第14章 微生物的保存技术
第14章 微生物的保存技术
工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微
生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例
子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，
用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。
微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保
存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样
性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，
世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的
国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物
菌种保藏委员会（CCCCM）。
微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不
同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造
一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存
的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少
代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能
减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。
与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的
定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。
最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。
14.1 细菌的冻干保存法
14.1.1 一般概念
冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等
本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
170 遗传多样性研究的原理与方法
1981；Jong等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法 （Franks 1985；Berny等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长 的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106～107个细胞／ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速 将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（－60℃），再用真空泵除去这些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5℃的冰箱内。保存温度低（－3 0～－7 0℃）可以延长其活力。当微生物浓度较高时，生存率高，保存期也长。长期保存时，贮藏温度越低则越好。
在冻干前一般要加冷冻保护剂，这样可使细胞免除在冷冻初期因形成冰晶而造成的损害。ATCC常规用10％脱脂奶或12％蔗糖作为冷冻保护剂，而美国农业部（USDA）的农业研究服务机构的实验人员用牛或马血清作为微生物的冷冻保护剂（Halliday，Baker 1985）。在菌液中加入甘油和二甲亚砜（DMSO）也可防止冷冻中微生物的死亡，但实际操作中应根据不同微生物决定应用或不用防冻剂。
冻干细胞的复苏很简单。只要在室温下打开安瓿，将少量液体营养培养基加入细胞中，再将重新水合的细胞转移到含有益于生长的培养基的容器内即可。
用于冻干的实验设施成本为 2.5万美元（Colwell 1986），但准备冻干培养物的实际花销不高。用冻干法保存的细胞其长期活力很好，这种方法也许是目前所使用的微生物保存法中效果较好和最经济的方法（Halliday，Baker 1985）。但有的微生物不适宜应用该技术，如病原微生物在冻干过程中往往由于细胞飞溅而发生污染或感染事故，所以，对于某些病原微生物还必须使用其他的贮存方法保存。
14.1.2 材料
（1）冷冻保护液（肌醇血清营养肉汤）：
肌醇（Sigma，Poole，Dorset，UK） 6.67g
营养肉汤粉（Unipath，Basingstoke，Hampshire，UK） 0.825g
蒸馏水 33.3ml 将上述物质置于一个250ml的三角烧瓶内溶解和混合均匀后，用120℃高温灭菌15分钟，冷却后在无菌条件下加灭菌马血清（Advanced Protein Product Ltd．）100ml，混匀后，分装于 5ml 小瓶内。分装好的小瓶在30℃下培养2～3天，确定无菌后置－30℃下保存，临用前解冻。
（2）冷冻管：外径 16mm、长 36mm的硼硅中性玻璃小管（Schubert Seals，N1595，Gosport，Hampshire，UK），使用前要经160℃灭菌2小时。
（3）塞子（Type 20133A，Schubert Seals），使用前要加热除去水分（单层放入不锈钢托盘中，置入110℃ 热风干燥箱中加热2小时）。
（4）冻干仪（Edwards Freeze-dryer，Modulyo，Crawley，Sussex，UK）。
