9cm无菌平皿内，倾入已融化并冷至50℃左右的培养基约13~15mL ，立即混匀，待凝固后倒置，于一定温度下培养一定小时，作菌落计数。

四、穿刺接种法

此法多用于双糖、半固体、明胶等培养基的接种，方法与斜面接种类似。用接种针挑取菌落或菌液少许，由培养基表面中央直刺至管底（若为三糖铁并在斜面加以涂布），然后沿穿刺线拔出接种针（注：接种半固体看动力者不穿刺到底）。

穿刺接种琼脂固体穿刺生长形状

五、液体接种法

此法多用于单糖发酵试验等，接种方法与斜面接种方法基本相同。以左手持培养基与菌种管，右手持接种环和拔持棉塞，将挑取的菌落或菌液接种于液体培养基内。

无菌技术：

1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；

2、将用于微生物培养的器皿、接种的用具和培养基等进行灭菌；

3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；

4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

倒平板操作：

1、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

2、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；

3、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。

4、等待平板冷却凝固（大约需5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。平板划线操作：

1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；

2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；

3、将试管口通过火焰；

4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；

5、将试管口通过火焰，并塞上棉塞；

6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。

7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。

8、将平板倒置，放入培养箱中培养。

稀释操作：

1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。

2、用移液管吸取1ml培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。

3、从101倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。依次类推，直达完成最后一支试管的稀释。

注：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰的1～2cm处。

涂布平板操作：

1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；

2、取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；

3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；

4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。

注意：

1、将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

2、操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

平板划线法与稀释涂布平板法的区别

一、平板划线分离法

由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

用途：一般多用于从菌种的纯化；

优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；

缺点：不能计数；

二、稀释涂布平板法：

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。

优点：可以计数，可以观察菌落特征。

缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。