（5）灭菌塑料加样头（Alpha Laboratories，Ltd．，Eastleigh，Hamp-shire，UK）。
（6）铝制封口盖。
14．1．3 方法
（1）先用清洗剂（Flow Laboratories，Thame，Oxfordshire，UK，7倍无磷实验室用清洗剂）清洗玻璃珠，然后用0.1mol／dm3HCl中和玻璃珠上的碱性，反复用自来水冲洗至珠子
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的PH值与自来水的pH值相同为止，再用蒸馏水或去离子水清洗，最后置热风干燥箱内干燥。
（2）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在理想的条件下培养（一般用有螺纹盖的20ml管装的斜面培养基，将减少污染的机会）。
（3）无菌条件下加 2ml冷冻保护液到琼脂斜面内。
（4）将细菌与保护液充分混匀，这时的细菌浓度为108～1010个细胞／ml。
（5）将混匀后的细菌悬液移入剩余的3ml保护液内再次混匀（操作时要避免产生气溶胶，尤其是操作病原菌时）。
（6）吸0.5ml混匀液，加到预先标记好的冷冻管底部，操作时要特别小心，不要使液体漏到冷冻管外壁，以免造成污染。将塞子塞入冷冻管（但不要塞紧，以便在冷冻干燥仪中抽真空）。
（7）将冷冻管放入金属半圆支架上，置入－30℃冰箱内冷冻2小时，同时将充填物（玻璃珠，20～30粒／管）预冷至—30℃，以免将盛有冷冻管的架子移入时冷冻管内的内容物解冻。
（8）打开冻干仪的冷凝器开关，关闭冷凝器的排水阀。当冷凝器的温度降至－50℃时，迅速将充填装置和冷冻管放入冻干室。然后关闭空气阀抽真空。20分钟后要求真空室的压力到300Pa。要让冻干仪运行1～24小时，以便样品完全干燥。
（9）上述工作结束时，在真空条件下转动螺旋起重器，以终止运行。
（10）用高频火花检测器（Edwards High Vacuum）检测冷凝管干燥器和放置期间是否维持真空环境。冷凝器内发浅蓝色或紫色光表示完全真空，深紫色或不发光表示非完全真空。
（11）用铝盖密封冷冻管上的塞子。
（12）小心移去铝盖和拔出塞子，使细菌复苏。
（13）加约0.5ml营养肉汤到冷冻管内，与冻干的细菌混匀，再将该肉汤接种到肉汤培养基中，并在理想的条件下培养。
（14）移少量（0.1ml）解冻后的菌到营养琼脂板上，检测任何可能的污染。
14.2 病毒的超低温保存法
14.2.1 一般概念
大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（ 如植物的病原性真 菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。此法是将冻存 在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管 贮存在—150～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC常用一种由甘油（10％）、二甲 亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。
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超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存 的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
14.2.2 材料
病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
14.2.3 方法
（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm的热收缩塑料管。
（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。
（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。
（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。
（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。
（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。
14.3 低温保存法
14.3.1 材料
（1）培养基：
2号营养肉汤粉（Unipath） 2.5g
甘油（Sigma） 15ml
蒸馏水 85ml
将上述材料混匀后，分装在5ml瓶内，在121℃下灭菌15分钟。
（2）厌氧菌用 BGP培养基〔其中不加琼脂，而加 15％（体积比）甘油〕：
胰蛋白胨（Unipath） 1.0g
氯化钠 0.5g
牛肉提取物 0.3g
酵母提取物 0.5g
盐酸半胱氨酸 0.04g
葡萄糖 0.1g
磷酸氢二钠 0.4g
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甘油 15ml
蒸馏水 85ml
将上述材料混匀后，分装在 10ml瓶内，在 121℃下消毒 15分钟。以上两种培养基使用前均能在4℃环境中存放几个月。
（3）玻璃珠：将直径为2mm的玻璃珠（Creative Beadcraft Ltd；mersham，Buckinghamshire，UK）按上述冻干法中的清洗法清洗。
（4）冷冻管：在2ml有盖冷冻管（Nunc，Paisley，Scotland）内存放20～30粒清洗好的玻璃珠，盖好盖后置121℃下消毒15分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。
此外，将超低温冰箱预先冷却到—70℃，灭菌塑料加样头。
14.3.2 方法
（1）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在适宜细菌生长的条件下培养细菌。
（2）无菌条件下加2ml细菌悬浮液至营养肉汤中。
（3）用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀（细菌的最终浓度为108～1010 个细胞／ml）。
（4）按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内，反复吹打几次，使珠子内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。
（5）吸去冷冻管内多余的液体。
（6）将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然后将架子放入—70℃的冰柜内。
（7）从冰柜中取出一支冷冻管，在无菌条件下打开，用灭菌镊子从管中取出一粒珠子，然后迅速将管子放回冰柜，以免管子内的其余珠子融解。
（8）直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中，在适当的条件下培养。
14.4 传代培养保存法
尽管与上述方法相比，用传代培养保存法保存微生物的时间较短，且会使微生物在反复 传代和适应的过程中发生变异，但由于其简便易行，加之一些不耐冷冻和干燥处理的微生物 还需要用该法保存，所以，传代培养保存法是所有使用微生物的单位都要采用的基本保存法。目前必须依靠传代培养保存的微生物仍为数众多。传代培养保存法主要是保存生活态的微生 物，它又分为连续用培养基传代和连续用活宿主传代。斜面保存法和矿物油保存法是传代培 养保存的两种最常用的方法。
14.4.1 斜面保存法
斜面保存法是传代培养保存法的具体方法，其优点是简便，易于推广。但用该法保存微 生物的时间不太长。由于在具体操作时需要多次传代，加之斜面培养基中又保持了一定的营 养条件，因此，用这种方法保存的微生物还易产生变异。
使用该方法保存微生物时，可将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，培养至菌种充分 生长后，放4℃冰箱中保存。每隔一定时间进行接种培养后再行保存，如此连续不断。一般细菌、酵母、放线菌和霉菌均可用此法保存。
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14.4.2 矿物油保存法
矿物油保存法是传代培养保存法的变相方法，也较简单，且保存时间可达1年以上。
矿物油保存法，即是将接种在斜面培养基的细菌经过培养后，加入灭菌的石蜡油并浸盖 住整个斜面（ 覆盖的深度为2cm ），使之与空气隔绝，以降低微生物的代谢率（ Gherna 1981），再将浸盖有石蜡油的斜面培养菌种置于约4℃或室温保存即可。复苏的方法与常规再培养的方法类似。尽管这种方法可使保存的细菌3年内不死，但不适于微生物的长期保存，因为每隔几年就必须复苏、鉴定和再贮存，从而耗费人力和物力。霉菌、酵母菌和放线菌可 用该法保存，一些不适于冷冻干燥的微生物用该法保存也有效。
14.5 砂土保存法
产芽孢的细菌或霉菌和放线菌的孢子均可用此法保存。具体操作如下：
用60目和120目筛除去砂和黄土中的大颗粒，分别用10％盐酸浸泡2～4小时，再用水 洗至中性，烘干后按2份砂:1份土的比例混匀，装入小试管中高压灭菌（至少3次），并作 无菌检查，确认无菌后备用。
在培养好的斜面菌种中加入无菌水，做成细菌芽孢或霉菌和放线菌孢子悬液后，取出一 定量加入上述处理好的砂土管中，置真空干燥器内，用真空泵抽干后再将砂土管置入盛有氯 化钙干燥剂的容器内，密封后低温保藏即可。芽孢杆菌、产孢子的霉菌以及放线菌可用该法 保藏 1～10年。
少数微生物，如放线菌和一些生活在土壤中的产芽孢细菌能抵抗正常的冷冻操作，并保 持活力和基因的稳定性。以0～－20℃保存在营养培养基中的培养物，其细胞可存活2年， 但一般认为这种细胞会被所形成的冰晶伤害。对某些短期保存的微生物而言，低温保存不失 为一种廉价而有用的方法。室温干燥可使大量的微生物死亡（Gherna 1981），但有少数细菌 能够抵抗脱水干燥并存活相当长的时间，产芽孢的细菌特别适用于这种贮存方法。干燥保存 法通常将微生物细胞转种在一个灭菌的固体培养基上，然后在真空中脱水。土壤、纸张或陶 制有孔培养基（Ceramic bead medium）常用于此类目的。还可先将细胞悬浮在明胶液内，再将这种明胶滴在真空中干燥。一旦脱水，细胞必须保存在干燥器内。如果再放到冰箱内保存，细菌的活力会保持得更长久些。用这种方法贮存的样品复苏后，要用营养培养基再水合和再次培养。该法常用于一些重要细菌属（如根瘤菌）的保存。
微生物采样方案
微生物采样方案(总1页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
微生物限量采样方案 采样方案分为二级和三级方案，二级采样方案设有n、c、m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数 c：最大可允许超出m值的样品数 m：微生物指标可接受水平的限量值 M：微生物指标的最高安全限量值 例：n=5,c=2,m=100cfu/g,M=1000cfu/g,即从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检测结果均小于或等于m值（≤100cfu/g），则这种情况是允许的，若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100cfu/g≤X≤1000cfu/g），则这种情况也是允许的；若有3个及以上样品的检验结果位于m和M之间，则这种情况是不允许的；若有任一样品的检验结果大于M（>1000cfu/g），则这种情况也是不允许的。 0/25g a，标准限量，就是每25g样品不得检出。a通常为5次。 挥发性盐基氮：代表动物蛋白受微生物的作用程度，是动物蛋白新鲜度的代表。 MPN：基于泊松分布的一种间接计数方法，most probable number GB 7718,直接向消费者提供的预包装食品标签，标示应包括食品名称、配料表、净含量和规格。生产者和经销商的名称、地址和联系方式、生产日期和保质期、贮存条件、食品生产许可证编号、产品标准代号及其他需要标识的内容。 ADI：每日允许摄入量 acceptable daily intake。 净含量字体高度≥4mm。 下列预包装食品豁免强制标示营养标签 1、生鲜食品如包装的生肉、生鱼、生蔬菜和水果、禽蛋等 2、乙醇含量≥%的饮料酒类 3、包装总面积≤100cm3或最大表面面积≤20cm3的食品 4、现制现售的食品 5、包装的饮用水 6、每日食用量≤10g或10mL的预包装食品 7、其他法律法规标准规定可以不标识营养标签的预包装食品
微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡
公共用品微生物的采样方法
公共用品微生物的采样方法： 涂抹是公共用品微生物样品采集的常用方法之一 样品包括（六类不同公共用品的采样）：茶具、餐具；毛巾和枕巾、枕套；床单和被罩 等卧具；脸盆、脚盆和浴盆；拖鞋、理发用具。 采样所需设备：灭菌试管（内装10ml生理盐水）、100ml无菌烧瓶（内装50ml生理盐 水）、250ml无菌烧瓶（内装125ml生理盐水）、无菌棉拭子、灭菌剪刀、灭菌5cm X 5cm规格板、酒精灯、酒精棉球、工作服/白大衣、口罩、帽子、记号笔、灭菌镊子、采样记录单 采集样品前的准备： 1 穿好白大衣、戴好帽子及口罩 2 点燃酒精灯 3手消毒 一茶（餐）具微生物的采样方法 1 打开试管盖，用酒精灯烧灼试管口 2 随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具或餐具，用灭菌生理盐水湿润棉拭子，在茶具或餐具与口唇接触处，1-1.5cm高度的内外缘各涂抹一周 3 用灭菌剪刀，剪去棉签与手接触部分，将棉拭子放入10ml生理盐水中 4 用酒精灯烧灼试管口，盖好试管盖 5 试管上标明样品编号 二毛巾、枕巾（套）微生物的采样方法 1 打开试管盖，用酒精灯烧灼试管口 2 随机抽取清洗消毒后准备使用的毛巾、枕巾（套），用灭菌生理盐水湿润棉拭子，在毛巾、枕巾（套）对折后两面的中央，各25cm2面积上，在灭菌规格板里用力均匀涂抹5次 3 用灭菌剪刀，剪去棉签与手接触部分，将棉拭子放入10ml生理盐水中 4 用酒精灯烧灼试管口，盖好试管盖 5 试管上标明样品编号 三床单和被罩等卧具微生物的采样方法 1 打开试管盖，用酒精灯烧灼试管口 2 随机抽取清洗消毒后准备使用的床单和被罩等用品，用灭菌生理盐水湿润棉拭子，分别在床单或被罩两端的中间，25cm2面积处以及床单或被罩中央部位25cm2面积上，在灭菌规格板里用力均匀涂抹5次 3 用灭菌剪刀，剪去棉签与手接触部分，将棉拭子放入10ml生理盐水中 4 用酒精灯烧灼试管口，盖好试管盖
微生物菌种保藏方法
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
微生物防腐以及食品保藏性
毕业论文(设计)任务书 课题名称生物杀菌素在食品防腐中的应用研究进展 所在系食品系 专业班级发检04-1 学号0 姓名裴蕾 年月日至年月日共周 指导教师签字 系主任签 字 年月日 一、毕业论文（设计）的内容 文章阐述生物杀菌素的基本概念及特点，生物杀菌素在食品防腐中的应用研究概况, 并对生物杀菌素的发展趋势进行展望。 二、毕业论文（设计）的要求与数据 收集生物杀菌素相关资料，论文书写有明确的中心，论述充分并有一定的逻辑性，重点突出，内容应充实完整，格式规范。 三、毕业论文（设计）应完成的工作 1. 文献浏览 2. 确定提纲 3. 撰写初稿 4. 修改定稿
查阅中国期刊网、万方数据库、超星数据库中的相关文献，并参考其他网络资源和图书等纸质资源。 摘要:生物防腐剂是一类新型的安全高效的天然防腐剂，该文阐述生物杀菌素的特点及在食品防腐中应用研究，并介绍了几种主要的生物防腐剂在食品工业中生物杀菌素发展趋势进行展望。 关键词:生物杀菌素;生物防腐剂；食品防腐;食品安全；应用；动向Abstraet:Biological preservation have the natural secure and highly efficient natures. The character and the application of microbial to food preservation are introduced,and introduction about the application of main kinds of biological preservatives and
微生物无菌取样方法
微生物无菌取样方法文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
在讨论无菌取样的原因和采集方法之前，必须要理解“无菌的”的这一术语，“无菌”一般用于取样中，意味着取样过程中，避免操作引起污染。一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。一、包装无菌取样的工具： 拥有正确的采取产品或加工过程的无菌取样器械工具是至关重要的的。除非使用合适的采集工具，否则样品的完整性会被怀疑，甚至样品毫无意义。为了避免没有合适的取样工具，建议建立一个无菌取样的分析清单，来收集取样工具。如果可能盛样品的容器在最初进入加工区之前应当被预先标识，像样品号、取样日期、取样人等。这样可以使在不同的工厂条件下的样品取样更为方便一些。附加样品号码一般在样品采集中被正式确定下来，因此不用预先标明。 人员的工具设施，像工作服、发网或消毒处理过的清洁的鞋靴必须具备有助于证明采集者没有污染到食物产品或样品。 二、采样前准备 1. 干冰或冰袋：如果使样品在贮运过程中保持冷却，一些种类的制冷剂是必需的。 检查观看干冰袋子是否有接触，如果泄漏可能污染样品，你也可以用湿冰，湿冰可以由工厂提供，然而取样前必须清楚这一点，如果想保持样品冷冻，干冰应在检验前获得。
2. 灭菌容器及器具：无菌采样袋，袋子必须购买灭菌的，使用时只需撕掉封头，用 提供的地方法张开袋子，将样品放入，然后将袋子顶端卷起，并封口；必要时，取样用镊子，剪子等要灭菌处理。 3. 无菌手套：灭菌手套在采样中并非必须启用，如果一个产品在样品收集过程中必 须被接触，那么最好让工人来做（加工处理产品的工人），将样品放入收集容器中，既然工人在生产过程中处理接触产品，那么我们就不能认为他们对产品又有附加的污染。当用手套时必须用一种避免污染的方式戴上，手套的大小必须适合工作的需要。 4. 75%酒精棉球以及75%酒精喷壶，一次性帽子，口罩以及白大褂。 当采集无菌样品时，一条最重要的规则是：千万别污染样品。 三、采样 抽样必须遵循无菌操作程序，抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当高压灭菌，防止一切可能的外来污染。容器必需清洁、干燥、防漏、广口、灭菌，大小适合盛放检样。抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。常见的抽样方法有： 1．直接食用的小包装食品： 尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。 2．桶装或大容器包装的液体食品： （1）．抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；
微生物采样方案
微生物限量采样方案 采样方案分为二级和三级方案，二级采样方案设有n、c、m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数 c：最大可允许超出m值的样品数 m：微生物指标可接受水平的限量值 M：微生物指标的最高安全限量值 例：n=5,c=2,m=100cfu/g,M=1000cfu/g,即从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检测结果均小于或等于m值（≤100cfu/g），则这种情况是允许的，若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100cfu/g≤X≤1000cfu/g），则这种情况也是允许的；若有3个及以上样品的检验结果位于m和M之间，则这种情况是不允许的；若有任一样品的检验结果大于M（>1000cfu/g），则这种情况也是不允许的。 0/25g a，标准限量，就是每25g样品不得检出。a通常为5次。 挥发性盐基氮：代表动物蛋白受微生物的作用程度，是动物蛋白新鲜度的代表。 MPN：基于泊松分布的一种间接计数方法，most probable number GB 7718,直接向消费者提供的预包装食品标签，标示应包括食品名称、配料表、净含量和规格。生产者和经销商的名称、地址和联系方式、生产日期和保质期、贮存条件、食品生产许可证编号、产品标准代号及其他需要标识的内容。 ADI：每日允许摄入量 acceptable daily intake。 净含量字体高度≥4mm。 下列预包装食品豁免强制标示营养标签 1、生鲜食品如包装的生肉、生鱼、生蔬菜和水果、禽蛋等 2、乙醇含量≥0.5%的饮料酒类 3、包装总面积≤100cm3或最大表面面积≤20cm3的食品 4、现制现售的食品 5、包装的饮用水
环境微生物检测——采样方法 剧本
《环境微生物检测——采样方法》场景剧本题目：环境微生物检测——采样方法 主题曲、插曲待定 影片主要角色： 男1号梁总，25岁，业务主管（西装革履） 男或女2号小李，20岁，采样组组长（休闲） 女3号小黄，20岁，前台靓女（时尚的靓女） 男3号** 客户，25岁，（带领的衣服）（演成搞笑的土豪人物） 男或女4号：小王，19岁，某学校的顶岗实习生 第一场： 场景：公司前台（汇标公司的前台，甲在埋头做报表，乙在打电话和客户沟通，前台靓女在接水） 时间：上午 人物：前台靓女、客户，前台靓女以及同事两三个。 从门外来了一个大约25岁男性在张望。前台靓女赶紧走出来打开门。 前台靓女：您好。 客户：这里是汇标检测公司吗？ 前台靓女：是啊，有什么可以帮到您？ 客户：我是来自大中国建筑集团有限公司的××。最近我们一个大楼要竣工验收，需要对水质进行检测，你们能做吗？我们不差钱。 前台靓女指引客户坐下，倒一杯水。 前台靓女：这些业务我们做过很多。我们是第三方检测公司，有对该项目进行检测的资质，严格按照国家标准做的。 客户：对水质都监测什么呀？ 前台靓女：《建筑给水排水及采暖工程施工质量验收规范》GB50242-2002中明文规定：
“4.2.3 生活给水系统管道在交付使用前必须冲洗和消毒，并经有关部门取样检验，符合国家《生活饮用水标准检验方法》方可使用。 生活饮用水标准检验方法GB/T5750 – 2006，具体包括13个分项。包括水样采集和保存、感官性状和物理指标、有机物指标、消毒副产品指标、金属指标和微生物指标等等。 对建筑工程竣工验收水质检测，我们一般取pH、色度、浑浊度、臭味、肉眼可见物、总游离氯、耗氧量、菌落总数、大肠菌群等指标。 客户：听起来很专业，好！我信赖你们公司。 前台靓女：那麻烦您去我们主管办公室对签订合同有关事宜进行协商。 第二场： 场景：办公室 时间：某上午 人物：业务主管梁总、采样组组长小李 梁总：小李，这里刚接和大中国建筑集团有限公司签了一个合同。这可是一个大客户，你们要认真对待。你赶紧安排人过去采样吧。 小李：好的。我会尽快安排人过去采样。您放心吧。 第三场： 场景：公司走廊 时间：某上午 人物：采样组组长小李，实习生小王 小李：小王，我们明天要去广州海珠区琶洲那边对一个大楼的自来水进行采样，你准备一下。 小王：好的。我会马上去做。 第四场： 场景：实验室 时间：任意 人物：小李
菌种保存和微生物常识
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。
方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项： 1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。 常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。 煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min， 超高温杀菌:135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点：保持食品价值和营养
微生物取样方法
微生物取样方法 举例一： 一、空气采样及检验方法 1培养基：普通营养琼脂平板，按中条配制 2采样（空气沉降法） 布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。 采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。 采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。 3培养：于37℃培养24小时。 4检测频率：每周 空气质量标准： 生车间、熟车间、成品车间：低于100个 半成品库、成品库：低于10个 二、设备的采样与检验方法 根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。 1采样方法 涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面） 取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面） 将无菌规格纸（5×5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。 2检验方法 细菌总数的检验 将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37℃培养24小时后计菌落数。 结果计算 表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数/30×2 致病菌的检验 沙门氏菌，参照进行 金黄色葡球菌，参照进行 4.检验合格标准：细菌总数10－100个∕cm2， 5.关键点：细菌总数≤10个∕cm2 一般区域：细菌总数≤100个∕cm2 三、人员手表面细菌污染情况的检验 1. 采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。 2. 检验方法：同工器具表面细菌总数检验方法。 3. 结果计算：每只手表面的细菌总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平均数×样液稀释倍数 四、消毒液药效的微生物学鉴定法
第14章 微生物的保存技术
第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
微生物采样方案
微生物限量采样方案 采样方案分为二级与三级方案,二级采样方案设有ｎ、c、m值,三级采样方案设有ｎ、c、ｍ与M值。 ｎ:同一批次产品应采集的样品件数 c:最大可允许超出m值的样品数 m:微生物指标可接受水平的限量值 M:微生物指标的最高安全限量值 例:ｎ=5,c=2,m=100ｃfu/g,M＝1０00cｆu/ｇ,即从一批产品中采集５个样品,若５个样品的检测结果均小于或等于m值(≤１00ｃｆｕ/ｇ),则这种情况就是允许的,若≤２个样品的结果(Ｘ)位于m值与M值之间(１０0cfｕ/ｇ≤X≤1０００cfu/g),则这种情况也就是允许的;若有3个及以上样品的检验结果位于m与M之间,则这种情况就是不允许的;若有任一样品的检验结果大于M(>1000cfｕ/g),则这种情况也就是不允许的。 0/25g a,标准限量,就就是每２5g样品不得检出。a通常为５次。 挥发性盐基氮:代表动物蛋白受微生物的作用程度,就是动物蛋白新鲜度的代表。 MPN:基于泊松分布的一种间接计数方法,mosｔ pｒobａble number GB 77１8,直接向消费者提供的预包装食品标签,标示应包括食品名称、配料表、净含量与规格。生产者与经销商的名称、地址与联系方式、生产日期与保质期、贮存条件、食品生产许可证编号、产品标准代号及其她需要标识的内容。 ADI:每日允许摄入量 aｃｃeptable daｉlｙ iｎtaｋｅ。 净含量字体高度≥４mm。 下列预包装食品豁免强制标示营养标签 1、生鲜食品如包装的生肉、生鱼、生蔬菜与水果、禽蛋等 2、乙醇含量≥0.５％的饮料酒类 3、包装总面积≤100cm3或最大表面面积≤２0cm3的食品 4、现制现售的食品 5、包装的饮用水
微生物与食品腐败变质
第八章微生物与食品腐败变质 第一节食品的微生物污染及其控制 一、微生物污染食品的来源和途径 （一）食品污染的种类： 生物污染：微生物、寄生虫及虫卵、昆虫 化学污染：农药、工业三废、添加剂、包装材料 物理污染：放射性污染 （二）微生物污染食品的途径： 水的污染：水是作为媒介使微生物污染食品的 土壤的污染：加工的原料在采收时携带了微生物引的 空气的污染：食品暴露在空气中被微生物污染 人为的污染：人接触食品、工作衣帽不清洁等 食品加工用设备、容器、工具的污染：运输工具、生产 二、控制微生物污染的措施 控制食品因微生物的污染而造成的腐败变质，首先应掐断微生物的污染源，其次是抑制微生物的生长繁殖。具体要求如下：
第二节微生物引起食品腐败变质的原理 ?食品中碳水化合物的分解 ?食品中蛋白质的分解 ?食品中脂肪的分解 ?有害物质的形成 第三节微生物引起食品腐败变质的环境条件 一、食品基质条件 食品的营养成分食品的水分食品中的氢离子浓度 1.食品的营养成分 食品的营养成分与微生物生长的适应性 食品的主要营养成分是蛋白质、碳水化合物和脂肪。不同的微生物对它们的利用能力是不同的。 分解蛋白质的微生物： 细菌：芽孢菌属、假单胞菌属 霉菌：毛霉属、根霉属等 分解碳水化合物的微生物：
细菌：芽孢杆菌属 霉菌：曲霉属、根霉属等 分解脂肪的微生物： 细菌：荧光假单胞菌的分解能力较强 酵母：解脂假丝酵母具有一定的脂肪分解能力 霉菌：大部分霉菌具有一定的脂肪分解能力。 2.食品的水分 微生物生长需要水分，水分在某些极限以下时微生物则无法生长。乳粉含水量低于5%时，在密封状态下，不会引起微生物的生长发育。 微生物对水的需求中，影响最大的是水的可利用性，常用水分活度Aw表示 水分活性值（Aw）的概念：食品在密闭容器内的水蒸气压与在相同温度小纯水蒸汽压之比值，食品的Aw值范围为：0≦ Aw≦1 不同类群微生物生长的Aw值 微生物生长Aw值的可变性 3.食品中的氢离子浓度 每一种微生物生长繁殖都有一定的pH值范围：超过该范围，生长就会受到抑制，甚至导致死亡。大部分细菌的生长最适pH值为5.6~7.5。乳酸菌、霉菌酵母在微酸性条件下生长。大肠菌、蛋白分解菌在碱性环境中易生长，酸性条件下则受到抑制。 根据食品经代谢后产生的矿物质残渣或灰分呈酸性、碱性或中性反应可以将食品分为： 酸性食品与非酸性食品：pH值在4.5以上者为非酸性食品（动物性食品和大多数蔬菜）； pH 值在4.5以下者为酸性食品（水果和少数蔬菜） 微生物生长与食品pH值的关系：非酸性食品适宜细菌生长；酸性食品中，酵菌、霉菌和少数耐酸细菌（如大肠菌群）可生长。 二、食品的外界环境条件 1.温度
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 一、斜面冰箱保藏法 一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 二、沙土管保藏法
适合于产孢子或芽孢的微生物。 首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。一般沙80目，土80一100目。 其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。 保存期1年左右。 三、菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。 操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。 四、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年 五、真空冷冻干燥保藏法 是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。所以，都已较普遍地应用。 基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。
微生物涂抹方法及标准[1]1
工作台（机械器具）表面与工人手表面采样与测试方法 样品采集： (1)取样频率： a)车间转换不同卫生要求的产品时，在加工前进行擦拭检验，以便了解车 间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后，车间生产前，进行全面擦拭检验。 c)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验 不合格点，整改后再进行擦拭检验。 d)实验新产品，按客户规定擦拭频率擦拭检验。 e)对工作表面消毒产生怀疑时，进行擦拭检验。 f)正常生产状态的擦拭，每周一次。 （2）采样方法： a) 工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取 与食品直接接触或有一定影响的表面）取25cm2的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。 b) 工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指 尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL 灭菌生理盐水的采样管内送检。 （3）采样注意事项： 擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间 细菌·大肠菌群的检测培养: 样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为1：10稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取1ml 1：10样液加9ml无菌生理盐水中，混匀，此液为1：100稀释液。 细菌总数： （1）以无菌操作，选择1～2个稀释度各取1ml样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样），将已融化冷至45℃左右的平板计数
琼脂培养基倾入平皿，每皿约15ml，充分混合。 （2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置36℃±1℃培养48 h后计数。 （3）结果报告：报告每cm2食品接触面中或每只手的菌落数 （4）细菌菌落总数检测 将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1m L样液，放人灭菌平皿内，倾注营 养琼脂培养基.每个样品平行接种两块平皿，置35℃士2'C培养48 h，计数平板上细菌菌落数。 Y2=A/SX10 Y3=AX10 式中: Y2一工作台表面细菌菌落总数，cfu/cm2; A 一平板上平均细菌菌落数; S 一采样面积，cmz; Y3 一工人手表面细菌菌落总数,cfu/只手。 4.操作图解： 1.手内侧涂抹 2.手外侧涂抹
食品微生物学经典试题及答案.
食品微生物学经典试题及答案 单项选择题: 1、下列是原核微生物的是(细菌。 2、第一个发现微生物的是(列文虎克 3、微生物学发展的第二时期,是(巴斯德、科赫奠定了基础。 4、荚膜的主要成分是(糖类。 5、测量细菌的大小用(微米。 6、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 7、培养酵母用(麦芽糖琼脂。 8、一般培养基灭菌的条件是(121°C 15分。 9、放线菌的菌落特征是(干燥、多皱。 10、酵母的无性繁殖主要是(芽殖。 11、霉菌的主要繁殖方式是 (孢子生殖。 12、曲霉孢子是 (外生孢子。 13、霉菌菌落比酵母的要 (大。 14、哪些对病毒的描述是错的(对抗生素敏感。 15、病毒具有(一种核酸。 16、噬菌体可用于(诊断和治疗。 17、能够使细菌和放线菌裂解的是 (裂性噬菌体。 18、可用于细菌鉴定和分型的是 (噬菌体。 19、细菌总数测定的是(全部活细菌数。 20、大肠菌群数量测定的(100 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 21、测定大肠菌群数量的方法,选用的是(37 °C 22、培养酵母菌的温度常选(28 °C 23、配制固体培养基加琼脂量是(2 %。 24、完整测定大肠菌群时间是(72 小时。 25、肉毒杆菌释放的是(外毒素。 26、对面包黏丝病有抑制作用的是(丙酸钙 27、果汁,果酒一般可用(亚硫酸钠防腐。 28、饮料常用防腐剂是(苯甲酸钠。 29、最常用的食品杀菌方法是(巴氏杀菌。 30、同样百分浓度蔗糖的渗透性比食盐(差 10% 。 31、 GMP 是(良好生产规范。 32、属于厌氧微生物的是(肉毒杆菌。
33、酒精消毒的最佳浓度是(75 %。 34、下列是非细胞结构微生物的是(病毒。 35、第一个用固体培养基的是(科赫。 36、芽孢抗热的主要成分是(DPA 。 37、测量细菌的大小用(微米。 38、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 39、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 40、酵母菌的菌落特征是(粘稠、较大。 41、病毒的繁殖主要是(孢子生殖。 42、霉菌的主要繁殖方式是(孢子生殖。 43、青霉孢子是(外生孢子。 44、哪些对病毒的描述是错的(个体极小。 45、病毒具有(二种核酸。 46、噬菌体可用于(鉴定细菌。 47、能够使细菌和放线菌裂解的是(裂性噬菌体。 48、可用于细菌鉴定和分型的是(假根。 49、细菌总数测定的是(醋酸菌。 50、大肠菌群数量测定的是每(1 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 51、制作半固体培养基时加琼脂量是(5 %。 52、完整的大肠菌群测定时间是(一天小时。 53、金黄色葡萄球菌释放的是(外毒素。 54、对面包黏丝病有抑制作用的是(苯甲酸钠 55、果汁,果酒一般可用(山梨酸钾防腐。 56、微生物在生物世界分类系统中占有(4 界。 57、列是原核微生物的是(放线菌。 58、第一个使用琼脂的科学家是(科赫。 59、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 60、测量细菌的大小用(微米。 61、芽孢能够抵抗不良环境的主要成分是(DPA 62、荚膜的主要成分是(多糖。
微生物的保存技术
第14 章微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA 重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30 年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC 在1985 年第16 版《细菌、噬菌体和rDNA 载体目录册》及1987 年第17 版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000 株细菌、噬菌体和rDNA 载体及 21 000 株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna 等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜 170 遗传多样性研究的原理与方法 1981；Jong 等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法 （Franks 1985；Berny 等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长 的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106～107 个细胞／ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速 将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（－60℃），再用真空泵除去这 些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5℃的冰箱内。保存温度低（－3 0～－7 0℃）可以延长其活力。当微生物浓度较